抗禽白血病的研究進展

王樂成，余春林，王 珍，楊朝武，蘭 茜，王海威

（1.重慶市畜牧科學院，重慶 402460；2.四川省畜牧科學研究院，四川成都 610066；3.西南大學，重慶 400715）

禽白血?。ˋvian leukemia，AL）是禽白血病病毒（Avian leukemia virus，ALV）感染引起的一類高傳染性疾病的統稱[1]。ALV 的感染通常會造成組織不同程度的癌變以及機體的免疫抑制[2,3]。根據ALV 囊膜蛋白的抗原差異、宿主范圍差異、基因組結構特征將ALV 分為了A～K 11 個亞群。在這11 個亞群中，ALV-A、ALV-B、ALV-C、ALV-D、ALV-E、ALV-J、ALV-K 是感染雞的亞群，其中ALV-E 是內源性ALV，ALV-J 是我國目前主要流行的亞群，特別是在我國地方品種雞上[4-6]。幾乎每只雞的基因組上都有ALV-E 基因組的片段或全部，ALV-E 在基因組上的存在被認為是某種外源性ALV 感染后在基因組上的殘留[7]。ALV-E 的致病性很弱，并且只有極少部分位點具有完整的ALV-E 基因組片段，所以相對而言ALV-E 的流行情況并不嚴重，但ALV-E 對外源ALV 的感染影響較大。ALV 的主要傳播方式是水平傳播和垂直傳播，由于ALV-E的存在，它還有一種較為特殊的傳播方式——遺傳性傳播。

ALV 屬于逆轉錄病毒科正反轉錄病毒亞科α反轉錄病毒屬成員，具有禽C 型反轉錄病毒的特征。ALV 粒子大體呈球形，直徑80～120nm，平均直徑90nm。從外向內分別是外膜、中間膜和內部中心電子密集核。ALV 基因組的結構和其他反轉錄病毒類似，從5' 端至3' 端分別是：5' 端LTR、gag、pol、env、3'端LTR。LTR 具有啟動子和增強子活性，ALV 引起腫瘤的主要原因是因為ALV 插入到調控細胞增殖分裂相關的基因附近，LTR 讓這些基因表達增加，進而導致細胞異常增殖引起癌變。Gag 基因主要編碼ALV 的衣殼蛋白，gag編碼的p27 蛋白由于其在亞群內的高保守性以及亞群間的高特異性被用于開發檢測ALV 的ELISA 試劑盒；pol基因主要編碼病毒的整合酶和反轉錄酶，是病毒整合到宿主基因組的關鍵基因；env基因編碼病毒的囊膜蛋白，囊膜蛋白不僅是ALV 分類的重要依據，其編碼的gp85 表面蛋白還是介導病毒進入細胞的關鍵位點[5]。目前關于ALV 抗病育種的相關研究大多是圍繞阻止ALV 病毒進入宿主細胞進行的。

通過基因編輯技術研究抗ALV 雞，或許是防治ALV 感染的有效手段。自從雞被人類馴化以來，人類對其產蛋量、產肉量、蛋品質、肉品質等進行了專門的遺傳選擇，使這些性狀有了較大改善。由于人們對抗病性狀的認識時間相對較短，并且抗病性狀屬于域性狀，遺傳機制復雜，所以導致了針對某些疾病的抗病育種工作難以短時間內見到成效。本文從ALV 受體、內源性ALV（ALV-E）對外源性ALV 感染的影響以及近些年通過高通量測序技術找到的與抗ALV 感染相關基因入手，對ALV 抗病育種進行了綜述以期為今后的ALV 抗病育種工作帶來一定參考。

1 抗禽白血病相關研究綜述

1.1 ALV 受體研究進展

禽白血病病毒致病的前提是ALV 進入到細胞內進行繁殖，ALV 能非特異性的吸附到細胞膜上，但是ALV 能否進入細胞取決于細胞膜上ALV 的特異性受體。ALV 囊膜蛋白（env）與特異性受體結合后，引起受體構象變化，進而導致病毒與宿主細胞膜的融合。不同的ALV 亞群進入細胞依賴的受體不同，感染雞的ALV 亞群的受體所對應的基因分別是Tva（ALV-A）、Tvb（ALV-B）、Tvc（ALV-C）、chNHE1（ALV-J）。

