miR-31 通過下調FIH 和上調VEGF-A/VEGFR-2促進大鼠主動脈內皮細胞增殖

李詠梅，付媛，曹利利，杜若琛，王春芳*，張軒萍*

（1 山西醫科大學生理學系細胞生理學教育部重點實驗室，太原 030001；2 山西醫科大學基礎醫學院藥理學教研室，晉中 030619；3 山西醫科大學實驗動物中心，太原 030001）

心血管疾病是全世界最常見的死亡原因之一，近年來，盡管進行了積極的預防工作，但心血管疾病的發病率依舊呈上升趨勢[1]。內皮是一個連續的屏障，其表面直接與體內幾乎每個系統相互作用[2]。血管內皮細胞位于血漿與血管組織之間，對血管內皮功能及血管穩態直接造成影響，血管內皮功能障礙與廣泛心血管疾病直接相關[3,4]。主動脈內皮細胞是探索血管內皮功能特性的重要載體，大量研究采用了大鼠主動脈內皮細胞（rat aortic endothelial cells,RAECs），在體外培養中通過各種刺激模擬不同病理條件時在體內的狀態，進而高效、便捷的分析病理機制，為開發防治心血管疾病的策略奠定了重要的基礎[5]。在本文中，首先在國內外方法的基礎上建立原代RAECs 的分離培養方法。

血管生成是維持正常組織生理的關鍵過程，通過形成新的血管網絡參與組織重塑和再生[6]。微小核糖核酸（microRNAs, miRNA）在不同物種間是保守的，miR-31 是一種亟待進一步研究的短鏈非編碼RNA，是一種關鍵的基因表達調節因子[7]。缺氧誘導因子抑制因子（hypoxia inducible factor inhibitor, FIH）被證明與血管生成密切相關，且被證明是miR-31 的直接靶標[8,9]。FIH 被證明會調節血管內皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A,VEGF-A），表現為FIH 的消耗會誘導VEGF-A 的表達[10]。VEGF-A 誘導血管內皮細胞的增殖，與血管內皮生長因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2, VEGFR-2）結合，進而促進血管生成[11]。因此，我們以RAECs 為研究對象，探究miR-31 對其功能的影響及作用機制，對于內皮功能障礙相關的心血管疾病中有重大臨床意義。

材料與方法

1 實驗動物

12只1月齡SPF 級SD大鼠，體重約為100～120 g，雌雄不限，購自山西醫科大學實驗動物中心【SCXK（晉）2019-0005】，飼養于山西醫科大學實驗動物中心屏障環境中【SYXK（晉）2019-0007】。晝夜各半循環照明，濕度恒定，溫度控制在 22～25 ℃，潔凈通風，自由進食飲水。所有實驗操作均符合實驗動物倫理學要求（審批號：SYDL2021016）以及中華人民共和國《實驗動物管理條例》。

2 主要試劑與儀器

Ⅰ型膠原酶（Macklin，C909787），胰蛋白酶-EDTA 消化液（0.25%，Solarbio，T1300），兔抗CD31抗體、兔抗vWF 抗體、兔抗CD34 抗體（BOSTER，PB9273、PB9273、PB9053），Cy3 標記的miR-31 激動劑/抑制劑（miR-31 agomir/antagomir，廣州銳博，R10034.9），轉染試劑（INTERFERin?，Polyplus，PT-409-01），miRNA 第一鏈合成試劑盒（Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit，Takara，638313），兔抗FIH 抗體、兔抗VEGF-A 抗體、兔抗VEGFR-2 抗體（ABclonal，A5466、A12303、A5609），HRP-標記的山羊抗兔IgG H&L（Abacam，ab6721），Hoechst 33258 染色液（Boster，AR1169）。倒置顯微鏡和熒光顯微鏡（OLYMPUS，日本），電泳儀、轉膜儀和高靈敏度化學發光成像系統（Bio-Rad，美國）。

