高級別膠質瘤組織中MDC1 高表達和miR-590-5p低表達促進膠質瘤細胞凋亡

任成波，趙麗霞，李錦秋，杜曉猛，張志林*

（1 河北北方學院附屬第一醫院放射治療科，張家口， 075000；2 河北北方學院附屬第一醫院腫瘤內科，張家口， 075000）

膠質瘤是成人中樞神經系統最常見的原發性惡性腫瘤之一，具有術后放療效果差、復發率高等特點[1]。根據世界衛生組織的分類標準，膠質瘤分為低級別膠質瘤（low-grade glioma，LGG）和高級別膠質瘤（high-grade glioma，HGG）[2-3]。與LGG 相比，HGG 生長較快，侵襲性更強，其好發年齡為50～60 歲，還具有高發病率、高復發率和高致死率等特點[4]。目前，HGG 的主要治療方法包括手術、化療和放療。盡管進行了積極的綜合治療，但患者的術后放療效果仍然很差[5-6]。因此，尋找更多的分子靶點用于HGG 的早期診斷和預后評估具有重要意義。近年來，隨著對miRNA 的深入研究，發現其可作為識別腫瘤的標志物之一。研究顯示，miR-590-5p 在多種癌癥疾病中發揮不同調控作用[7]。DNA損傷檢查點蛋白調節子1（mediator of DNA damage checkpoint 1，MDC1）是參與早期DNA 損傷修復的重要分子[8]，近年來被陸續發現參與多種腫瘤疾病進展[9]。目前二者在HGG 組織中的表達及調控作用尚不清楚。因此，本研究通過檢測HGG 組織中miR-590-5p 和MDC1 的表達情況，探討二者在HGG 組織中的表達及與患者術后放療效果的關系，并通過細胞實驗探討miR-590-5p 和MDC1 對膠質瘤細胞增殖、凋亡的影響。

材料與方法

1 研究對象

選取2019 年1 月至2021 年2 月在河北北方學院附屬第一醫院進行治療的64 例HGG 患者作為研究對象，收集手術切除的原發腫瘤標本及20 份正常腦組織（為該院同時期的腦外傷內減壓手術患者標本）。納入標準：①手術切除后病理診斷為HGG 的患者；②術后均進行放療的患者；③患者隨訪資料完整。排除標準：①術前接受新輔助化療或放療的患者；②近一個月內有感染或炎癥病史的患者；③復發性HGG 患者；④不能配合治療的精神障礙患者；⑤合并心血管、肝、腎等疾病的患者；⑥其他惡性腫瘤腦轉移患者。本研究經我院醫學倫理委員會批準通過，所有樣品采集均取得受試者知情同意，符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》。

2 組織中MDC1 表達的免疫組織化學染色

標本經石蠟包埋、切片后二甲苯常規脫蠟，用乙二胺四乙酸緩沖液在95°C 高熱修復，3% H2O2孵育，山羊血清封閉，然后加兔抗人MDC1 一抗（艾美捷科技有限公司，1∶100）在4°C 下孵育過夜，孵育完畢后洗去一抗，用過氧化物酶偶聯山羊抗兔二抗室溫孵育30 min，最后使用0.04% DAB-0.01%H2O2孵育5 ～10 min ，蘇木精復染，脫水、透明、封片。根據染色強度和陽性百分比獨立進行評分：染色強度記為1（弱染色）、2（中度染色）或3（強染色）分。免疫陽性染色細胞的百分率記為1（0%～25%）、2（26%～50%）、3（51%～75%）和4（76%～100%）分。MDC1 的表達水平最終由上述兩個分數相乘（范圍為1 ～12 分）來評估，0 ～4 分為低表達，5 ～12 分為高表達。

