柴胡疏肝散對卒中后抑郁大鼠行為學及腦區5-HT2A、BDNF 表達的影響

賈 奎，馮 龍，黃晨杰，李金耀

（新鄉醫學院第一附屬醫院，河南 衛輝 453100）

近年來，腦血管病發病率居高不下，嚴重影響人們身心健康。卒中后抑郁（post-stroke depression，PSD）繼發于腦卒中，是其重要的并發癥，具有發病率高、臨床癥狀改善率低等特點，臨床表現主要包括情緒低落、失眠多夢、快感缺失、興趣喪失、學習記憶能力下降、運動功能減退。PSD 可加快卒中后并發癥的發生發展，延緩甚至阻斷腦卒中的康復，如何早期干預 PSD 的發生具有重要意義［1-2］。

研究表明，PSD 的發生主要由原發內源性機制學說中的神經遞質相關因子介導［3-4］。作為單胺類神經遞質受體的5-HT2A 是一種抑制受體，激活其表達可降低神經元興奮性，其受體所在神經元在受到細胞水腫、壞死及凋亡的影響后會造成腦干與大腦皮質通路障礙，進而影響腦內情感調節，該因子也常用作衡量PSD 發生發展的重要指標［5］。腦源性神經營養因子 （brain-derived neurotrophic factor，BDNF）具有調節神經元的發育、分化、功能維持以及可塑性的作用，大腦中BDNF 含量降低常提示神經元營養供給的缺失，對神經元生長及功能分化有不可逆轉的加速作用［6］。現代藥理學關于柴胡疏肝散治療PSD 的靶點研究較少［7-9］。本研究通過檢測柴胡疏肝散干預PSD 大鼠抑郁樣行為及額前皮質與紋狀體區5-HT2A、BDNF 表達變化，驗證其對PSD 大鼠抑郁樣行為的改善及干預PSD發生發展的作用，探索柴胡疏肝散治療PSD 的靶點機制。

1 材料

1.1 動物 SPF 級成年雄性SD 大鼠54 只，體質量（250±10）g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司［實驗動物生產許可證號SCXK （魯）2019-0003］，飼養于室溫25 ℃、相對濕度55%條件下，自由攝食進水，自然晝夜節律光照，適應性飼養1周后用于實驗。本研究獲得新鄉醫學院第一附屬醫院實驗動物福利倫理委員會批準（倫理號EC-022-094）。

1.2 藥物 柴胡疏肝散由醋柴胡12 g、川芎9 g、陳皮9 g、醋香附9 g、麩炒枳殼9 g、赤芍9 g、炙甘草3 g 組成，購自中國北京同仁堂（集團）有限責任公司； 鹽酸氟西汀膠囊（規格20 mg／片，國藥準字H19980114）購自上海上藥中西制藥有限公司。

1.3 試劑 RNA 提取液、Servicebio ? RT First Strand cDNA Synthesis Kit、2×SYBR Green qPCR Master Mix （None ROX）、β-actin 抗體 （貨號G3013、G3330、G3320、GB12001，武漢賽維爾生物科技有限公司）； GAPDH 抗體、5-HT2A 抗體、BDNF 抗體 （貨號ab8245、ab66049、ab108319，英國Abcam 公司）。

1.4 儀器 實時熒光定量PCR 儀（新加坡Life 公司）； 全波長酶標儀（美國MD 公司）； 倒置熒光顯微鏡及成像系統（德國卡爾蔡司公司）； 曠場、Morris 水迷宮器材及行為學軟件SMAR3.0 （深圳市瑞沃德生命科技有限公司）。