1.1.1 ALV-A 受體研究進展

A 亞型禽白血病病毒的受體基因編碼的蛋白屬于低密度脂蛋白受體家族，介導“鈷轉運蛋白-維生素B12”復合體的吸收[8]。編碼該受體蛋白的基因在某些位點發生突變會導致宿主細胞對ALV-A 產生抗性，自然界中普遍存在對ALV-A有抗性的雞。目前已經發現Tva 基因存在6 個自然的抗性位點，分別是Tvar1、Tvar2、Tvar3、Tvar4、Tvar5和Tvar6。Tvar1是堿基序列第619 位的C 突變為G 造成[9]；Tvar2是堿基序列305～306 位間插入CTCG 造 成[10]；Tvar3、Tvar4、Tvar5和Tvar6是Tva第1 個內含子不同位點的缺失突變導致終止密碼子TGA 提早出現，干擾了mRNA 的剪切[11]，這些突變最終導致了缺陷型Tva 蛋白產生。在對Tva 蛋白的研究中發現，其49～71 位的殘基是介導ALV-A 進入的最小功能結構域[12]。其中，L55和W69 是介導ALV-A 進入宿主細胞的關鍵殘基，把L55 和W69取代后，消除了Tva 與ALV-A 囊膜蛋白間的相互作用，使Tva 無法識別ALV-A[12]。最新研究發現，我國特有的ALV-K 也通過Tva 受體進入細胞，在DF1 細胞中將Tva 基因敲除后，DF1 細胞表現出了明顯的ALV-K 抗性[13]。然而目前并沒有關于ALV-K 的自然抗性位點的報道，但Li 等[14]研究指出，介導ALV-K 進入細胞的關鍵Tva 殘 基是E53、L55、H59 和G70。

1.1.2 ALV-B/D/E 受體研究進展

B/D/E 亞型禽白血病病毒的受體基因編碼的蛋白屬于腫瘤壞死因子受體（Tumor necrosis factor receptor,TNFR）家族，但是目前并不了解雞Tvb 蛋白的具體功能。根據TNFR 家族特性猜測雞Tvb 蛋白是一種功能性死亡受體，并發現Tvb蛋白的胞質側含有“Death Domain”，可以通過激活caspase 途徑促進細胞凋亡[15]。Brojatch 等[16]發現，當用ALV-B 對雞胚成纖維細胞進行攻毒時雞胚成纖維細胞會發生死亡。Tvb 蛋白在細胞外側含有3 個與ALV-B/D/E 感染相關的半胱氨酸富集結構域（CRD1、CRD2、CRD3）。目前鑒定到了7 個經典的與ALV-B/D/E 抗性相關的等位基因，分別是Tvbs1、Tvbs3、Tvbr、Tvbr2、Tvbr3、Tvbr4和Tvbr5。Tvbs1編碼的受體蛋白對ALV-B/D/E 易感，Tvbs3編碼的受體蛋白對ALV-B/D 易感，而對ALV-E 具有抗性。Tvbs1和Tvbs3的主要區別在于CRD2 結構域中的第62 位殘基，其中Tvbs1是Cys，而Tvbs3是Ser[17,18]。這種突變改變了CRD2 的結構，導致宿主對ALV-E產生抗性。Tvbr編碼的蛋白對ALV-B/D/E 具有抗性，Tvbr抗性的產生是因為起始密碼子下游第172 位的“C”被“T”取代，導致終止密碼子提早出現，使CRD1 結構域構象改變[18]。Tvbr2對ALV-B/E 抗性的產生是因為CDR3 結構域第125位半胱氨酸被絲氨酸取代導致[19]。Tvbr3對ALV-B/D/E 抗性的產生是因為起始密碼子下游第298 位的“C”被“T”取代，導致終止密碼子提早出現，產生了截斷的Tvb 蛋白[20]。據李昕鍵[21]報道，Tvbr4和Tvbr5對ALV-B/D/E 的抗性是因為插入突變所致，Tvbr4是在Tvb 基因組第3667～3668 位插入了“AG”，致使CRD2 結構域從第98 位氨基酸出現移碼，并在CRD3 結構域的第131 位氨基酸終止；Tvbr5是在Tvb 基因組第3736-3737 位間插入“A”，導致CRD3 結構域第190 位氨基酸提前出現終止密碼。

1.1.3 ALV-C 受體研究進展

相對其他幾個亞群，與ALV-C 受體相關的研究較少。Tvc 編碼的蛋白屬于免疫球蛋白超家族，目前并不知曉Tvc 蛋白在雞上的具體作用，但該蛋白在細胞外側含有2 個免疫球蛋白結構域（IgV 和IgC），這兩個結構域被認為是ALV-C 進入宿主細胞的關鍵結構域[5]，特別是IgV 結構域的第48 位的色氨酸和第105 位的酪氨酸被認為是受體-病毒相互作用的決定因素[22]。

