益腎軟堅散對功能性失調子宮出血小鼠子宮內膜血管重塑的影響

楊冰琦，高麗敏，李永章，劉 霞

（1.河北省中醫院導管室，河北 石家莊 050011； 2.河北省中醫院泌尿外科，河北 石家莊 050011；3.河北省中醫院婦產科，河北 石家莊 050011）

功能性失調子宮出血 （dysfunctional uterine bleeding，DUB）簡稱功血，是一種婦科常見的癥狀和體征［1］，其發病率約11% ～13%［2］。DUB 是由于下丘腦-垂體-卵巢軸調節異常使神經內分泌系統功能紊亂從而導致的非正常性子宮出血［3］。DUB患者的臨床表現為月經周期延長，經量異常等，有時甚至出現陰道持續出血的現象［4-5］。DUB 降低女性的生活質量，并給患者帶來了沉重的醫療負擔。目前DUB 的發病機制還未清晰，而子宮內膜腺上皮和血管的再生是子宮內膜修復和脫落的主要機制［6］，但目前國內外關于改善DUB 子宮內膜血管重塑的分子機制研究鮮有報道。

中醫認為，腎虛血瘀、脾虛、血不歸經等是導致功能失調性子宮出血的主要誘因［7］，而活血化瘀軟堅散的多種有效成分已被證實具有健脾補腎、活血化瘀之效［8］，益腎軟堅散在臨床上對于治療DUB 有一定療效，但其研究還不是很深入，且分子機制尚不清楚。因此，本研究擬驗證益腎軟堅散對DUB 小鼠子宮內膜形態學變化及細胞凋亡，生殖內分泌激素水平的調節作用及其使子宮內膜血管重塑相關分子機制，以期為治療DUB 提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥物 參照張聰等［9］方法制備益腎軟堅散水煎劑，將丹參、炙鱉甲、生黃芪、全當歸、蟲草菌絲等8 味中藥藥材（北京同仁堂石家莊店，經河北省中醫院主任中藥師相聰坤鑒定為正品）常規水煎，濃縮為生藥量2 g／mL 的水煎劑。宮血寧膠囊（云南白藥集團股份有限公司，國藥準字Z20020087，規格0.13 g×18 粒）； 米非司酮、米索前列醇 （華潤紫竹藥業有限公司，國藥準字H20010633、H20000668，規格10 mg×2 s、0.2 mg×3 s）。TUNEL 凋亡試劑盒（江蘇凱基生物技術股份有限公司，批號KGA7071）； 一氧化氮（NO）、血管緊張素（Ang Ⅱ）、卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）、雌二醇（E2）、孕酮（P）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司，貨號A012-1-2、H185、H101-1-2、H206-1-2、H102-1、H089）； 免疫組化SP 法試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號SPN-9002）； DAB 顯色試劑盒（福州邁新生物技術開發有限公司，批號DAB-0031／1031）； 肌動蛋白（β-actin）、血管內皮生長因子（VEGF）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）、基質金屬蛋白酶-9 （MMP-9）、轉化生長因子-β（TGF-β）抗體（美國Cell Signaling Technology 公司，貨號4970、65373、98658、3852、3711）。

1.2 動物 46 只成熟未生育的C57BL／6 雌性小鼠，23 只C57BL／6 雄性小鼠，體質量18 ～20 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司［實驗動物生產許可證號SCXK （京）2019-0009］，獨立飼養在河北醫科大學 ［實驗動物使用許可證號SYXK （冀）2020-002］，環境溫度20 ～25 ℃，相對濕度（50±5）%。動物實驗已獲得河北醫科大學實驗動物福利倫理委員會批準（倫理號IACUCHebmu-2021042），并盡最大努力減少動物痛苦，減少實驗中的動物數量。

1.3 儀器 高速低溫離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司，型號H2050R）； 垂直電泳槽、電泳儀（北京君意東方電泳設備有限公司，型號JY-SCZ4＋、JY200C）；、水平脫色搖床（江蘇科析儀器有限公司，型號TY-80A）； 化學發光凝膠成像儀（上海天能科技有限公司，型號5200）； 高速低溫組織研磨儀（武漢賽維爾生物科技有限公司，型號KZ-III-F）； 超低溫冰箱（海爾集團公司，型號DW-86L386）； 全功能酶標儀 MK3 （美國Thermo Fisher Scientific 公司）。