2 方法

2.1 動物分組及模型建立 實驗前測定大鼠糖水偏好實驗（sucrose prefererce test，SPT）、曠場實驗（open-field test，OFT）及Morris 水迷宮實驗（water maze test，WMT）基線值，篩選評分相近的54 只入組。隨機分成空白組（9 只）、假手術組（9 只）、PSD 組（36 只），其中PSD 組分為模型組、柴胡疏肝散組、氟西汀組、聯合用藥組，每組9 只。PSD 組參照Longa 線栓法復制大腦中動脈阻塞（middle cerebral artery occusion，MCAO）模型，采用經右側頸總支動脈分叉處插入線栓，栓塞時長1.5 h，以阻斷右側大腦中動脈血流，制備大腦缺血再灌注 （ischemia／reperfusion，I／R）模型 （即腦卒中模型）。假手術組大鼠麻醉并暴露頸總動脈后不予處理并縫合切口，空白組不做處理。術后24 h 選取評分≥1 分且＜4 分（按照Longa 標準）的腦卒中模型大鼠，于術后第2 天，參照慢性不可預見的溫和性應激 （chronic unpredictable mild stress，CUMS）模型制備方法建立PSD 大鼠模型，①禁食20 h； ②禁飲17 h； ③45 ℃斜置鼠籠17 h；④持續照明17 h； ⑤電擊足底（電壓60 mV，間隔5 s 刺激1 次，每次持續10 s，共20 次）； ⑥4 ℃游泳5 min； ⑦水平搖晃5 min； ⑧行為約束2 h；⑨夾尾1 min。為避免大鼠對單一或有規律的應激刺激產生耐受性，PSD 組采用多種不可預知的刺激方法交替進行，并采用單籠飼養，以上9 種應激每天隨機采取1 種，共刺激4 周。

2.2 給藥 術后第28 天（即PSD 模型建立完成）開始給予藥物灌胃處理，模型組給予生理鹽水； 柴胡疏肝散組給予2 mg／kg 柴胡疏肝散混懸液； 氟西汀組給予12.5 mg／kg 氟西汀混懸液； 聯合用藥組給予柴胡疏肝散2 mg／kg＋氟西汀12.5 mg／kg 混懸液，灌胃體積5 mL／kg，每天固定時間灌胃1 次，連續4 周。

2.3 行為學實驗 實驗開始后，每周固定時間對大鼠進行體質量監測及卒中后抑郁行為學評分，包括蔗糖偏好率、曠場實驗、Morris 水迷宮實驗。

2.3.1 蔗糖偏好實驗 蔗糖偏好實驗是反映大鼠快感缺失的一種實驗，其損害是臨床PSD 的一個基本特征。蔗糖偏好實驗開始前禁食禁水20 h，并孤養每只大鼠，給予鼠籠左側1 瓶1%蔗糖水、右側1 瓶純水，監測1 h 內2 瓶水的消耗量。蔗糖偏好率＝ ［蔗糖水消耗量／ （蔗糖水消耗量＋純水消耗量）］×100%。

2.3.2 曠場實驗 曠場實驗反映了大鼠探索未知的興趣高低，其損害也是臨床PSD 的一個基本特征。實驗開始前1 h，將大鼠置于測試實驗室以適應環境。曠場實驗裝置為長100 cm、寬100 cm、高40 cm、內空的立柱體敞箱，以大鼠5 min 內運動距離作為曠場實驗活動得分。

2.3.3 Morris 水迷宮實驗 Morris 水迷宮實驗用來衡量大鼠學習記憶能力，其損害也是臨床PSD 的一個基本特征。該實驗裝置為一直徑約2 m 的圓柱恒溫游泳池，水深25 cm，水溫（24 ±1）℃，分為A 區、B 區、C 區、D 區及平臺。在大鼠適應性飼養1 周時間段內，同時進行Morris 水迷宮訓練，每個區作為一個階段的訓練，每個階段訓練3 次，A區、B 區、C 區、D 區共計4 個區域，總計訓練4 d。實驗記錄大鼠5 min 內越過平臺的次數，作為Morris 水迷宮實驗活動得分。

2.4 RT-qPCR 法檢測大鼠額前皮質及紋狀體區5-HT2A、BDNFmRNA 表達 采用RNA 抽提試劑盒提取腦組織額前皮質與紋狀體區標本總RNA，然后逆轉錄為cDNA，以GAPDH為內參進行PCR 擴增，然后對5-HT2A和BDNF基因進行半定量分析。PCR 擴增條件為95 ℃預變性10 min； 95 ℃變性15 s，60 ℃退火／延伸30 s，共40 個循環。熔解曲線反應條件為65 ℃升溫至95 ℃，每升溫0.5 ℃，采集1 次熒光信號。采用2-ΔΔCT法計算5-HT2A、BDNFmRNA 相對表達。通過 Primer Bank 引物設計網站設計引物序列，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2.5 免疫組織化學染色法檢測大鼠額前皮質及紋狀體區5-HT2A 及BDNF 陽性細胞表達 各組大鼠選取額前皮質與紋狀體區同一位置腦組織，于中性甲醛中固定24 h，石蠟包埋，作冠狀切片，每只大鼠選取3 張切片進行5-HT2A 及BDNF 蛋白免疫組織化學法染色。于顯微鏡下觀察額前皮質與紋狀體區5-HT2A 及BDNF 蛋白定位，通過Image pro plus 6.0 圖像分析軟件分析5-HT2A 及BDNF 陽性細胞表達。

