復方紅豆杉膠囊與替莫唑胺對膠質瘤細胞的協同殺傷作用

張弛，王英 ，楊福義*

（1 佳木斯大學，佳木斯 154000；2 齊齊哈爾醫學院附屬第二醫院，齊齊哈爾 161000；3 佳木斯大學院附屬第一醫院神經外科，佳木斯 154000）

腦膠質瘤是常見的顱腦惡性腫瘤，其約占所有類型的顱內腫瘤的50%，且發病率、復發率和死亡率一直居高不下[1]。由于替莫唑胺-烷化劑（temozolomide，TMZ）易穿透血腦屏障，已成為治療腦膠質瘤最重要的藥物[2]。但TMZ 也依然具有殺傷正常細胞、胃腸道反應和骨髓抑制以及耐藥等副作用[3]。目前膠質瘤的聯合治療已經非常普遍，多種藥物聯合使用不僅可以有效控制患者體內腫瘤細胞的生長，還有助于抑制或改善的并發癥，改善機體的耐藥性[4,5]。復方紅豆杉膠囊（compound taxus chinensis capsule, CTCC）具有強力殺傷腫瘤細胞，增強機體免疫系統，且治療效果持久穩定、抗腫瘤譜廣且不良反應較輕特點，目前已經用于如肺癌、直腸癌和胃癌等多種腫瘤的直接或輔助化療中[6-8]。而在膠質瘤的化療中，CTCC 與TMZ 是否具有協同作用并不清楚。因此，本研究以體外培養的U251 細胞為研究對象，初步分析了CTCC 和TMZ 對膠質瘤的化療的影響。

材料與方法

1 主要試劑

TMZ（上海創賽科技有限公司）；CTCC（重慶賽諾生物藥業股份有限公司），在使用時，去掉膠囊，用DMSO 溶解藥粉；兔源一抗KI-67、PCNA、Bcl-2、Bax、細胞色素C（cytochrome C，Cyt C）和Cleaved Caspase-3 和普通ECL 化學發光檢測試劑盒、Dylight 488 或Dylight 594 或HRP 標記的羊抗兔IgG（武漢三鷹生物技術有限公司）；RIPA 試劑、細胞質/核分離試劑盒、Bradford 蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒、BSA-TBS 緩沖系統封閉液、Blotto A 封閉液、Western blot 專用一抗和二抗稀釋液、SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液（武漢博士德生物科技有限公司）；細胞固定液（北京百瑞極生物科技有限公司）。

2 主要儀器

超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；DTY-2000 脫色搖床（北京德天佑科技發展有限公司）；DNM-9602A 酶標儀（北京普朗新技術有限公司）；IRX50 熒光顯微鏡（舜宇光學科技 （集團）有限公司）；EXFLOW 流式細胞儀（深圳市達科為生物技術股份有限公司）；化學發光成像及分析系統（上海勤翔科學儀器有限公司）。

3 細胞培養

將人神經膠質瘤U251 細胞購自廣州賽業生物科技有限公司，將其置于含10%胎牛血清的低糖DMEM 培養基內，于37 ℃、5% CO2和飽和濕度的條件培養，待生長融合度達90%時，行1∶3 傳代。

4 MTT 法篩選CTCC 和TMZ 對U251 細胞的作用濃度與實驗分組

用不同濃度的CTCC 和TMZ 處理U251 細胞48 h 后，用MTT 法檢測細胞活力，然后求出IC50值。實驗步驟如下：

①CTCC 量效設計：0 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL、1.5 mg/mL、2 mg/mL、2.5 mg/mL、3 mg/mL。