1.4 分組、造模及給藥 參照呂小波等［10］方法，按照雌性小鼠與雄性小鼠2 ∶1 的比例合籠，次日8：00 檢查陰栓與陰道涂片，以發現精子為妊娠第1 天。隨機選擇32 只妊娠小鼠分為對照組、模型組、益腎軟堅散組和宮血寧膠囊組，每組8 只。造模組小鼠在妊娠第7 天8：00 灌胃米非司酮（8.3 mg／kg），18：00 灌胃米索前列醇（100 μg／kg），將棉球（60 ～65 mg）填入陰道內，次日檢查棉球有血漬表示建模成功，對照組灌胃等量生理鹽水。造模成功后第1 天，對照組和模型組灌胃生理鹽水，宮血寧膠囊組灌胃0.07 g／kg 宮血寧膠囊溶液，益腎軟堅散組參照文獻［9］報道換算成小鼠用量，灌胃28.9 g／kg 益腎軟堅散水煎劑，每天1次，連續給藥7 d。

1.5 HE 染色觀察子宮內膜組織形態學 妊娠第14 天，小鼠脫頸處死后，采集子宮內膜組織，固定于4%中性甲醛溶液中，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制備石蠟切片（4 μm），蘇木精與伊紅染色，于顯微鏡下觀察子宮內膜組織形態學變化及子宮內膜厚度變化，拍照并保存。

1.6 ELISA 法檢測血清FSH、LH、E2、P 水平和子宮內膜組織Ang Ⅱ、NO 活性 妊娠第14 天，小鼠脫頸處死后采集腹主動脈血液2 mL，2 000 r／min離心15 min，分離得血清，采用試劑盒檢測血清FSH、LH、E2、P 水平。采集子宮內膜組織后按照試劑盒說明書檢測Ang Ⅱ、NO 活性。

1.7 TUNEL 法檢測子宮內膜組織凋亡情況 取子宮內膜組織石蠟切片，置于染色缸中，用二甲苯浸洗2 次，每次5 min，使用TUENL 試劑盒染色，滴加50 μL TDT 酶反應液（置于冰上），于濕盒內37 ℃避光反應60 min，PBS 漂洗3 次，滴加50 μL Streptavidin-HRP 工作液，于濕盒內37 ℃避光反應30 min，PBS 漂洗3 次，每次5 min，滴加50 ～100 μL DAB 顯色10 min，PBS 漂洗3 次，蘇木素復染細胞核，流水沖洗，脫水后加抗熒光衰減封片液封片，熒光顯微鏡進行圖像采集。

1.8 免疫組化法檢測子宮內膜組織α-SMA 蛋白表達 取子宮內膜組織，按EnVision 試劑盒說明書對子宮內膜微血管內皮細胞進行α-SMA 免疫組化染色。首先在低倍鏡下（×200）全面觀察切片，找出高血管密度區，然后在高倍視野下（×400）記錄5 個視野的微血管數，取平均值。α-SMA 以細胞膜棕黃色為陽性，并測定各組平均光密度值作為陽性率。

1.9 Western blot 法檢測子宮內膜組織VEGF、bFGF、MMP-9、TGF-β 蛋白表達 取子宮內膜組織，提取蛋白，將蛋白質樣品經SDS-PAGE 凝膠電泳分離，轉移到PVDF 膜后，于5% 封閉液中（TBST 配制）封閉2 h，加入VEGF、bFGF、MMP-9、TGF-β、β-actin 抗體，4 ℃孵育過夜，次日加入用5% BSA 配制的相應二抗，室溫搖床孵育1.5 h，TBST 洗膜3 次后進行化學發光法顯影，采用Image J 軟件對圖像進行定量分析。

