PD-1/PD-L1 參與骨髓間充質干細胞歸巢修復慢阻肺大鼠的肺損傷

林志鳳，王志紅*，陳燕輝，施佳恒，王宇瀟，徐忠敏，石永斌，林丹婕

（1 福建中醫藥大學中西醫結合學院，福州 350122；2 福建醫科大學省立臨床醫學院 福建省立醫院血液科，福州 350001；3 福建醫科大學臨床醫學部，福州 350000）

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease, COPD）作為一型常見的慢性肺部疾患，以進行性不完全可逆的氣流受限為主要特征，現有的臨床治療方案無法改善患者肺功能的長期下降和死亡率[1]。間充質干細胞（mesenchymal stem cells,MSCs）能分化成多種細胞類型，并用于再生肺實質和氣道結構，干細胞治療是一種有潛力恢復COPD患者肺功能和提高生活質量的治療策略[2]。然而，良好的歸巢能力是干細胞發揮治療作用的前提，歸巢效率的提高對于優化治療效果至關重要[3]。

程序性死亡蛋白配體 1（programmed death ligand-1, PD-L1）及其受體程序性死亡蛋白1 （programmed death-1, PD-1) 是免疫調節和免疫治療的關鍵分子，除了參與免疫應答外，表達于MSCs 上的PD-L1 參與MSCs 的遷移過程[4]，沉默膽囊癌細胞內 PD-1 基因能抑制細胞的侵襲轉移能力[5]，PD-1 與PD-L1 均被證明在細胞遷移過程中發揮重要作用。結合既往研究損傷肺組織中PD-1 表達增高[6,7]，MSCs 表達PD-L1[8]，本研究通過建立COPD 肺損傷大鼠模型，探討PD-1/PD-L1 在細胞遷移過程中的作用及對骨髓來源MSCs 歸巢作用的影響，以期為MSCs 的臨床治療提供一定的思路。

材料與方法

1 實驗動物

實驗用6～8 周齡SPF 級SD 大鼠，雌雄各半，體重120～150 g，用于造模及分離骨髓間充質干細胞，實驗動物購自福建醫科大學動物實驗中心（動物編號：SYXK 閩2012-001）。實驗前適應性飼養1 周，常規飼喂，自由進食、飲水，飼養環境溫度、濕度適宜，通風良好，所有實驗動物相關處置均按照動物實驗倫理要求進行。

2 主要試劑和儀器

DMEM 培養基、胰蛋白酶、胎牛血清（Gibco 公司）；熒光標記的單克隆抗體（eBioscience 公司）：CD34-PE、CD44-PE、CD29-FITC、CD45-FITC；綠色熒光蛋白(GFP)腺病毒載體（上海吉凱基因化學技術有限公司）；大鼠 PD-1 蛋白（Sino Biological）；抗PD-L1 抗體（BioXcell 公司）；丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成）；SOD 試劑盒（南京建成）；流式細胞儀（Bection Dickinson 公司）；倒置熒光顯微鏡（Olympus 公司）；酶標儀（Bio-Tek 公司）。

3 MSCs 的制備與鑒定

取SD 大鼠雙側股骨，充分暴露骨髓腔，取DMEM 培養基反復沖洗骨髓腔，收集沖洗液，離心后棄上清；加入含 10% 胎牛血清的 DMEM 培養基重懸細胞，以2×106個細胞接種于培養瓶，置于 37 ℃、5% CO2培養箱培養。原代細胞貼壁生長達80%左右時進行傳代，原代細胞記作P0，傳第一代記作P1，依次類推。取P3 代細胞，經胰酶消化后，制備成細胞懸液，分別加入CD34-PE、CD44-PE、CD29-FITC、CD45-FITC 的熒光標記抗體，并設置同型抗體對照，室溫下避光孵育30 min，應用流式細胞儀檢測MSCs 表面標志。向生長到融合度80%的P3 代細胞，分別加入成脂、成骨誘導培養基，21 d 后，油紅O 染色進行成脂鑒定，堿性磷酸酶染色進行成骨鑒定。

