HPLC 法同時測定大籽蒿和細葉亞菊中5 種成分

謝雨宸，彭 芳，王 悅，易 歡，徐鑫梅，范 剛

（1.成都中醫藥大學藥學院，四川 成都 611137； 2.成都中醫藥大學民族醫藥學院，四川 成都 611137）

大籽蒿為常用藏藥材，在《晶珠本草》 《晶鏡本草》 等藏醫藥經典著作中均有記載，為五味甘露藥浴湯散、二味小檗湯散等藏藥復方的組成藥味［1-2］。大籽蒿具有清熱、解毒、止血、消腫、利腎等功效，可用于治療四肢關節腫脹、肺病、腎病、咯血、氣管炎、風濕痹痛等［3］。現代藥理研究表明，大籽蒿提取物具有抗炎、抗癌、抗菌、降血糖［4-5］等活性。課題組前期調查發現，部分地區藏醫院或藥材市場以細葉亞菊Ajaniatenuifolia（Jacquem.ex DC.）Tzvelev in Schischk.＆ Bobrov 替代大籽蒿ArtemisiasieversianaEhrhart ex Willd.使用。然而，2 種藥材在臨床上能否替代使用仍然缺乏足夠的科學依據。

目前，對于大籽蒿和細葉亞菊的化學成分定性和定量研究較少［6-7］，然而2 種藥材之間的主要化學成分是否有差異目前沒有研究報道。HPLC 法具有分析速度快、靈敏度高、適用范圍廣等特點，在藏藥質量控制及評價中發揮著重要的作用［8-11］。本研究采用HPLC 法首次建立大籽蒿和細葉亞菊中綠原酸、傘形花內酯、蘆丁、異綠原酸A、異綠原酸C 的含量測定方法，并比較兩者的差異，以期為大籽蒿的質量控制，以及細葉亞菊是否能替代大籽蒿入藥提供科學依據。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）； Sartorius BP121s 電子天平［賽多利斯科學儀器（北京）有限公司］； SB-4200DTD 超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；ULUP-I-10T 優普超純水機（成都超純科技有限公司）。

1.2 試劑與藥物 綠原酸（批號DSTDL002102）、傘形花內酯（批號DSTDQ006602）、異綠原酸A（批號 DSTDY054701）、異綠原酸 C （ 批號DSTDY003804）對照品購自成都德思特生物技術有限公司； 蘆丁（批號MUST-17111601）對照品購自成都曼思特生物科技有限公司，所有對照品純度均大于98%。甲醇、乙腈為色譜純； 其余試劑均為分析純； 水為超純水。

本研究共收集10 批大籽蒿和14 批細葉亞菊藥材，由成都中醫藥大學民族醫藥學院范剛教授鑒定分別為菊科蒿屬植物大籽蒿Artemisiasieversiana和亞菊屬植物細葉亞菊Ajaniatenuifolia的干燥地上部分。詳細信息見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結果

2.1 對照品溶液制備 精密稱取綠原酸、傘形花內酯、蘆丁、異綠原酸A、異綠原酸C 對照品適量，置于5 mL 量瓶中，加入甲醇制成質量濃度為0.898、0.526、0.894、3.402、0.584 mg／mL 的貯備液。精密量取上述貯備液各3 mL 置于25 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL 含綠原酸0.108 mg、傘形花內酯0.063 mg、蘆丁0.107 mg、異綠原酸A 0.408 mg、異綠原酸C 0.070 mg 的對照品溶液。

2.2 供試品溶液制備 取藥材粉末（過3 號篩）約0.2 g，精密稱定，置于100 mL 具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，稱定質量，超聲處理（功率480 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再次稱定質量，用50% 甲醇補足減失的質量，搖勻，過濾，取續濾液，即得。

2.3 色譜條件 CAPCELL PAK-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）； 流動相乙腈（A）-0.2%磷酸水（B），梯度洗脫（0 ～15 min，8% ～10% A；15～16 min，10% ～11%A； 16～20 min，11% ～14%A； 20～30 min，14% ～15%A； 30 ～40 min，15% ～17%A； 40 ～55 min，17% ～20% A； 55 ～65 min，20%A）； 體積流量1 mL／min； 柱溫30 ℃； 檢測波長290 nm； 進樣量10 μL。

2.4 專屬性試驗 取對照品，大籽蒿、細葉亞菊供試品適量，在“2.3” 項色譜條件下進樣測定，結果見圖1。由此可知，各成分在同一保留時間上有相應色譜峰，表明該方法專屬性良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.5 線性關系考察 精密量取對照品溶液0.5、1、2、4、8、10 mL，分別置于10 mL 量瓶中，加入甲醇定容至刻度，得到系列濃度的對照品溶液，在“2.3” 項色譜條件下進樣測定。以對照品質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，結果見表2，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表2 各成分線性關系Tab.2 Linear relationship of various constituents