②TMZ 量效設計：0 μmol/L、10 μmol/L、25

μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L。

③將對數生長期的U251 細胞接種到96 孔板（1×104個/孔）中，于37℃細胞培養箱培養24 h，然后吸掉舊培養基，分別加入含不同濃度（0 mg/mL、

0.5 mg/mL、1 mg/mL、1.5 mg/mL、2 mg/mL、2.5 mg/mL、3 mg/mL）CTCC 和/ 或含不同濃度（0

μmol/L、10 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L）TMZ 的DMEM培養液預處理細胞30 min，每組設置3 個復孔，同時設置校準孔、溶劑對照孔，再用新培養基培養48 h 后，棄去培養液，向每孔加入新鮮培養液及10 μL MTT 溶液（5 mg/mL，即0.5% MTT），在37℃孵育4 h，再加入100 μL 二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解，在490 nm 的波長下，用酶標儀測量每個孔的OD 值，計算出IC50值。根據計算結果，CTCC 的IC50值的中位數1.796（95%CI：1.666～2.047）mg/ml，TMZ 的IC50值的中位數106.2（95%CI：83.98～153.1）μmol/L。為了后續實驗簡便，后續實驗采用的CTCC 的濃度為2 mg/mL，CTCC 的濃度為100 μmol/L。將U251 細胞分為對照組、CTCC 處理組（2 mg/mL），TMZ 處理組（100 μmol/L），CTCC+TMZ 處理組，即除對照組外，分別用2 mg/ml CTCC 或/和100 μmol/L TMZ預處理細胞30 min。

5 MTT 檢測各組細胞活力

將對數生長期的U251 細胞接種到96 孔板（1×104個/孔）中，于37 ℃細胞培養箱培養24 h，然后吸掉舊培養基，按照前述分組方法預處理細胞30 min，再培養48 h，用MTT 法檢測細胞活力。細胞活力=（實驗組OD 值-溶劑對照孔OD 值）/（對照組OD 值-溶劑對照孔OD 值）×100%。

6 集落形成實驗檢測各組細胞集落形成能力

將U251 細胞按照前述分組方法預處理細胞30 min，收集細胞并進行計數。12 孔板種板，每個孔中加入1000 個細胞，放入CO2培養箱常規培養7 d，根據細胞狀態進行培養基的更換，棄掉培養基，用PBS 進行清洗2 次（注意清洗力度，一定要輕柔），于12 孔板內加入1 mL 細胞固定液，30 min，棄掉細胞固定液，用PBS 進行清洗2 次，于12 孔板內加入1 mL 0.1%結晶紫，3 min，棄掉結晶紫，用PBS進行清洗至孔板底部清洗，拍照計數。

7 JC-1 探針檢測各組細胞線粒體去極化

將U251 細胞按照前述分組方法預處理細胞30 min，再培養48 h 后，收集細胞，并重懸于1 mL EP管內，加入0.5 mL JC-1 探針染色工作液37℃避光孵育30 min，流式細胞儀上進行檢測。

8 Annexin V/PI 染色與TUNEL 染色檢測各組細胞凋亡

將U251 細胞按照前述分組方法預處理細胞30 min，再培養48 h 后，再分別按Annexin V/PI 染色與TUNEL 染色法檢測各組細胞凋亡。

Annexin V/PI 染色步驟：收集各組細胞，加入200 μL Annexin V-FITC 結合液，避光條件下，加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻，再加入10 μL PI 染色液，輕輕混勻，室溫（22 ～25 ℃）孵育20 min，在流式細胞儀上進行檢測。

TUNEL 染色步驟：用細胞固定液固定細胞1 h，PBS清洗以后，加0.1% Triton X-100通透細胞5 min，避光條件下，加入100 μL TUNEL 染色液，室溫（22～25℃）孵育60 min，加入DAPI 染液3 min，熒光顯微鏡下觀察。

9 免疫熒光觀察各組細胞Ki-67 和PCNA 表達

將U251 細胞按照前述分組方法預處理細胞30 min，然后進行細胞爬片48 h。用細胞固定液固定細胞1 h，PBS 清洗以后，加0.1% Triton X-100通透細胞5 min，用5% BSA 封閉1 h，分別用Ki-67、PCNA 一抗（均1∶1000）37 ℃孵育2 h，PBS清洗后，分別孵育Dylight 488 或594 標記的羊抗兔IgG(H+L)二抗（均1∶1000），室溫（22 ～25 ℃）孵育60 min，加入DAPI 染液3 min，熒光顯微鏡下觀察。