4 動物模型創建與評價

大鼠適應性喂養1 周后，采用煙氣暴露法，在染毒箱中全煙氣暴露2 h/d，10 支煙1 次，每支煙燃吸12 min，吸煙機抽吸頻率1 次/min，每周6 次，連續暴露4 個月，以制作大鼠COPD 模型，模型的制備由實驗室協助完成。觀察大鼠毛發、飲食、行動等結合丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）可用作COPD 模型評價指標[9]，根據相應試劑盒說明檢測正常及COPD 大鼠血清MDA 及SOD 含量。

5 MSCs 治療與療效評價

5.1 GFP 標記MSCs

取P3 代細胞行綠色熒光蛋白（GFP）標記，培養體系加入病毒液（Ad-GFP滴度為3.0×1010PFU/mL），以110 PFU/cell的劑量加入培養瓶中。每隔30 min振蕩1 次，共3 次。在熒光顯微鏡下觀察標記情況。GFP 轉染MSCs 后，以未標記的 MSCs 做對照，用流式細胞儀進行熒光標記率檢測。

5.2 GFP 標記MSCs 的歸巢

實驗分為正常和CODP 模型組，每組10 只，收集GFP 標記的MSCs，胰酶消化后計數，制成3×106的細胞懸液，經尾靜脈分別注射入正常和CODP 模型大鼠體內。于MSCs 注射后第7 d，戊巴比妥鈉麻醉處死大鼠，取出肺組織制作冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察GFP 陽性細胞的分布并拍照。按照每個部位 5 個視野，每只鼠共計數 5 個部位，計算每只鼠肺內綠色熒光信號數量，以x±s表示。

5.3 HE 染色觀察各組肺組織病理變化

實驗總共為3 組：①正常對照組，正常SD 大鼠通過尾靜脈給予生理鹽水，注射2 周；②COPD 模型組，通過尾靜脈給COPD 模型大鼠注射生理鹽水，注射2 周；③MSCs 治療組：通過尾靜脈給COPD模型大鼠注射MSCs 細胞，每周1 次，每次3×106個細胞，注射2 周。上述干預措施完成后，取大鼠肺臟一部分用作PCR 檢測各組肺組織中PD-1 mRNA的表達，另一部分制作石蠟切片，再行HE 染色，觀察各組病理變化。每張病理切片隨機選取5 個視野用數碼相機進行采像，并用Metamorph 圖像分析軟件（美國 Universal Imaging Corporation）分析肺組織結構的形態學變化，測量平均肺泡面積及肺泡吸光度（OD）值，并進行統計學分析。

6 PD-1 mRNA 在各組大鼠肺組織中表達的qRTPCR 檢測

實驗動物分為對照組、COPD 模型組和MSCs 治療組，取每組大鼠的一部分肺臟組織，將組織勻漿后采用Trizol 一步法提取組織總RNA，按照反轉錄試劑盒說明合成cDNA。以cDNA 為模板，進行PCR 擴增。2－△△Ct法計算目標引物 mRNA 的相對表達量。依據NCBI 數據庫中大鼠PD-1以及內參β-actin 基因序列，引物設計合成采用Primer5.0 引物設計軟件（表1）。

表1 RT-PCR 引物序列Tab.1 Sequences of primers for RT-PCR

7 MSCs 上PD-L1 mRNA 表達的RT-qPCR 檢測

取P3 代MSCs 和P3 代MSCs 培養上清液，用Trizol 一步法提取總RNA。按照反轉錄試劑盒說明合成cDNA，以cDNA 為模板，進行PCR 擴增 。2－△△Ct法計算目標引物 mRNA 的相對表達量。依據NCBI 數據庫中大鼠PD-L1 以及內參β-actin 基因序列，應用Primer5.0 引物設計軟件進行引物設計合成（表1）。

8 PD-1 和PD-L1 在MSCs 向肺遷移中作用的Transwell 分析

取P3 代的MSCs，經胰蛋白酶消化后，用無血清的DMEM/F12 培養基重懸，制備成2×106個/mL的細胞懸液，取200 μL 添加到上室。根據下室成分不同分為3 組：空白對照組，下室加入600 μL 完全培養基 ( 含10% 胎牛血清和 1%雙抗的 DMEM/F12培養基 )；PD-1 組：下室加完全培養基及PD-1 蛋白（2 ng/μL）；PD-L1 抗體組：下室加完全培養基及PD-1 蛋白（2 ng/μL），同時上室加PD-L1 抗體（2 ng/μL）。培養36 h 后，取出小室，棄掉培養液，用4%多聚甲醛固定15 min，PBS 清洗，用0.1%結晶紫染色3 ～4 h，PBS 清洗，用棉棒輕輕擦去小室內未穿過小室膜的細胞，晾干后于倒置顯微鏡觀察小室膜外層細胞，隨機選取5 個視野進行細胞計數并拍照，分析MSCs 的相對遷移數量。