3 組織中miR-590-5p 水平的qRT-PCR 檢測

使用TRIzol 試劑（Invitrogen，美國）提取總RNA，Nanodrop 2000 光譜儀測定RNA 濃度，逆轉錄合成cDNA，使用miRNA 熒光定量檢測試劑盒（SYBR Green）進行qRT-PCR 反應，U6 用作參考基因。反應體系由10 μL SYBRPrimix Ex Taq（2×）、0.4 μL 5’引物、0.4 μL 3’引物和2.0 μL cDNA 模板組成。反應條件：95 °C 30 s 后 95 °C 5 s 和60 °C 40 循環，共設40 個循環。每個反應重復3 次，用2-ΔΔCT法計算miR-590-5p 相對表達水平。

4 膠質瘤細胞培養及分組

膠質瘤細胞U87MG 于含有10%胎牛血清的培養基中，在37 °C、5% CO2的培養箱中培養。選擇對數期生長的U87MG 細胞，以3×105個細胞/孔的密度接種于6 孔板中，當細胞生長達到80%匯合時，進行轉染。實驗分為：對照組（未轉染）、NC mimic 組（轉染NC mimic）、miR-590-5p mimic組（轉染miR-590-5p mimic）、NC-shRNA 組（轉染NC shRNA）、MDC1-shRNA 組（ 轉染MDC1 shRNA）。轉染步驟：用不含胎牛血清的細胞培養液與NC mimic、miR-590-5p mimic、NC-shRNA、MDC1-shRNA 混合后室溫孵育5 min（A 液），Lipofectamine 2000 轉染試劑（美國Invitrogen 公司）與不含胎牛血清的細胞培養液充分混合（B 液），A 液與B 液充分混勻后室溫孵育20 min，并將其加入U87MG 細胞，轉染6 h 棄上清液后更換正常培養液，并繼續培養48 h。培養48 h 后，收集細胞，采用qRT-PCR 和Western blot 技術檢測U87MG 細胞中miR-29c、MDC1 的表達情況。NC mimic、miR-590-5p mimic、NC-shRNA、MDC1-shRNA 均購自廣州市銳博生物科技有限公司。

5 Western blot 檢測MDC1 的表達

提取膠質瘤細胞U87MG 總蛋白，經10% SDSPAGE 分解并轉移到PVDF 膜上，用5%脫脂牛奶在37 °C 下封閉30 min 后，在含Tween 20 的三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖鹽溶液（Tris buffer solution Tween，TBST）（取Tris 24.2 g、氯化鈉80 g，調節pH 為7.6，定容1000 mL）中洗滌4 次，并在4°C 下與MDC1（艾美捷科技有限公司，1∶1000）、GAPDH（1∶1000，上海生工生物）一抗孵育過夜。清洗后，將膜與辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗在室溫下孵育1 h。通過增強化學發光檢測免疫反應性，并使用ChemiDoc XRS 成像系統和Image J軟件掃描分析目的蛋白與內參蛋白的光密度值。以GAPDH 蛋白條帶作為內參對照，計算MDC1 蛋白的相對表達量。MDC1 蛋白相對表達量=MDC1 蛋白條帶光密度值/GAPDH 蛋白條帶光密度值。

6 CCK-8 檢測細胞增殖

將U87MG 細胞（細胞密度為3×104細胞/mL）接種在96 孔板中（100 μL/孔），當細胞生長達到80%匯合時，按照上述分組進行轉染處理后，在37°C 和5% CO2條件下分別培養24 h、48 h、72 h，然后每孔添加10 μL CCK-8 溶液。繼續培養2 h 后，用酶標儀在450 nm 處測量每孔的光密度（OD）值。

7 流式細胞術檢測細胞凋亡

轉染48 h 后收集各組U87MG 細胞，使用1×結合緩沖液調整細胞密度為5×106個/mL，取200 μL細胞懸液，加入5 μL Annexin V-FITC，室溫反應10 min，再加入10 μL PI，室溫黑暗孵育20 min。最后用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