1.10 統計學分析 通過SPSS 20.0 軟件進行處理，計量資料以（±s）表示，各組間比較采用單因素方差分析，組間均數比較采用最小差數（LSD）法。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 益腎軟堅散對DUB 小鼠子宮內膜形態學變化的影響 如圖1 所示，與對照組比較，模型組小鼠子宮內膜上皮細胞增生，呈多層排列，較紊亂，部分上皮細胞變性壞死，見胞核固縮、崩解，胞質溶解，子宮組織內膜層變薄（P＜0.01），子宮內膜固有層基質細胞排列較緊密，基質細胞增生，較多炎性細胞浸潤，見中性粒細胞、漿細胞和淋巴細胞，提示造模后子宮內膜形態學變化為不同細胞數量增多，且伴有炎癥和壞死； 與模型組比較，益腎軟堅散組和宮血寧膠囊組子宮組織內膜、肌層和外膜結構清晰，子宮內膜上皮細胞排列較規則，子宮內膜固有層基質細胞增生，少量炎性細胞浸潤，主要見中性粒細胞，子宮腺結構正常，腺上皮細胞排列整齊，子宮組織內膜層變厚（P＜0.01），未見擴張，表明益腎軟堅散和宮血寧膠囊處理后子宮內膜的異常形態學變化得到改善。

圖1 益腎軟堅散對DUB 小鼠子宮內膜形態學變化的影響（x±s，n＝5）Fig.1 Effects of Yishen Ruanjian Powder on morphological changes of endometrium in DUB mice （x±s，n＝5）

2.2 益腎軟堅散對DUB 小鼠血清激素水平的影響 如圖2 所示，與對照組比較，模型組小鼠血清FSH、E2、P 水平升高（P＜0.01），LH 水平降低（P＜0.01）； 與模型組比較，益腎軟堅散組和宮血寧膠囊組小鼠血清FSH、E2、P 水平降低 （P＜0.05，P＜0.01），LH 水平升高（P＜0.05）。

圖2 益腎軟堅散對DUB 小鼠血清激素水平的影響（±s，n＝10）Fig.2 Effects of Yishen Ruanjian Powder on serum hormone level in DUB mice （±s，n＝10）

2.3 益腎軟堅散對DUB 小鼠子宮內膜組織凋亡的影響 如圖3 所示，與對照組比較，模型組小鼠子宮內膜組織細胞凋亡率升高（P＜0.01）； 與模型組比較，益腎軟堅散組和宮血寧膠囊組小鼠子宮內膜組織細胞凋亡率降低（P＜0.01）。

圖3 益腎軟堅散對DUB 小鼠子宮內膜組織凋亡的影響（×400，x±s，n＝5）Fig.3 Effects of Yishen Ruanjian Powder on endometrial apoptosis in DUB mice （×400，x±s，n＝5）

2.4 益腎軟堅散對DUB 小鼠子宮內膜血管重塑障礙的影響

2.4.1 益腎軟堅散對DUB 小鼠子宮內膜組織α-SMA 蛋白表達的影響 如圖4 所示，與對照組比較，模型組小鼠子宮內膜組織α-SMA 蛋白表達降低（P＜0.01）； 與模型組比較，益腎軟堅散組和宮血寧膠囊組小鼠子宮內膜組織α-SMA 蛋白表達升高（P＜0.01）。

圖4 益腎軟堅散對DUB 小鼠子宮內膜組織α-SMA 蛋白表達的影響（x±s，n＝5）Fig.4 Effects of Yishen Ruanjian Powder on endometrial α-SMA protein expression of DUB mice （x±s，n＝5）

2.4.2 益腎軟堅散對DUB 小鼠子宮內膜組織AngⅡ和NO 活性的影響 如圖5 所示，與對照組比較，模型組小鼠子宮內膜內組織Ang Ⅱ活性升高（P＜0.01），NO 活性降低（P＜0.01）； 與模型組比較，益腎軟堅散組和宮血寧膠囊組小鼠子宮內膜內組織Ang Ⅱ活性降低（P＜0.05，P＜0.01），NO 活性升高（P＜0.05，P＜0.01）。

圖5 益腎軟堅散對DUB 小鼠子宮內膜組織Ang Ⅱ和NO 活性的影響（x±s，n＝5）Fig.5 Effects of Yishen Ruanjian Powder on endometrial Ang Ⅱand NO activities of DUB mice （x±s，n＝5）