9 統計學分析方法

軟件用SPSS 25.0，計量資料以x±s表示，兩組均數比較用兩獨立樣本t檢驗；多組間均數比較用單因素方差分析 (One-way ANOVA)，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜ 0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 MSCs 形態學觀察及鑒定

采用貼壁法培養的骨髓來源的MSCs，24 h 后部分細胞可見貼壁；3 ～4 d 后即可觀察到一些小的集落形成。原代細胞貼壁生長，呈長梭形，以多個克隆集落方式增長繁殖，7～14 d 即可觀察到克隆集落部分融合成片（圖1A）。傳代后的MSCs，細胞貼壁較P0 代培養的細胞快，24 h 即可觀察到細胞完全貼壁，形態與P0 代細胞相似，傳代后MSCs 均勻分布，形態呈單一的梭形。流式細胞儀檢測結果表明MSCs 上CD29、CD44 表達率較高（圖1D、E），CD34、CD45 表達率較低（圖1F、G）。加入成脂誘導培養基后21 d，油紅O 染色可見呈深橙紅色的脂滴（圖1B）；成骨誘導分化21 d 后，經堿性磷酸酶染色可見典型的成骨表現（圖1C）

圖1 MSCs 的培養及鑒定。A，MSCs 原代細胞成纖維樣集落方式增殖；B，MSCs 成脂誘導后油紅O 染色；C，MSCs 成骨誘導后堿性磷酸酶染色；D-G，MSCs 表面CD29（D）、CD44（E）、CD34（F）和CD45（G）表達的代表性流式細胞術檢測Fig. 1 Culture and identification of MSCs. A, fibroblast-like colony proliferation of MSCs primary cells; B, Oil Red O staining of MSCs after lipogenic induction; C, alkaline phosphatase staining of MSCs after osteogenesis induction; D to G, representative assay by flow cytometry of the expressions of CD29 (D), CD44 (E), CD34 (F) and CD45 (G) on the surface of MSCs

2 慢性阻塞性肺疾病模型鑒定

造模結束后，正常對照組大鼠精神狀態較好，毛發有光澤，呼吸平穩，無氣促，飲食及睡眠正常。COPD 模型組大鼠則出現精神萎靡，毛發干枯發黃，呼吸急促，咳嗽等癥狀，而且進食飲水量減少，睡眠質量較正常組欠佳。相對于正常組，COPD 模型組血清SOD 水平低于對照組，MDA 含量高于對照組（表2）。

表2 大鼠肺中超氧化物歧化酶活性和丙二醛水平的變化（n=8）Tab. 2 Changes of SOD and MDA levels in lungs of rats (n=8)

3 MSCs 在肺組織的示蹤及MSCs 輸注后病變肺組織的損傷修復

向MSCs 中加入攜帶GFP 的腺病毒， 3 h 后在熒光顯微鏡下開始出現稀少的微弱綠色熒光；24 h后大部分細胞被轉染，呈較強的綠色熒光。48 ～72 h 陽性細胞逐漸增多，MSCs 細胞幾乎全部轉染，并且強度增強，多為明亮的綠色熒光（圖2A），轉染效率約 80%左右，空白對照組未見熒光表達。GFP標記的MSCs 輸注至正常及COPD 模型大鼠后7 d，COPD 大鼠肺組織中綠色熒光蛋白標記的MSCs 明顯多于正常大鼠（圖2B、C，表3）。

圖2 GFP 標記MSCs 歸巢。A，轉染GFP 腺病毒 3 d 后的MSCs；B，正常大鼠肺內GFP 標記的MSCs；C， COPD 大鼠肺內GFP 標記的MSCsFig. 2 Homing of MSCs labeled with GFP. A, MSCs transfected with GFP adenovirus for 3 days; B, GFP-labeled MSCs in the lungs of normal rats; C,GFP-labeled MSCs in the lungs of COPD rats

