乙醇-硫酸銨雙水相體系萃取香椿籽總黃酮工藝優化及其抗氧化活性研究

高慧娟，張佳奇，張樂樂，劉生杰，*

（1.阜陽師范大學生物與食品工程學院，安徽 阜陽 236037； 2.阜陽師范大學信息工程學院食品系，安徽 阜陽 236041）

香椿籽為楝科植物香椿Toonasinensis（A.Juss.）Roem.的種子，含有黃酮、多酚、萜類、多糖、揮發油等多種成分，具有抑菌、抗炎、抗氧化、抗腫瘤等生物活性［1］，其中黃酮是其發揮抗氧化、抗炎、抗病毒作用的主要物質［2］，該類化合物常用提取方法主要包括有機溶劑提取、超聲提取、酶解、CO2超臨界提取［3］，乙醇回流、超聲提?。?］、酶解協同超聲提?。?］等。雙水相技術根據物質在兩相中溶解度的不同而使目標物得到萃取和分離，具有提取率高、易于放大生產、可連續操作的特點，廣泛應用于生物活性物質［6］，其中乙醇／鹽雙水相系統因其黏度低、成本低，常用來提取純化黃酮類成分［7］。目前，雙水相法已應用于桃花、絞股藍、青果、沙蔥中黃酮類成分的提取，取得較好效果［8-12］，但迄今尚未涉及香椿籽總黃酮，故本實驗優化該成分乙醇-硫酸銨雙水相體系萃取工藝，并考察其抗氧化活性，以期為其開發利用提供參考。

1 材料

香椿籽產自陜西安康秦巴山區，經專家鑒定為正品。蘆丁對照品及分析純亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙醇、硫酸銨均購于西隴科學股份有限公司。維生素C 購于上海展云化工有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼、2，2-聯氮基-雙- （3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽均購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司； 過硫酸鉀購于上海沃凱生物技術有限公司。羥自由基試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

2 方法與結果

2.1 樣品處理 香椿籽在60 ℃下烘干至恒重，粉碎后過60 目篩，經石油醚脫脂、烘干、分裝后置于干燥器中保存。

2.2 方法學考察 稱取20.0 mg 蘆丁對照品，80%乙醇溶解定容至50 mL，作為對照品溶液，參考文獻［13］報道進行線性關系考察，得方程為Y＝6.11X-0.006 2 （R2＝0.999 6），在0 ～0.2 mg／mL范圍內線性關系良好。另外，精密度RSD 為6.47%，重復性RSD 為4.40%，30 min 內穩定性RSD 為1.26%，均滿足分析要求。

2.3 總黃酮提取 將一定量無水乙醇、硫酸銨用超純水溶解混勻，構建10 mL 雙水相體系，加入適量脫脂香椿籽粉末，超聲處理后3 500 r／min 離心10 min，測定上下相體積、吸光度，計算總黃酮萃取率，公式為萃取率＝ ｛1／ ［1 ＋1／ （R×K）］｝ ×100%，其中R＝V上相體積／V下相體積，K＝上相黃酮含量／下相黃酮含量，提取液旋轉蒸發濃縮后冷凍干燥，置于干燥器中密封保存。

2.4 單因素試驗 固定硫酸銨用量2.2 g，香椿籽用量0.2 g，300 W 超聲處理30 min，以無水乙醇體積（3.0、3.2、3.5、3.8、4.0 mL）、硫酸銨用量（1.8、2.0、2.2、2.4、2.6 g）、香椿籽用量（0.10、0.15、0.2、0.25、0.30 g）、超聲時間（10、20、30、40、50 min）為影響因素，按“2.3” 項下方法提取總黃酮并計算其萃取率，平行3 次。

2.4.1 乙醇體積 圖1 顯示，隨著乙醇體積增加總黃酮萃取率逐漸升高，為3.5 mL 時最高，之后反而降低。

圖1 乙醇體積對總黃酮萃取率的影響Fig.1 Effect of ethanol volume on extraction rate of total flavonoids

2.4.2 硫酸銨用量 圖2 顯示，隨著硫酸銨用量增加總黃酮萃取率先升后降，為2.2 g 時最高。

圖2 硫酸銨用量對總黃酮萃取率的影響Fig.2 Effect of ammonium sulfate consumption on extraction rate of total flavonoids

2.4.3 香椿籽用量 圖3 顯示，隨著香椿籽用量增加總黃酮萃取率先升后降，為0.2 g 時最高。

圖3 香椿籽用量對總黃酮萃取率的影響Fig.3 Effect of T.sinensis seeds consumption on extraction rate of total flavonoids

2.4.4 超聲時間 圖4 顯示，隨著超聲時間延長總黃酮萃取率先升后降，為30 min 時最高。

圖4 超聲時間對總黃酮萃取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on extraction rate of total flavonoids

2.5 響應面法 在單因素試驗基礎上，選擇乙醇體積（A）、硫酸銨用量（B）、香椿籽用量（C）、超聲時間 （D）作為影響因素，總黃酮萃取率（Y）作為評價指標，采用Design-Expert 10.0 軟件設計四因素三水平實驗，因素水平見表1，結果見表2。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