1.1.4 ALV-J 受體研究進展

J 亞型禽白血病病毒的受體基因是雞鈉氫離子交換體（Chicken Na+/H+exchanger type 1,chNHE1），負責調節細胞的酸堿平衡，屬于管家蛋白。chNHE1 基因編碼的蛋白定位在細胞膜上，該蛋白跨膜12 次，有6 個胞外環，5 個胞內環。目前在全球范圍內沒有發現任何雞種或某一家系對ALV-J 具有抗性，這或許也是ALV-J 在我國流行的原因。chNHE1 的第一個胞外環被認為是ALV-J 與chNHE1 相互作用的關鍵結構，進一步的研究發現chNHE1 的第一個胞外環的第38 位色氨酸缺失會導致細胞對ALV-J 產生抗性[23,24]。這或許能為我們開展ALV-J 抗病育種帶來便利。然而，最近有報道指出，ALV-J 的受體蛋白還有雞膜聯蛋白A2（chANXA2）[25]以及雞葡萄糖調節蛋白78（chGRP78）[26]，不 過chANXA2 和chGRP78 可能是介導ALV-J 感染的次要受體[5]。Mo 等[27]研究表明，慢羽雞dPRLR 基因編碼的蛋白可能也是ALV-J 的受體，dPRLR 是慢羽雞特異性表達的基因。

1.2 ALV-E 對ALV 易感性的研究進展

脊椎動物基因組上存在大量的內源性逆轉錄病毒（Endogenous retroviruses，ERVs）位點[28]，這些ERVs 可能是在進化過程中外源性逆轉錄病毒感染后在宿主基因組上的殘留[29]。ERVs 在基因組上通常是有缺陷的，他們有的不能正常轉錄，有的僅能表達部分病毒基因，不過也有少量ERVs 能正常表達[28]。在雞上，ERVs 約占基因組的3%，而ALV-E 是在禽上發現的第一個ERVs[29]。以前通常認為ERVs 是基因組上無效甚至有害的DNA 片段，但目前已經有研究表明，ERVs 的存在可以對宿主免疫系統產生復雜影響[5]。

雞的基因組上有大量的內源性ALV（ALV-E）位點，即ev 位點，但絕大多數的ev 位點均有缺陷，缺少自我復制所必須的基因或只含有“LTR”，僅有少部分相對完整的ev 位點，如ev7、ev9、ev21 等[30]。Ev 位點的存在對雞的抗病性狀、繁殖性狀和生長性狀均有影響[31]。早期的研究發現ev21 與慢羽基因完全連鎖，慢羽白來航雞對ALV 易感性的增加、病死率的上升被認為與ev21密切相關，但是直到現在仍不清楚其中的具體機制[5,31]。隨著研究的不斷深入，發現ev21 在某些雞種上與慢羽基因并不呈完全連鎖，例如，慢羽雄性太行雞ev21 的陽性率為86.1%，慢羽雌性太行雞ev21 的陽性率為78.9%[32]。除了ev21 的存在影響ALV 的易感性外，Smith 等[33]研究發現，ev6 陽性雞對ALV-A 的易感性和感染ALV-A 后的致瘤率都顯著高于ev6 陰性雞。此外，擁有完整ev 位點的雞在接種馬立克疫苗或感染馬立克病毒后發生淋巴細胞白血病的概率會增加[34]。含有某些ev 位點的雞對ALV 具有易感性，可能與這些ev 位點所轉錄的非編碼RNA 有關，如ALV-J感染后，ERV-L 家族編碼的可以與免疫球蛋白結合蛋白結合的Lnc-LTR5B 減少，進而促進ALV-J在宿主細胞內的復制[35]。Ev 位點的存在除了可以促進ALV 感染外，還可以抵抗ALV 感染，例如，ev1 編碼的Lnc-ALVE1-AS1 可以通過激活TLR3 通路激活先天性免疫反應來阻止病毒感染[36]；ALV-J 感染后，ev1 可以通過促進OAS、PKR 和IFN-β、IFN-γ 的表達，來抑制外源性病毒的復制[37]?？傮w來看，ev 位點的存在有好也有壞，不過不含ev 位點雞[38]的成功培育表明，ev 位點的缺失并不影響雞的生存，這為將來較好的利用ev 位點提供了參考。