表3 大鼠肺內MSCs 歸巢的定量分析（n=10）Tab. 3 Quantitative analysis of MSCs homing in the rat lungs (n=10)

對大鼠肺組織HE 染色顯示：正常對照組中肺泡大小均勻，肺泡壁無明顯增厚，肺泡腔干凈、勻稱，邊緣無大量炎細胞浸潤及部分肺間隔斷裂（圖3A）；在COPD 模型組中，鏡下見病變支氣管壁明顯增厚，增生的粘膜突向管腔，間質內可見大量淋巴細胞和漿細胞浸潤，同時管壁內有平滑肌束增生、肥大。觀察結果提示COPD 模型制備良好（圖3B）。MSCs 治療組中，與COPD 模型組比較，支氣管壁較之變薄，間質中淋巴細胞、漿細胞等慢性炎癥細胞減少，細支氣管和肺泡結構正?；?，新肺泡結構形成。COPD 模型肺組織平均肺泡面積較正常對照組明顯增大，OD 值明顯減少；MSCs 治療組平均肺泡面積較COPD 模型組明顯減小，OD 值明顯增大（表4）。結果提示，MSCs 治療后COPD 肺損傷有所改善（圖3C）。

圖3 大鼠肺組織病理變化HE 染色檢測。A，對照組；B，COPD 模型組；C，MSCs 治療組；比例尺，100 μmFig. 3 Examination by HE staining of lung tissue pathological change of the rats. A, Control Group; B, COPD Model Group; C, MSCs treatment Group;scale, 100 μm

表4 肺組織平均肺泡面積與OD 值定量分析（n=5）Tab. 4 Quantitative analysis of the average alveolar area and OD value of the rat lung tissues (n=5)

4 MSCs 治療減少COPD 模型大鼠肺組織中PD-1 mRNA 表達的上調

qRT-PCR 檢測顯示：COPD 模型組的肺臟組織PD-1 mRNA 表達水平較對照組明顯升高，MSCs 治療組大鼠肺組織中PD-1 mRNA 表達水平明顯低于COPD 模型組，與對照組相近（圖4）。

圖4 大鼠肺臟組織中PD-1 mRNA 表達水平的RT-qPCR 檢測。aP＜0.0001；bP＜0.0001；n=6Fig. 4 qRT-PCR detection of expression levels of PD-1 mRNA in the lung tissue of the rats. aP＜0.0001; aP＜0.0001; n=6

5 PD-L1 mRNA 在MSCs 的表達

qRT-PCR 結果顯示， MSCs 組的PD-L1 mRNA表達明顯高于MSCs 上清液組（P＜ 0.0001）（圖5）。

圖5 MSCs 上清液與MSCs PD-L1 mRNA 水平比較。Sup，MSCs 培養上清組；MSCs，MSCs 組；aP＜0.0001；n=8Fig. 5 Comparison of levels of PD-L1 mRNA in MSCs supernatant and MSCs. Sup, supernatant group; MSCs, MSCs group; aP＜0.0001; n=8

6 PD-1 促進MSCs 定向遷移（歸巢）

Transwell 實驗顯示：與對照組相比，PD-1 蛋白存在時，MSCs 遷移數量明顯增多；與PD-1 組相比，在PD-L1 抗體存在時，MSCs 遷移數量明顯減低（圖6，表5）

圖6 PD-1 及PD-L1 抗體對MSCs 遷移能力影響的結晶紫染色分析。A，對照組；B，PD-1 組；C，PD-L1 抗體組；比例尺，400 μmFig. 6 Crystal violet staining assay for the effect of PD-1 and PD-L1 antibody on the migration ability of MSCs. A, Control Group; B, PD-1 Group; C,PD-L1 antibody Group; scale, 400 μm

表5 PD-1 及PD-L1 抗體對MSCs 遷移能力影響的定量分析Tab. 5 Quantitative analysis of the effects of PD-1 and PD-L1 antibody on the migration ability of MSCs