3 大鼠主動脈內皮細胞原代培養

腹腔注射戊巴比妥鈉（150 mg/kg）以麻醉大鼠，75%乙醇噴灑胸部和腹部消毒。打開大鼠胸腹腔，切開髂總動脈分支處放血，左心室注射預冷磷酸鹽緩沖液（PBS）灌注主動脈。沿著脊柱將心臟、主動脈及在外附著的結締組織和脂肪分離出來，直至髂總動脈分支處，并將其置于含2%青霉素-鏈霉素的無菌PBS 中，移至超凈工作臺內，換液2 次，漂洗表面殘留血漬，在解剖顯微鏡下逐步用剪刀、鑷子將主動脈剔除干凈。將剔除干凈的主動脈移入不含雙抗的無菌PBS 后縱行剖開，盡量不把主動脈斷開，在6 cm 直徑單孔培養皿中配制1∶1 的 2 g/L 膠原酶及胰酶的混合消化液，將剖開的主動脈展開放入消化液，培養箱中消化15 min。取出培養皿，加入相同體積含有20% FBS 的培養基終止消化過程，肉眼下用彎鑷將血管內膜輕輕刮拭幾次，使內皮細胞脫落，力度以不使血管斷裂為度。培養基或無菌PBS 沖洗后棄去血管，收集培養皿中液體，離心后棄上清，重懸細胞，吹打分散后用移液器均勻轉移至6 孔板的兩孔內，于含20% FBS 的DMEM 培養基在培養箱中培養（表1）。培養1 d 后換液，去除未貼壁的細胞；其后每隔2 d 半定量換液1 次，待細胞融合成片，即可傳代培養。

表1 大鼠主動脈內皮細胞的原代培養方法Tab.1 Primary culture method of rat aortic endothelial cells

4 目的細胞傳代培養

待6 孔板中培養的原代細胞融合度達到90 %以上時，用0.25 %胰蛋白酶-EDTA 消化液消化細胞。重懸后將1 個6 孔板孔內的細胞接種于1 個T25 培養瓶，繼續培養。每2～3 d 換液，細胞融合度達85%以上時進行傳代或后續實驗，定時觀察并記錄細胞生長狀態。

5 CD31、vwF 和CD34 免疫熒光染色

取第2 代近融合的內皮細胞，消化后接種至6孔板，4%多聚甲醛固定、0.5% Triton X-100 室溫通透，正常山羊血清封閉后滴加抗體（1∶200）于4 ℃過夜。加入熒光二抗（1∶400）、0.1% Hoechst 避光孵育，封片后熒光顯微鏡下觀察。

6 細胞分組及細胞轉染

取第2 代近融合細胞進行實驗，將細胞分為3組，對照（Control）組、miR-31 激動劑（miR-31 A）組和miR-31 抑制劑（miR-31 An）。接種細胞后添加含有FBS、無雙抗的培養基，當細胞融合度達到30%～50%時，轉組染miR-31 agomir 和antagomir（終濃度分別為50 nmol/L 和100 nmol/L）。轉染細胞12 h 后，4%多聚甲醛固定、0.1% Hoechst 避光孵育，在熒光顯微鏡下觀察。

7 細胞增殖檢測

取第2 代近融合的內皮細胞接種于96 孔板（10000 個細胞/孔），將CCK-8 溶液與培養基1∶9混合，每孔加100 μL 混合液，孵育2 h 后檢測在450 nm 處吸光度。轉染細胞后連續3 d 測定吸光度。

8 實時熒光定量逆轉錄PCR（RT-qPCR）

轉染細胞后，使用Trizol 法從細胞中提取總RNA，按照說明書將miR-31 反轉錄成cDNA，以cDNA 為模板進行擴增。在95 ℃預變性1 min；95℃15 s，60 ℃ 1 min 進行40 個循環；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min, 95 ℃ 15 s 和60 ℃ 15 s 建立熔解曲線。相對miRNA 表達水平以U6 為參考基因，根據公式2-ΔΔCt進行計算。PCR 引物序列見表2。

表2 PCR 引物序列Tab. 2 Primer sequences for PCR

9 蛋白質免疫印跡

提取細胞中的總蛋白并測定蛋白濃度。SDSPAGE 凝膠電泳，轉膜、封閉后，與抗FIH（1∶1000）、抗VEGF-A（1∶1000）、抗VEGFR-2（1∶1000）及抗β-actin（1∶2500）一抗，4 ℃過夜。次日，與相應的HRP 標記的二抗（1∶5000）室溫下孵育60 min。使用ECL 發光試劑檢測條帶，使用Image Lab 軟件進行分析。

10 統計學方法

實驗數據采用IBM SPSS Statistics 26 軟件統計分析，采用GraphPad Prism 8.3.0軟件作圖。數據表示為±s表示，組間比較運用單因素方差分析（oneway ANOVA），以P＜0.05 表示兩組間差異具有統計學意義。

結 果

1 大鼠主動脈內皮細胞原代與傳代培養與鑒定

原代培養1 d 時細胞貼壁，鏡下觀察到單個散在分布的內皮樣細胞，可看到短梭形或多角形細胞形態；培養3～4 d 時細胞變密集，逐漸融合成片，偶見接觸抑制現象；培養5 d 時，細胞生長旺盛并連接成片，邊緣部分廣泛出現接觸抑制現象；培養7～8 d 時，細胞融合度達到90%以上，貼壁細胞鋪滿培養瓶底面，呈典型的單層、三角形、卵型不規則形狀，主要見鋪路石樣單層鑲嵌排列（圖1）。