10 Western blot 檢測各組細胞Ki-67、PCNA、Bcl-2、Bax、Cyt C 和Cleaved Caspase-3 表達

將U251 細胞按照前述分組方法預處理細胞30 min，然后培養48 h。收集細胞，并按說明書方法，用RIPA 提取總蛋白，用細胞質/核分離試劑盒提取細胞質蛋白。取適量蛋白質樣品（30 μg/樣），進行SDS 變性10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離蛋白后停止電泳，取出凝膠，置于轉膜專用的三明治夾中將凝膠中的蛋白質轉移到PVDF 膜上形成印記。將膜置于Blotto A 中，室溫密封2 h。分別加入Ki-67（1∶2000）、PCNA（1∶2000）、Bcl-2（1∶4000）、Bax（1∶1000）、Cyt C（1∶500）、Cleaved Caspase-3

（1∶1000）和GAPDH（1∶5000）單克隆抗體，4 ℃搖動孵育過夜。將膜置于1 ×TBST 溶液中，搖動漂洗5 min，共4 次。將膜置于含有HRP 標記羊抗兔IgG(H+L)二抗（1∶800）的Blotto A 中，室溫搖動孵育1.5 h。將膜置于1 ×TBST 溶液中，搖動漂洗5 min，共4 次。ECL 法顯像，用化學發光成像分析系統捕獲膜并分析每個蛋白質帶的光密度值。該方法計算每個樣品的蛋白質波段光密度值和對應值GAPDH（內參）比值，得到校正后的蛋白質波段光密度值，以對照組為進行標準化，并繪制代表蛋白表達的柱狀圖。

11 統計學分析

使用SPSS 22.0 進行數據分析。結果表示為均值±標準差，多組之間均數的兩兩比較采用方差分析事后Tukey 成對檢驗。P＜0.05 表示有統計學差異。

結 果

1 CTCC 與TMZ 協同抑制膠質瘤細胞增殖

與對照組比較，其余3 組細胞的活力、集落形成能力以及Ki-67 和PCNA 表達均降低；且CTCC+TMZ處理組變化較CTCC處理組和TMZ處理組變化更為明顯（圖1）。

圖1 CTCC 與TMZ 協同抑制膠質瘤細胞增殖。A，各組細胞活力的柱狀圖；B 和C，各組細胞集落（B）和集落計數的柱狀圖（C）；D 和E，各組Ki-67（D）和PCNA（E）代表性免疫熒光圖；F—H，各組Ki-67 和PCNA 代表性Western blot 條帶（F）以及Ki-67（G）和PCNA（H）相對表達量的柱狀圖。比例尺，20 μm。與對照組比較：*P＜0.05 ；與CTCC 組或TMZ 組比較：#P＜0.05；n=3Fig. 1 CTCC and TMZ synergistically inhibit glioma cell proliferation. A, histogram of cell viability in each group; B and C, cell colonies of each group (B) and histogram of colony counts (C); D and E, representative immunofluorescence images of Ki-67 (D) and PCNA (E) in each group; F to H,representative Western blot bands for Ki-67 and PCNA (F) and relative expression levels of Ki-67 (G) and PCNA (H) in each group. Scale bar, 20 μm.P＜0.05, compared with Control group; #P＜0.05, compared with CTCC group or TMZ group; n=3

2 CTCC 與TMZ 協同促進膠質瘤細胞凋亡

與對照組比較，其余3 組細胞的細胞凋亡比例、TUNEL 陽性率以及Cleaved Caspase-3 表達均增加；其中CTCC+TMZ 處理組變化較CTCC 處理組和TMZ 處理組變化更為明顯（圖2）。

圖2 CTCC 與TMZ 協同促進膠質瘤細胞凋亡。A 和B，各組代表性TUNEL 染色圖（A）以及TUNEL 陽性率的柱狀圖（B）。C，Western blot 檢測各組Cleaved caspase-3 表達。D 和E，各組細胞凋亡的代表性流式細胞散點圖（D）以及凋亡率的柱狀圖（E）。比例尺，200 μm。與對照組比較：*P＜0.05；與CTCC 組或TMZ 組比較：#P＜0.05；n=3Fig. 2 CTCC and TMZ synergistically promote glioma cell apoptosis. A and B, representative TUNEL staining images (A) and histogram of TUNEL positive rates (B) in each group. C, Western blot of the Cleaved caspase-3 expression of each group.D and E, representative flow cytometry scatter plots of apoptosis (D) and histogram of apoptosis rates (E) in each group. Scale bar, 200 μm. *P＜0.05, compared with Control group; #P＜0.05, compared with CTCC group or TMZ group; n=3