討 論

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）是一種終生疾病，目前主要的治療手段包括戒煙、定期服藥、接受肺部康復訓練等，COPD 的癥狀有時會改善，然而，肺部受損永遠無法完全恢復正常[10]。MSCs具有免疫調節、抗炎、修復的功能[11]，已被證實在COPD 發生時能夠定向遷移到損傷肺部，并在受損的肺部分化為肺上皮細胞和內皮細胞等，發揮組織損傷修復作用，還能在損傷局部反應性分泌一些生長因子和細胞因子，這些因子可能起到治療甚至是中斷COPD進行性發展的作用[12]。本實驗結果表明，與COPD模型組相比，注射MSCs 治療后大鼠肺支氣管壁變薄，間質中淋巴細胞、漿細胞等慢性炎癥細胞減少，細支氣管和肺泡結構正常化，新肺泡結構形成。與過往研究結果一致[13,14]，本研究結果證實了MSCs治療COPD 的可行及有效性。然而，MSCs 歸巢到損傷部位的效率，很大程度上影響其治療作用的發揮。當前用于改善MSCs 歸巢的各種策略，包括遺傳修飾，細胞表面工程，MSCs 的體外啟動，特別是超聲技術的應用等[15]。對歸巢相關分子機制的了解，能幫助我們改善MSCs 的歸巢率。

MSCs 的歸巢是指其被“截留”在組織血管中，隨后穿越內皮細胞進入靶組織的過程，具體包括MSCs 與內皮細胞的活化-動員、MSCs 在血管內皮上結合-滾動、MSCs 向血管內皮黏附-穿越內皮細胞，最終進入靶組織[16]。MSCs 向損傷肺組織歸巢的部分原因是損傷組織釋放的一些趨化因子，同時表達特異性的受體或配體，引導MSCs 歸巢，此外MSCs 也會表達一些趨化因子受體，釋放一些細胞因子，在MSCs 歸巢過程中發揮作用。本研究發現，正常大鼠肺組織低表達PD-1，而COPD 肺組織高表達PD-1，同時對正常及COPD 大鼠同時輸注GFP 標記的MSCs，發現COPD 組大鼠肺部熒光信號明顯強于正常組，表明PD-1 高表達與MSCs 順利歸巢至肺組織存在一定的相關性。

本次實驗體外分離純化的MSCs 上有PD-L1 表達，因此我們提出設想，COPD 損傷肺組織中高表達的PD-1，可能作為一種趨化性刺激，從而促進MSCs的定向遷移過程，這一遷移過程，一定程度上依賴于肺組織中高表達的PD-1 與MSCs 表面的PD-L1 特異性結合而實現的。體外Transwell 遷移實驗結果顯示，與對照組相比，PD-1 存在時，MSCs 可向其定向遷移，當加入PD-L1 抗體后，由于MSCs 表面的PD-L1 與PD-L1 抗體結合被部分封閉，使與PD-1 結合的MSCs 表面暴露的PD-L1 減少，進而使MSCs遷移數目明顯降低。這也證實了PD-1 引起MSCs 定向遷移依賴于MSCs 的PD-L1 表達，這一遷移過程可被PD-L1 抗體特異性阻斷。以上均表明PD-1/PDL1 在參與MSCs 歸巢過程中發揮了一定的作用。

目前對于MSCs 定向歸巢以及PD-1/PD-L1 信號通路促進腫瘤發生免疫逃逸的相關研究較多，但關于PD-1/PD-L1 信號通路參與MSCs 定向歸巢的相關報道罕見。MSCs 歸巢是個復雜的過程，本次實驗證明PD-1/PD-L1 參與了MSCs 定向歸巢到COPD 大鼠肺部的過程，但具體是在MSCs 活化-動員，結合-滾動，還是黏附-穿越血管內皮細胞的哪個環節中發揮作用尚待進一步的研究。另外PD-1 在肺組織中高表達，具體是在肺的實質細胞還是肺內的免疫細胞中表達，后續可對COPD 肺組織中的細胞分離后進一步研究。

綜上所述，本研究證實體外PD-1 可促進MSCs定向遷移，當加入PD-L1 抗體封閉部分MSCs 上表達的PD-L1 后，MSCs 定向遷移明顯減少。相比于正常肺組織，高表達PD-1 的COPD 肺組織伴隨MSCs更高的歸巢率，本實驗提供了一個全新的角度，關于PD-1/PD-L1 在MSCs 歸巢過程中的作用。