圖1 原代培養1 d （A）、3 d（B）、5 d（C）和7 d（D）的大鼠主動脈內皮細胞的形態特點。比例尺，100 μmFig. 1 Morphological characteristics of the rat aortic endothelial cells in primary culture for 1 day (A), 3 days (B), 5 days (C) and 7 days (D). Scale bar,100 μm

第2 代細胞接種1 d 時，可見到梭形或多角形的內皮樣細胞均勻散在分布；3～4 d 時，細胞可鋪滿培養瓶底面，呈典型的單層、鋪路石樣鑲嵌式排列（圖2）。培養至第5 代時仍能看到典型的內皮細胞形態。

圖2 傳代培養1 天（A 和B）和3 天（C 和D）的大鼠主動脈內皮細胞的形態特點。比例尺，A、C，100 μm；B、D，50 μmFig. 2 Morphological characteristics of the rat aortic endothelial cells subcultured for 1 day (A and B) and 3 days (C and D) in subculture. Scale bar,100 μm in A and C, 50 μm in B and D

免疫熒光染色顯示，傳代培養第3代的細胞在細胞膜上和細胞質中均呈CD31、vwF 和CD34 陽性，免疫熒光標記陽性率達98%以上（圖3）。

圖3 CD31、vwF 和CD34 在傳代培養第3 代大鼠主動脈內皮細胞中表達的免疫熒光檢測。比例尺，25 μmFig. 3 Immunofluorescent examination of expressions of CD31, vwF and CD34 in subcultured rat aortic endothelial cells at passage 3. Scale bar, 25 μm

2 miR-31 促進主動脈內皮細胞增殖

在傳代培養第3 代的主動脈內皮細胞轉染miR-31 agomir 或miR-31 antagomir 后，細胞核周圍可見紅色熒光，表明miR-31 agomir 或miR-31 antagomir 轉染成功，陽性率均達97%以上（圖4A）。RT-qPCR 檢測顯示，轉染agomir 后 miR-31 含量明顯升高，轉染antagomir 后miR-31 含量明顯下降（圖4B），表明miR-31 agomir/miR-31 antagomir 能有效上調/下調miR-31 的表達。

圖4 第3 代大鼠主動脈內皮細胞miR-31 agomir/antagomir 轉染效率與作用效果分析。A，熒光顯微鏡觀察miR-31 agomir/antagomir 轉染效率；比例尺，50 μm。B，RT-qPCR 檢測miR-31 agomir (A) / antagomir (An)對miR-31 表達的影響；與Control 組相比，**P ＜ 0.01；n=6Fig. 4 Analysis of transfection efficiency and efficacy of miR-31 agomir/antagomir in subcultured rat aortic endothelial cells at passage 3. A, fluorescence microscopic observation of miR-31 agomir/antagomir transfection efficiency; scale bar, 50 μm. B, RT-qPCR detection of the effect of miR-31 agomir/antagomir on expression of miR-31; **P ＜0.01, compared with control group; n=6

轉染細胞后，定時在顯微鏡下觀察細胞形態。在轉染后1 d 時，可觀察到miR-31 agomir 和antagomir轉染對主動脈內皮細胞有一定的毒性作用，出現細胞漂浮現象。繼續培養，對照組細胞生長旺盛，在第2 d 時可見廣泛的細胞接觸抑制現象；miR-31 agomir組細胞生長較慢，在第3 d 時仍可觀察到較多的間隙。CCK-8 分析顯示，與Control 組相比， miR-31 agomir 組于轉染后1 d 起，細胞增殖速度明顯加快；miR-31 antagomir 組在轉染后第2、3 d 時，細胞增殖速度明顯下降。由此表明miR-31 促進主動脈內皮細胞增殖（圖5）。

圖5 改變miR-31 表達對大鼠主動脈內皮細胞增殖影響的CCK-8 檢測。與對照組比較：*P＜0.05，**P ＜0.01；n=6Fig. 5 CCK-8 assay of the effect of changing miR-31 expression on proliferation of the rat aortic endothelial cells. *P ＜0.05, **P ＜0.01,compared with Control; n=6

3 miR-31 下調FIH 且上調VEGF-A 和VEGFR-2

蛋白質免疫印跡分析表明，與對照組主動脈內皮細胞相比，轉染miR-31agomir 的主動脈內皮細胞FIH 水平明顯下降，VEGF-A 和VEGFR-2 水平明顯升高；miR-31 antagomir 的主動脈內皮細胞FIH 水平明顯升高，VEGF-A 和VEGFR-2 水平則明顯降低（圖6），由此表明，在主動脈內皮細胞中，miR-31能下調FIH 水平，上調VEGF-A 和VEGFR-2 水平。