3 CTCC 與TMZ 對線粒體去極化/Bcl-2/Bax 機制的協同調控作用

與對照組比較，其余3 組細胞的Bcl-2 表達均降低，而線粒體去極化、Cyt C 釋放和Bax 表達均增加；其中CTCC+TMZ 處理組變化較CTCC 處理組和TMZ 處理組變化更為明顯（圖3）。

圖3 CTCC 與TMZ 對線粒體去極化/Bcl-2/Bax 機制的協同調控作用。A 和B，各組JC-1 染色的代表性流式細胞散點圖（A）以及線粒體去極化率的柱狀圖（B）；C，Western blot 檢測各組細胞質中Cyt C 表達；D—F，各組Bax 和Bcl-2 代表性Western blot 條帶（D）以及Bax（E）和Bcl-2（F）相對表達量的柱狀圖。與對照組比較：*P＜0.05；與CTCC 組或TMZ 組比較：#P＜0.05；n=3Fig. 3 Synergistic regulation of CTCC and TMZ on mitochondrial depolarization /Bcl-2/Bax mechanism. A and B, representative flow cytometry scatter plots of JC-1 staining (A) and histogram of mitochondrial depolarization rates (B) in each group; C, Western blot of the expression of Cyt C in cytoplasm of each group; D to F, representative Western blot bands for Bax and Bcl-2 (D) and histogram of the relative expression levels of Bax (E) and Bcl-2 (F)in each group. *P＜0.05, compared with Control group; #P＜0.05, compared with CTCC group or TMZ group; n=3

討 論

腦膠質瘤為臨床腦腫瘤常見的惡性病變，具有較強侵襲性和病死率，患者預后不佳[1]。目前醫療技術尚無法實現腦膠質瘤完全治愈的效果，因此如何有效延長患者的生存期成為改善其預后的主要治療方向[4,5]。TMZ 為烷化劑類化療藥物，機體正常生理酸堿度水平下其能夠快速轉化為5-咪唑-4-酰胺，可阻斷腫瘤細胞的DNA 復制，且具有較高的血腦屏障通過率，對于顱內腫瘤治療有較佳效果[2]。但隨著TMZ 化療周期的延長，部分腦膠質瘤患者對其產生的抵抗作用逐漸增強，疾病控制率不佳[3]。因此臨床治療中應積極尋求有效聯合治療藥物，以進一步完善臨床治療方案，改善腦膠質瘤患者的化療效果，改善患者預后。

CTCC 已在臨床中用于多種腫瘤的治療或輔助治療[6-8]。近來研究還顯示，CTCC 還能增加如GP（吉西他濱和順鉑）化療方案對中晚期肺癌患者的療效并增強免疫功能[9,10]，增加BEV（貝伐珠單抗）+TC（紫杉醇+卡鉑）[11]或脂質體阿霉素[12]化療方案對復發性卵巢癌患者療效，等。但，CTCC 對TMZ在膠質瘤治療中的作用并不清楚。因此，本研究以體外膠質瘤細胞模型探討了CTCC和TMZ二者在膠質瘤細胞的化療中是否具有協同作用，結果顯示，相對于單用CTCC 或TMZ，二者聯用在U251 細胞的抑增殖和促凋亡中效果更為顯著，說明二者在抗膠質瘤中可能具有協同作用。本研究進一步探討了產生上述結果的可能原因。線粒體途徑機制在調控細胞增殖與命運的機制中占據著中心地位[13,14]。眾多研究[13-15]顯示，誘導線粒體去極化造成線粒體膜通透性改變，進而釋放Cyt C，改變Bcl-2/Bax 表達，最終能抑制下游促增殖蛋白如PCNA 和Ki67 表達，而促進凋亡蛋白執行者Caspase 3 的活化。本研究顯示，CTCC 和TMZ 二者聯用能增加線粒體去極化、降低Bcl-2 并增加Bax 表達，且下游PCNA 和Ki67表達降低和Caspase 3 的剪切，說明CTCC 和TMZ對膠質瘤細胞的化療協同作用至少與其促進線粒體凋亡途徑有關。

綜上所述，CTCC 和TMZ 在抑制膠質瘤細胞的增殖和促進細胞凋亡的中具有協同作用，其機制可能與其誘導線粒體凋亡途徑有關。