8 異種移植瘤實驗

雄性BALB/c 裸鼠（6 周齡）購自北京漢富凱生物科技有限公司，在無病原體條件下飼養。動物實驗經本院動物倫理委員會批準。將1×107個穩定轉染NC mimic、miR-590-5p mimic、NC-shRNA、MDC1-shRNA 的U87MG 細胞皮下注射到BALB/c裸鼠左腋窩下，分別記為NC mimic 組、miR-590-5p mimic 組、NC-shRNA 組、MDC1-shRNA 組，每組6 只裸鼠。每周測量移植瘤體積，注射后4 周處死裸鼠，剝離腫瘤組織，并對腫瘤進行稱重。將腫瘤組織用4%多聚甲醛固定后，石蠟包埋，制備石蠟切片，采用免疫組化法檢測腫瘤組織Ki-67 表達情況，并使用Image J 軟件分析Ki-67 陽性表達水平。

9 放療效果評價

所有患者于放療結束后通過門診或者電話進行定期隨訪，隨訪截止時間為2021 年12 月。放療效果評估參照實體瘤評價標準[10]：客觀緩解率（效果良好）=（CR+PR）/總例數。完全緩解（complete disease remission，CR）表示腫瘤完全消失，部分緩解（partial remission，PR）表示腫瘤體積縮小＞50%，疾病穩定（stable disease，SD）表示腫瘤體積縮小25%～50%，疾病進展（progressive disease，PD）表示出現新病灶或腫瘤體積增加超過25%。根據隨訪結果發現，64 例患者中有13 例CR，18 例PR，21 例SD，12 例PD，客觀緩解率計算得48.44%（31/64）。

10 統計學分析

通過SPSS 22.0 進行統計學分析，計量資料采用（±）表示，兩兩比較進行t檢驗，多組比較采用單因素方差分析；計數資料采用例（n）表示，進行卡方（χ2）檢驗；采用Pearson 法分析miR-590-5p 與MDC1 在HGG 組織中表達的相關性；多因素Logistic 回歸分析HGG 患者術后放療效果的影響因素。P＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 高級別膠質瘤腦組織中MDC1 表達水平升高

免疫組織化學染色顯示，正常腦組織中，MDC1多呈低水平表達，免疫反應產物呈色較弱，低水平定位于細胞核內；HGG 組織中MDC1 多呈高水平表達，免疫反應產物呈色明顯增強（圖1，表1）。

圖1 高級別膠質瘤及正常腦組織中MDC1 表達水平的免疫組織化學檢測。A，正常腦組織；B，HGG 腦組織；比例尺，100 μmFig. 1 Immunohistochemical examination of MDC1 expression in high-grade glioma and normal brain tissue. A, normal brain tissue; B, HGG brain tissue; scale bar, 100 μm

表1 高級別膠質瘤及正常腦組織中MDC1 表達水平比較Tab. 1 Comparison of MDC1 expression level in high-grade glioma and normal brain tissue

2 高級別膠質瘤腦組織中miR-590-5p 表達水平降低

qRT-PCR 檢測表明，HGG 組織中miR-590-5p 表達水平較正常腦組織明顯降低（表2）。

表2 高級別膠質瘤組織及正常腦組織中miR-590-5p表達水平比較Tab. 2 Comparison of miR-590-5p expression levels in high-grade glioma tissue and normal brain tissue

3 高級別膠質瘤腦組織中miR-590-5p 與MDC1 表達成負相關

Pearson法分析表明，HGG組織中miR-590-5p表達水平與MDC1 表達水平呈顯著負相關（r=-0.481，P＜0.05）。

4 HGG 患者放療效果影響因素

以MDC1 和miR-590-5p 在HGG 組織中相對表達水平的中位數為臨界值，超出該臨界值為高表達，低于該臨界值為低表達。單因素分析結果顯示，放療效果良好組及效果不良組間的MDC1 和miR-590-5p 表達比較，差異具有統計學意義（P＜0.05），說明MDC1 和miR-590-5p 表達與膠質瘤患者的放療效果相關（表3）。

表3 HGG 患者放療效果影響因素Tab. 3 Factors influencing the outcome of radiotherapy in patients with HGG

5 HGG 患者放療效果不良的Logistic 回歸分析

以是否發生放療效果不良為因變量，以MDC1、miR-590-5p 表達水平為自變量進行Logistic 回歸分析，發現MDC1 高表達、miR-590-5p 低表達均是影響HGG 患者放療效果的危險因素（表4）。