2.6 Westren blot 法檢測大鼠額前皮質及紋狀體區5-HT2A 及BDNF 蛋白表達 行為學測試結束后處死大鼠，將大腦迅速移除，并剝離出海馬組織，立即用液氮冷凍。按照蛋白免疫印跡法依次進行組織總蛋白提取、蛋白濃度測定、蛋白變性、于-20 ℃冰箱保存備用； 隨后進行SDS-PAGE 電泳、轉膜（濕轉）、免疫反應、化學發光、凝膠圖像分析；最后將膠片進行掃描存檔，通過Alpha 軟件分析目標條帶的光密度值。

2.7 統計學分析 通過SPSS 26.0 軟件進行處理，當計量資料為正態分布時，以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，滿足方差齊性時，兩兩之間比較采用最小顯著差異法分析。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 柴胡疏肝散對PSD 大鼠體質量及抑郁樣行為的影響 表2 顯示，與假手術組比較，模型組大鼠體質量、蔗糖偏好率、曠場實驗運動距離、Morris水迷宮實驗穿越平臺次數降低（P＜0.01），表明PSD 模型成功建立； 與模型組比較，柴胡疏肝散組、氟西汀組和聯合用藥組大鼠體質量、蔗糖偏好率、曠場實驗運動距離、Morris 水迷宮實驗穿越平臺次數均升高（P＜0.01），表明柴胡疏肝散逆轉了CUMS 誘導的大鼠抑郁樣行為。

表2 柴胡疏肝散對PSD 大鼠體質量及抑郁樣行為的影響（x±s，n＝9）Tab.2 Effects of Chaihu Shugan Powder on body weight and depression-like behaviors in PSD rats （±s，n＝9）

表2 柴胡疏肝散對PSD 大鼠體質量及抑郁樣行為的影響（x±s，n＝9）Tab.2 Effects of Chaihu Shugan Powder on body weight and depression-like behaviors in PSD rats （±s，n＝9）

注：與假手術組比較，＃＃P＜0.01； 與模型組比較，**P＜0.01。

組別體質量／g蔗糖偏好率／%運動距離／m穿越平臺次數／次空白組529.56±27.1679.00±5.1797.73±7.326.89±1.05假手術組534.67±69.3277.33±6.3195.86±11.077.22±1.30模型組383.67±25.54＃＃48.33±4.58＃＃47.49±12.21＃＃3.11±1.76＃＃柴胡疏肝散組449.78±33.53**72.89±4.60**84.30±8.46**5.89±1.05**氟西汀組445.44±30.62**76.67±3.43**82.14±9.85**5.33±1.12**聯合用藥組463.89±21.50**76.67±5.07**88.81±8.46**5.78±1.39**

3.2 柴胡疏肝散對PSD 大鼠額前皮質及紋狀體區5-HT2A、BDNFmRNA 表達的影響 如圖1 所示，與假手術組比較，模型組大鼠額前皮質及紋狀體區5-HT2A、BDNFmRNA 表達均降低（P＜0.01）； 與模型組比較，柴胡疏肝散組、氟西汀組和聯合用藥組大鼠額前皮質及紋狀體區5-HT2A、BDNFmRNA表達均升高（P＜0.01）。

圖1 柴胡疏肝散對PSD 大鼠額前皮質及紋狀體區5-HT2A、BDNF mRNA 表達的影響（x±s，n＝3）Fig.1 Effects of Chaihu Shugan Powder on 5-HT2A and BDNF mRNA expressions in frontal cortex and striatum of PSD rats （x±s，n＝3）

3.3 柴胡疏肝散對PSD 大鼠額前皮質及紋狀體區5-HT2A、BDNF 陽性細胞表達的影響 如圖2 所示，與假手術組比較，模型組大鼠額前皮質及紋狀體區5-HT2A、BDNF 陽性細胞相對表達量均降低（P＜0.01）； 與模型組比較，柴胡疏肝散組、氟西汀組和聯合用藥組大鼠額前皮質及紋狀體區5-HT2A、BDNF 陽性細胞相對表達量均升高 （P＜0.01）。