2.4.3 益腎軟堅散對DUB 小鼠子宮內膜組織bFGF、MMP-9、TGF-β、VEGF 蛋白表達的影響如圖6 所示，與對照組比較，模型組小鼠子宮內膜組織bFGF、MMP-9、TGF-β 蛋白表達升高 （P＜0.01），VEGF 蛋白表達降低（P＜0.01）； 與模型組比較，益腎軟堅散組和宮血寧膠囊組小鼠子宮內膜組織bFGF、MMP-9、TGF-β 蛋白表達降低（P＜0.05，P＜0.01），VEGF 蛋白表達升高（P＜0.05）。

圖6 益腎軟堅散對DUB 小鼠子宮內膜組織bFGF、MMP-9、TGF-β、VEGF 蛋白表達的影響（±s，n＝5）Fig.6 Effects of Yishen Ruanjian Powder on endometrial protein expressions of bFGF，MMP-9，TGF-β and VEGF of DUB mice （±s，n＝5）

3 討論

中醫學認為功血屬于“崩漏” 范疇，該病是由于脾氣虛弱、統攝無力、沖任失固、不能攝血從而導致的，如果崩漏日久，耗傷氣血，氣虛運血無力，氣虛血瘀致血不歸經，會進一步加重崩漏癥狀［11］。研究表明益腎軟堅散具有活血化瘀的功效，其主要成分菟絲子、夏枯草等對心血管循環系統發揮保護作用［12-13］，提示益腎軟堅散可能對改善血管重塑有促進作用。臨床研究表明益腎軟堅散對于治療子宮內膜囊腺型增生性功血有效果［14］。

功血的發病機制目前尚不清楚，現階段主要認為功血是由患者子宮內膜局部微環境改變及神經內分泌異常所致［15］。子宮局部微環境包括血管活性物質、生長因子、細胞外基質等，其中血管活性物質包括Ang Ⅱ、NO 等，生長因子包括VEGF、bFGF、MMP-9、TGF-β 等。研究表明Ang Ⅱ可誘導小鼠血管重塑，恢復彈性蛋白的表達［16］； miR-214 在血管平滑肌細胞（VSMCs）中建立了Ang Ⅱ誘導的AT1R 信號與TGF-β 誘導的TβRI／Smad 信號之間的串擾，從而在血管重塑中發揮著關鍵作用［17］； VEGF 可以誘導分泌和血管重構，促進血管生成［18］； MMP-9 在血管炎癥反應中表達上調，參與血管重構過程［19］； bFGF 和VEGF 的表達升高時會減輕炎癥反應，增加細胞增殖和血管生成［20］。當血管活性物質、生長因子及細胞外基質異常時會使血管擴張從而引起子宮局部微環境的改變導致子宮內膜出血［21］。神經內分泌異常會導致內分泌激素含量失衡從而引起功血，內分泌激素包括FSH、LH、E2、P 等。研究表明機體下丘腦-腺垂體-卵巢軸的持續反饋環節異常，會引起黃體生成素、卵泡刺激素、孕激素及雌激素含量比例異常進而引起功血［22］。

本研究發現，模型組小鼠子宮內膜上皮細胞紊亂排列，細胞外基質中較多炎性細胞分布，子宮內膜厚度變薄，Ang Ⅱ、NO 活性及VEGF、bFGF、MMP-9、TGF-β、α-SMA 蛋白表達異常，FSH、LH、E2、P 激素水平失衡，提示造模成功。而當給予益腎軟堅散干預后，子宮內膜上皮細胞排列變規則，炎性細胞變少，子宮內膜厚度變厚，血管活性物質Ang Ⅱ、NO 活性及FSH、LH 等內分泌激素水平及血管相關生長因子的表達趨于正常，表明益腎軟堅散對功血引起的小鼠子宮內膜形態學異常、子宮內膜血管重塑障礙及內分泌激素水平失調具有改善作用。另外，益腎軟堅散干預后DUB 小鼠子宮內膜組織細胞凋亡率降低，提示益腎軟堅散可以改善DUB 小鼠子宮內膜細胞凋亡情況。

綜上所述，益腎軟堅散可以改善DUB 小鼠子宮內膜形態學異常、子宮內膜血管重塑障礙及細胞凋亡現象，并可能通過下丘腦-腺垂體-卵巢軸調節生殖內分泌激素水平進而促進卵泡成熟及排卵。