表4 HGG 患者放療效果不良的Logistic 回歸分析結果Tab. 4 Results of logistic regression analysis of poor radiotherapy outcomes in patients with HGG

6 miR-590-5p 過表達或敲低MDC1 對膠質瘤細胞增殖、凋亡的影響

CCK-8 法檢測細胞增殖能力和流式細胞術檢測細胞凋亡顯示：與對照組和NC mimic 組相比，miR-590-5p mimic 組miR-590-5p 表達顯著升高，OD 值顯著下降，凋亡率顯著增高（表5，圖2）；與對照組和NC-shRNA 組比較，MDC1-shRNA 組MDC1 蛋白表達明顯降低，OD 值顯著下降，凋亡率顯著增高（表6、圖3）。

圖2 miR-590-5p 過表達對膠質瘤U87MG 細胞凋亡影響的代表性流式細胞術分析。A，對照組；B，NC mimic 組；C，miR-590-5p mimic 組Fig. 2 Representative flow cytometry for the effect of miR-590-5p overexpression on apoptosis of glioma U87MG cells. A, control group; B, NC mimic group; C, miR-590-5p mimic group

表5 miR-590-5p 過表達對膠質瘤U87MG 細胞增殖和凋亡影響的統計學分析Tab. 5 Statisitical analysis of the effects of miR-590-5p overexpression on proliferation and apoptosis of glioma U87MG cells

表6 敲低MDC1 對膠質瘤U87MG 細胞增殖、凋亡影響的統計學分析Tab. 6 Statistical analysis of the effects of MDC1 knockdown on proliferation and apoptosis of glioma U87MG cells

7 miR-590-5p 過表達或敲低MDC1 對膠質瘤細胞移植瘤生長的影響

對移植瘤體積與重量測定和移對植瘤組織Ki-67 免疫組織化學染色顯示：與對照組和NC mimic 組比較，miR-590-5p mimic 組移植瘤體積明顯減小，重量明顯降輕，Ki-67 免疫反應陽性細胞比例明顯降低；與對照組和NC-shRNA 組比較，MDC1-shRNA組移植瘤體積也明顯減小，重量明顯減輕，Ki-67 免疫反應陽性細胞比例明顯下降（圖4，表7）。

圖4 miR-590-5p 過表達或敲低MDC1 對膠質瘤U87MG 細胞移植瘤生長的影響。A，各組移植瘤體積肉眼觀；B，各組移植瘤組織中Ki-67表達水平的代表性免疫組織化學檢測Fig.4 Effects of miR-590-5p overexpression or MDC1 knockdown on the growth of glioma U87MG cell graft tumor. A, naked eye view of the sizes of graft tumors in each group; B, representative immunohistochemical examiantion of Ki-67 expression in the graft tumor tissues of each group

表7 miR-590-5p 過表達或敲低MDC1 對膠質瘤U87MG 細胞移植瘤生長的影響Tab. 7 Effects of miR-590-5p overexpression or MDC1 knockdown on the growth of glioma U87MG cell graft tumor

8 miR-590-5p 抑制MDC1 表達

Western blot 檢測顯示：與對照組（1.00±0.08）和NC mimic 組（0.98±0.05）相比，miR-590-5p mimic 組（0.41±0.03）MDC1蛋白表達明顯降低（P＜0.05）（圖5）。

圖5 miR-590-5p 過表達對膠質瘤U87MG 細胞MDC1 蛋白表達影響的代表性Western blot 檢測Fig. 5 Western blotting of the effect of miR-590-5p overexpression on MDC1 protein expression in glioma U87MG cells