圖2 柴胡疏肝散對PSD 大鼠額前皮質及紋狀體區5-HT2A、BDNF 陽性細胞表達的影響（×200，x±s，n＝3）Fig.2 Effects of Chaihu Shugan Powder on the expressions of 5-HT2A and BDNF positive cells in frontal cortex and striatum of PSD rats （×200，x±s，n＝3）

3.4 柴胡疏肝散對PSD 大鼠額前皮質及紋狀體區5-HT2A、BDNF 蛋白表達的影響 如圖3所示，與假手術組比較，模型組大鼠額前皮質及紋狀體區5-HT2A、BDNF 蛋白表達均降低（P＜0.01）； 與模型組比較，柴胡疏肝散組、氟西汀組和聯合用藥組大鼠額前皮質及紋狀體區5-HT2A、BDNF 蛋白表達均升高 （P＜0.01）。

圖3 柴胡疏肝散對PSD 大鼠額前皮質及紋狀體區5-HT2A、BDNF 蛋白表達的影響（x±s，n＝3）Fig.3 Effects of Chaihu Shugan Powder on the protein expressions of 5-HT2A and BDNF in the frontal cortex and striatum of PSD rats （x±s，n＝3）

4 討論

作為單胺類神經遞質受體之一的5-HT2A，源自于腦干中線中縫核的神經元，并上升投射在皮質、邊緣及中腦等區域，而紋狀體接受來自額前皮質區的纖維投射，主要協調各種精細復雜的運動［10-15］。Mitazaki 等［16］通過對大鼠注射抗精神病藥物的研究發現，額前皮質及紋狀體區5-HT2A 增加可改善神經發育模型大鼠的行為缺陷。BDNF 對神經元的生長發育起重要作用，能有效改善腦卒中患者的神經功能，是維持神經生存及正常生理功能所必需的蛋白質［17-18］。Zhang 等［19］研究發現，BDNF可作為預測腦卒中患者發生PSD 風險的生物標志物。柴胡疏肝散由醋柴胡、川芎、陳皮、醋香附、麩炒枳殼、赤芍、炙甘草等中藥組成，具有疏肝氣、解郁結、化痰濁、通腦竅、安神志等多種功效，具有較好的對癥PSD 的作用。李倩等［20］研究發現，柴胡疏肝散加減聯合經顱電刺激對PSD 患者的治療效果較好，可減輕PSD 患者抑郁、焦慮程度，增強上肢運動能力，提高認知功能。深入探討柴胡疏肝散是否通過增強5-HT2A 及BDNF 表達來改善卒中后抑郁樣行為，有助于明確其治療PSD的靶點。

PSD 臨床表現主要包括情緒低落、快感缺失、興趣喪失、學習記憶能力下降、運動功能減退、探索欲望減低等。本研究結果顯示，與空白組比較，模型組大鼠體質量、蔗糖偏好率、曠場實驗水平運動距離、Morris 水迷宮實驗穿越平臺次數減少，表明PSD 模型成功建立； 而柴胡疏肝散、氟西汀和聯合用藥后能提高體質量、蔗糖偏好率、曠場實驗水平運動距離、Morris 水迷宮實驗穿越平臺次數，表明這2 種藥物及其聯合用藥對大鼠行為學產生了良性影響，逆轉了CUMS 誘導的抑郁樣行為。本研究還發現，柴胡疏肝散、氟西汀和聯合用藥組大鼠額前皮質與紋狀體區5-HT2A、BDNFmRNA 表達、陽性細胞表達和蛋白表達較模型組升高，結合行為學結果可知，這2 種藥物及其聯合用藥可能通過增加額前皮質及紋狀體區5-HT2A 和BDNF 的表達進而逆轉CUMS 誘導的抑郁樣行為。同時，單用柴胡疏肝散對于PSD 大鼠體質量、抑郁樣行為及額前皮質與紋狀體區5-HT2A、BDNF 表達的改善作用不弱于氟西汀和聯合用藥組，提示柴胡疏肝散具有較好的單用治療優勢。

綜上所述，柴胡疏肝散可通過干預PSD 大鼠模型腦內神經遞質5-HT2A 及BDNF 蛋白因子的釋放改善卒中后抑郁樣行為，這可能為研究柴胡疏肝散對PSD 的作用機理提供了實驗依據。但本研究僅為動物實驗，柴胡疏肝散是否具有改善PSD 患者抑郁癥狀仍有待于進一步探討，本實驗也需進一步擴大樣本量，并對研究方案進行優化。