圖6 改變miR-31 表達對大鼠主動脈內皮細胞內FIH、VEGF-A 和VEGFR-2 水平影響的免疫印跡分析。A，大鼠主動脈內皮細胞內FIH、VEGF-A 和VEGFR-2 水平的代表性免疫印跡檢測。B，大鼠主動脈內皮細胞內FIH、VEGF-A 和VEGFR-2 水平的定量分析；與對照組相比，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01；n=3Fig. 6 Immunoblotting analysis of the effects of changing miR-31 expression on the levels of FIH, VEGF-A, and VEGFR-2 in the rat aortic endothelial cells. A, representative immunoblotting detection of FIH, VEGF-A, and VEGFR-2 levels in the rat aortic endothelial cells. B, quantitative analysis of FIH, VEGF-A, and VEGFR-2 levels in the rat aortic endothelial cells; *P ＜0.05, **P ＜0.01, compared with Control; n=3

討 論

心血管疾病是一種有嚴重危害性的疾病，在全球尤其在發展中國家，是人們死亡的主要因素[2]。由于血管內皮細胞直接與循環血液接觸，因此很容易受到血液中活性物質的影響[3]。越來越多的證據表明，血管內皮功能障礙是與血管收縮、血栓形成和炎癥狀態相關的疾病，例如高血壓、動脈粥樣硬化、心力衰竭、心肌梗死和中風等廣泛心血管疾病的標志[4]。

微小RNA（miRNAs）在不同物種之間是保守的[7]。miRNAs 可以在轉錄后水平上負調節其靶基因，參與調節血管功能等重要的生命過程[8]。研究表明miR-31 可直接靶向FIH，影響細胞增殖、遷移及血管形成過程[9]。高水平的miR-31 會導致體外毛細血管樣小管形成增強[12]。此外，研究發現FIH 與VEGF 密切聯系，添加VEGF-A 可以減輕由FIH 過度表達引起的血管缺陷[10]。VEGF-A 是維持正常組織生理的關鍵基因，通過與VEGFR-2 相互結合，參與到血管張力控制、血管生成的一系列過程[13]。在心血管疾病中，活性氧物種（ROS）、氧化脂質等在血管部位的累積會進一步增強VEGF-A 和VEGFR-2的產生，共同導致血管生成[14]。因此，本文在細胞水平上探究miR-31 對RAECs 功能及FIH/VEGF 通路的影響，對于廣泛的心血管疾病可能會產生有利的啟示。

目前，國內外的原代RAECs 分離培養方法分為植塊法及植塊法聯合消化法，在內皮翻轉后結扎燒焦、整體植塊法中，使用了縫線、縫合針、加熱鉗、鼠尾膠包被[15]；在內皮外翻或剖開、血管段或組織塊植塊法中，使用了眼科顯微器械[16]；在主動脈環植塊法中，使用了明膠包被、含肝素的PBS 灌注[17]；在內皮外翻、消化壓片法中，使用了眼科顯微器械、顯微針、明膠包被[18]，且均另外添加了內皮細胞生長因子、肝素、胰島素等營養因子，達近融合狀態時間在7 ～14 d 不等。本文建立了原代大鼠內皮細胞的分離培養方法，并揭示了miR-31 對RAEC細胞功能的積極作用，可能與血管生成相關的FIH /VEGF-A / VEGFR-2 通路相關。在不進行包被處理、無特殊器械、不添加昂貴營養因子的情況下，成功培養了原代及傳代RAECs。而后，通過觀察miR-31對RAECs 增殖的作用，以及測定細胞中miR-31 與FIH、VEGF-A 和VEGFR-2 這些血管生成相關通路中關鍵分子的表達情況，來探索miR-31 對RAEC功能的影響及其潛在機制。結果表明，miR-31 使細胞增殖明顯加快，下調FIH 水平，上調VEGF-A 和VEGFR-2 水平，由此提示miR-31 促進RAEC 細胞增殖可能是通過下調FIH、上調VEGF-A 和VEGFR-2實現的。

在之后的研究中，可以在細胞水平上和動物水平上驗證miR-31 是否直接靶向FIH，關注于FIH 參與調節的下游因子，還可以在廣泛的心血管疾病中進行相關機制的探索。此次研究將miR-31 與內皮細胞聯系起來，為開發心血管疾病的新型治療策略提供了新思路。