討 論

HGG 患者與其他癌癥患者的不同之處在于其疾病軌跡獨特，其發病和疾病復發往往是突然的和災難性的，盡管有手術、放療和化療等先進治療方法，但術后放療效果依然很差[11]。因此，需要選擇更加有效可靠的指標評估HGG 患者病情及術后放療效果。

miRNA 是一種短鏈非編碼RNA 分子（長約22個核苷酸）。它通過不完全堿基配對調節特定mRNA或蛋白質表達，從而抑制靶基因的蛋白質翻譯。由于miRNAs 在腫瘤發展過程中發揮致癌作用或抑制腫瘤作用，因此對其的研究已擴展到多種類型的腫瘤[12]。研究表明，miR-590-5p 在肝癌、卵巢癌、口腔鱗狀細胞癌等各種腫瘤中異常表達并發揮調節作用[13-15]。在本研究中，納入64 例HGG 患者進行研究，發現HGG 組織中miR-590-5p 表達水平較正常腦組織中降低，提示miR-590-5p 水平降低可能參與調控HGG 的發生，與HGG 密切相關；隨訪結果顯示，放療效果不良的發生率為51.56%，這與巴云濤等[16]研究結果相近。多因素分析結果表明miR-590-5p 是影響HGG 患者術后放療效果不良的危險因素，提示miR-590-5p 低表達可能與HGG 的轉移和復發相關，且有可能成為評估HGG 患者術后放療效果不良的輔助指標。

許多蛋白質對DNA 損傷作出反應并參與DNA損傷修復過程，其中MDC1 在早期發揮著重要作用。在DNA 損傷時，MDC1 不僅自身被募集到雙鏈斷裂位點，而且還有助于募集其他與DNA 損傷修復相關的蛋白質，且MDC1 在多種癌癥中表達異常，包括子宮內膜癌、卵巢癌等腫瘤疾病[17]。然而，MDC1在HGG 中的分子機制尚不明確。在本研究中，HGG組織中MDC1 表達與正常腦組織相比明顯升高，提示MDC1 可能在HGG 中發揮促癌基因的作用，分析其原因可能是HGG 患者在DNA 損傷后，MDC1發揮調控作用，參與DNA 損傷修復，提示MDC1表達水平可能與HGG 患者術后放療效果有關。本研究進一步得到miR-590-5p 和MDC1 的表達呈負相關，提示二者之間可能存在靶向關系，但具體作用機制有待進一步深入研究。通過Logistic 回歸分析結果顯示，MDC1 高表達、miR-590-5p 低表達均是影響HGG 患者放療效果的危險因素，提示臨床表現MDC1 高表達、miR-590-5p 低表達的患者，應該在術后給予更嚴密的隨訪觀察，必要時給予輔助治療，改善患者術后放療效果。

為進一步明確miR-590-5p 和MDC1 對膠質瘤細胞生物學行為的影響，本研究以U87MG 細胞為研究對象，分別轉染miR-590-5p mimic 和MDC1-shRNA，結果顯示細胞OD 值下降，凋亡率升高，表明過表達miR-590-5p 和敲低MDC1 均能抑制膠質瘤細胞增殖并誘導細胞凋亡，提示miR-590-5p 和MDC1可作為預后標志物評價患者的放療效果。同時，裸鼠移植瘤實驗結果顯示，過表達miR-590-5p 和敲低MDC1 后，移植瘤體積和重量均顯著下降，增殖標志物Ki67 表達明顯降低，這與細胞實驗結果一致，說明過表達miR-590-5p 和敲低MDC1 能夠抑制膠質瘤細胞生長。另外，本研究還發現過表達miR-590-5p 后，MDC1 蛋白表達水平明顯下調，這與相關性分析結果一致，說明膠質瘤細胞中miR-590-5p 可負向調控MDC1 的表達。

綜上所述，HGG 組織中miR-590-5p 呈低表達，MDC1 呈高表達，二者表達呈負相關，可能共同參與HGG 的發生與發展進程，對評估臨床HGG 患者的術后放療效果具有重要參考價值。但本研究納入研究樣本量較少，且未對二者在HGG 中的具體作用機制進行深入探討，有一些結果偏倚無法避免，有待進一步研究。另外，過表達miR-590-5p 和敲低MDC1 表達能夠抑制膠質瘤細胞增殖，促進凋亡，但miR-590-5p 是否通過調控MDC1 表達影響細胞增殖和凋亡還需進一步實驗驗證。