2.6 精密度試驗 取同一份大籽蒿（批號DZH-4），按 “2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.3” 項色譜條件下進樣測定6 次，測得綠原酸、傘形花內酯、蘆丁、異綠原酸A、異綠原酸C 峰面積RSD 分別為0.10%、0.43%、0.17%、0.14%、0.71%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩定性試驗 精密吸取同一份供試品溶液（批號DZH-4），于0、1、2、4、8、12、24 h 在“2.3” 項色譜條件下進樣測定，測得綠原酸、傘形花內酯、蘆丁、異綠原酸A、異綠原酸C 峰面積RSD 分別為 0.13%、0.82%、0.27%、0.50%、1.75%表明溶液在24 h 內穩定性良好。

2.8 重復性試驗 取大籽蒿（批號DZH-4）6 份，按“2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.3”項色譜條件下進樣測定，測得綠原酸、傘形花內酯、蘆丁、異綠原酸A、異綠原酸C 含量RSD 分別為0.84%、1.18%、1.65%、1.21%、1.89%，表明該方法重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗 取各成分含量已知的大籽蒿粉末（批號DZH-4）6 份，每份0.1 g，精密稱定，精密加入各對照品適量，按“2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.3” 項色譜條件下進樣測定，計算回收率，結果見表3。

表3 各成分加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab.3 Results of recovery test of various constituents （n＝6）

2.10 樣品含量測定 取各批樣品粉末適量，按“2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.3” 項色譜條件下進樣測定，計算含量，結果見表4。

表4 各成分含量測定結果（mg／g，n＝2）Tab.4 Results of content determination of various constituents （mg／g，n＝2）

2.11 大籽蒿與細葉亞菊5 種化學成分的比較分析 將表4 的數據導入GraphPad Prism 5.0 軟件進行t檢驗，結果見圖2，可知2 種藥材中各成分含量均無顯著性差異（P＞0.05）。

3 討論

3.1 供試品溶液制備及色譜條件考察 本研究考察了超聲、冷浸、水浴回流提取方法，考察了乙醇、甲醇、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇等溶劑的提取效率，并對提取時間（20、30、40 min）及溶劑用量（20、50、100 mL）進行考察，最終發現以50 mL 50%甲醇超聲提取30 min 的效果最佳。此外，對流動相、色譜柱、檢測波長等進行了考察，根據5 種化學成分的分離度、對稱因子等確定了最佳的HPLC 色譜條件。

3.2 各成分含量測定結果分析 本研究首次建立了大籽蒿中5 種化學成分的HPLC 含量測定方法。結果表明，大籽蒿中綠原酸、傘形花內酯、蘆丁、異綠原酸A、異綠原酸C 的平均含量分別為3.61、0.71、1.46、8.74、1.44 mg／g，細葉亞菊中綠原酸、傘形花內酯、蘆丁、異綠原酸A、異綠原酸C的平均含量分別為2.60、0.26、0.79、6.31、1.22 mg／g，兩者皆以異綠原酸A 含量最高，綠原酸含量次之，而傘形花內酯的含量最低。現代藥理研究表明，異綠原酸A 和異綠原酸C 具有抗炎、祛痰等作用［12］，綠原酸具有抗氧化、抗菌、保護心血管等作用［13-14］，蘆丁具有抗炎、抗菌、抗氧化等作用［15］，傘形花內酯具有抗炎、抗氧化、免疫調節［16-18］等作用。這5 種成分的藥理活性與大籽蒿的功能主治密切相關，可能為其主要的活性成分，因此建立這5 種成分的含量測定方法對大籽蒿藥材的質量控制與評價具有重要的意義。

3.3 大籽蒿與細葉亞菊化學成分的比較分析 由于“同名異物” 和“同物異名” 現象、資源限制、不同地區用藥習慣差異等因素，藏藥在市場流通和臨床應用過程中常出現地區習用品或替代品［19］。課題組前期調查發現，部分藏醫院或藥材市場以細葉亞菊替代大籽蒿使用。然而，目前對于兩者在臨床上是否能等同使用仍然缺乏科學依據。本研究結果顯示，大籽蒿與細葉亞菊中5 種成分均無顯著性差異（P＞0.05），表明兩者具有相似的化學成分，這說明部分藏區用細葉亞菊替代大籽蒿入藥有一定的科學性。然而，本研究只比較了5 種主要化學成分，2 種藥材中其他成分是否有差異還需進一步的研究。今后需加強化學成分分離及定性定量分析研究工作。此外，也應采用藥理學研究方法評價2 種藥材的生物活性是否具有差異。通過化學成分和生物活性的比較，可多維評價2 種藥材的質量差異，為其臨床合理用藥提供參考依據。