1.3 利用高通量測序技術獲得的與ALV 抗感染相關基因

隨著高通量測序技術的日漸成熟，近年來發現了許多與ALV 感染相關的非編碼RNA。ALV-miRNA-p19-01 通過與特異性雙磷酸酶6 的正向結合調控ERK2 活性來促進ALV-J 的復制[39]。Yu 等[40]研究發現，gga-miR-148a-5p 可以靶向PDPK1 抑制ALV-J 感染的CEF 細胞的增殖，從而在一定程度上減小ALV-J 感染后雞患腫瘤的風險。Yang 等[41]發現Circ_PIAS1 通過上調miR-183的表達促進細胞凋亡進而影響ALV-J 感染，不過miR-183 通過何種途徑促進細胞凋亡還有待研究。DF1 細胞感染ALV-J 后，lnc-ALVE1-AS1 的表達降低，但過表達lnc-ALVE1-AS1 后可以顯著抑制ALV-J 的復制。除了非編碼RNA，通過轉錄組測序技術也找到了大量與ALV 感染相關的差異基因，然而在這些差異基因里面只有少數被了解。Yan 等[42]通過RNA-seq 找到了515 個ALV-J 易感雞和正常雞的差異基因，但僅發現TGFB2 的過表達能促進ALV-J 的復制。張會永等[43]通過RNA-seq 在感染和未感染ALV-J 的汶上蘆花雞的肝臟組織中找到了76 差異基因，但是這些基因在ALV-J 感染中起著什么作用還需要進一步的驗證。此外，ATAC-seq、scRNA-seq、meRIP-seq、GWAS 等高通量測序技術也被用于探究ALV 的致病原因，伴隨著這些技術的應用，產生了大量的數據，但是大多試驗僅挖掘了其中的部分信息，其中能用于抗病育種的數據可能被忽視了。

1.4 基因編輯技術在ALV 抗病育種上的應用

規律性重復短回文序列簇（Clustered regularly interspaced short palindromic repeat,CRISPR）技術被認為是培育ALV-J 抗性雞的重要技術，雖然CRISPR 技術在生產基因編輯哺乳動物上已經很成熟，但在禽類上的運用卻相對落后，主要原因是禽類胚胎細胞難以獲得以及獲得后難以對其進行操作[44]。Lavioir 等[45]成功實現對雞原始生殖細胞（Primordial Germ Cells，PGC）的體外培養以及個體間移植后，為雞的基因編輯帶來了可能。PGC 是精子和卵子的前體，可以在體外進行培養，將它轉入受體雞后，受體雞可以產生相應配子?；蚓庉嬰u培育的第一步是獲得供體雞的PGC，這些PGC 可以是剛分離的也可以是在體外培養的；第二步是將CRISPR 系統導入PGC；第三步是將經過編輯的PGC 移植到受體雞；第四步是產生F1 代的嵌合體雞；第五步是通過F1 代嵌合體雞間的交配獲得純和個體[46]。Anna 等[47]通過CRISPR／Cas9 成功在雞PGC 中敲除了ALV-J 受體chNHE1 胞外環的W38 位點，并成功獲得了敲除個體，同時敲除個體對ALV-J 表現出了抗性，這意味著通過CRISPR 技術培育ALV-J 抗性雞是可行的，為ALV 抗病育種奠定了一定的基礎。CRISPR 基因編輯技術雖然已經較為成熟，但還存在著一些亟需解決的問題。除倫理、道德、法律、動物福利等問題外，限制CRISPR 技術應用的最大障礙是脫靶效應[48]。脫靶效應是Cas9 切割與靶標DNA 片段相似的位點造成，這可能會導致一些災難性的后果。另外，限制CRISPR 技術在家禽中運用的另一技術問題是CRISPR／Cas 系統在禽類細胞中的轉染效率低[49]。家禽業目前正在經歷一場基因編輯革命，雖然其中還存在一些問題，相信在將來會實現通過對家禽基因組的精確編輯快速獲得目標性狀[50]。

2 小結

在ALV 流行的背景下，培育抗ALV 感染品系雞似乎成了解決ALV 流行問題的關鍵。宿主可通過阻止病毒進入細胞和病毒進入細胞后阻止其繁殖來抵抗感染。本文首先對近年來發現的禽白血病病毒受體及其相關的抗性位點進行了描述。在感染雞的幾類ALV 中，除了ALV-J 沒有在自然界中找到抗性雞外，其它幾類ALV 都在自然群體中找到了抗性雞，并找到了相關抗/易感位點。雖然沒找到抗ALV-J 感染雞，但卻找到了與ALV-J 易感性相關的受體蛋白相關位點。在高通量測序技術普及的背景下，我們對近年來利用高通量測序技術發現的與抗ALV 感染的相關分子進行了綜述，發現了一些與ALV 感染相關的分子，這些分子可能會在將來的抗ALV 感染新品種培育中起關鍵作用。利用基因編輯技術是一種能極大縮短育種年限的技術，特別是在培育抗ALV-J 感染的雞種上，因為目前并沒有找到抗ALV-J 感染的自然雞群，并且ALV-J 也是在我國地方雞種上廣泛流行的ALV。