表2 試驗設計與結果Tab.2 Design and results of tests

采用Design-Exper 10.0 軟件對表2 數據進行擬合，得方程為Y＝93.312＋1.15A-0.04B＋0.422 5C-0.709 17D- 0.952 5AB- 0.125AC- 1.012 5AD＋0.555BC＋0.357 5BD＋0.127 5CD- 1.803 5A2-2.981B2-2.027 25C2-3.822 25D2，方差分析見表3。由此可知，模型P＜0.01，具有高度顯著性； 失擬項P＞0.05，表明方程擬合度較好，可用于分析預測； 各因素影響程度依次為乙醇體積＞超聲時間＞香椿籽用量＞硫酸銨用量。響應面分析［14］見圖5。

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

圖5 各因素響應面圖Fig.5 Response surface plots for various factors

2.6 驗證試驗 根據“2.5” 項下結果，確定最優工藝為乙醇體積3.612 1 mL，硫酸銨用量2.187 g，香椿籽用量0.204 g，超聲時間28.559 min，總黃酮萃取率為93.596%，考慮到實際情況，將其修正為乙醇體積3.6 mL，硫酸銨用量2.2 g，香椿籽用量0.2 g，超聲時間29 min，總黃酮萃取率為93.430%，與預測值93.596% 接近，表明該工藝穩定可靠。

2.7 抗氧化活性研究 準確稱取香椿籽粉末0.005、0.01、0.02、0.04、0.05 g，80%乙醇制成1、2、4、8、10 mg／mL 待測液，再配制不同質量濃度維生素C 溶液代替待測液作為陽性對照，檢測其對DPPH 自由基、羥自由基、ABTS 自由基的清除能力，結果見圖6。由此可知，維生素C 在較低質量濃度下對上述3 種自由基的清除能力隨著其劑量增加而升高，為0.5 mg／mL 時最強，最大清除率分別為96.83%、99.80%、86.73%。

圖6 維生素C 對不同自由基的清除能力Fig.6 Scavenging capacities of vitamin C on different free radicals

2.7.1 DPPH 自由基 參照文獻［13］報道，并稍作修改。向100 μL 不同稀釋度的待測液中加入100 μL 以80% 乙醇配制的0.1 mmol／L DPPH 溶液，室溫避光反應30 min，在517 nm 波長處測定吸光度A，再以等體積80%乙醇代替DPPH 溶液作為對照組，等體積80%乙醇代替樣品溶液作為空白組同法測定，平行3 次，計算自由基清除率，公式為清除率＝ ［1- （A樣品-A對照）／A空白］×100%。

2.7.2 羥自由基 按照羥自由基試劑盒方法進行測定，反應結束后在550 nm 波長處測定吸光度A，計算自由基清除率，公式為清除率＝ ［（A對照-A測定）／ （A標準-A空白）］×100%。

2.7.3 ABTS 自由基 參照文獻［13］報道，并稍作修改。分別配制7.4 mmol／L ABTS、2.6 mmol／L 過硫酸鉀貯備液，制備ABTS 工作液。吸取100 μL 不同稀釋度的待測液，與900 μL ABTS工作液充分混合10 s，避光反應6 min，在734 nm波長處測定吸光度A，再以80%乙醇代替待測液作為空白組同法測定，平行3 次，計算自由基清除率，公式為清除率＝ ［（A空白-A樣品）／A空白］×100%。

2.7.4 結果分析 圖7 顯示，總黃酮質量濃度為1～4 mg／mL 時對DPPH 自由基的清除能力有較明顯的劑量依賴性，為4 mg／mL 時最大（清除率93.68%），是維生素C 的96.75%，超過4 mg／mL后趨于平緩； 總黃酮質量濃度為1 ～2 mg／mL 時可大大提高對羥自由基的清除能力，高于2 mg／mL時程度減小，為 8 mg／mL 時最大 （清除率85.61%），是維生素C 的85.78%，但繼續增加時反而下降； 隨著總黃酮質量濃度增加對ABTS 自由基的清除能力逐漸加強，超過4 mg／mL 后程度趨緩，為10 mg／mL 時最大（清除率82.26%），是維生素C 的94.85%。

圖7 香椿籽總黃酮對不同自由基的清除能力Fig.7 Scavenging capacities of total flavonoids from T.sinensis seeds on different free radicals

3 討論

雙水相中醇類與黃酮分子有更強的氫鍵相互作用［7］，使乙醇相能更好地溶解黃酮，在一定范圍內增加乙醇體積分數時可提高分相能力，使上相極性變低，有利于總黃酮提取，但其過高時上相極性過低，該成分溶出減少，反而不利于提取［9-10，12，15］。當雙水相中乙醇添加量固定時，增加硫酸銨會競爭性結合更多水分子，本實驗發現，硫酸銨用量超過2.2 g 時乙醇相體積減少，導致乙醇體積分數過高，即上述雙重作用降低了總黃酮萃取率［6，8］。

長時間超聲既可能引起樣品中其他物質溶出，從而影響黃酮在上下相的溶出［16］，又會導致黃酮被氧化分解，不利于其提取［15，17-18］。雙水相體系中上、下相體積在固定的情況下總黃酮飽和能力基本穩定，其中上相由于對該成分有較強的溶出能力，更容易達到飽和； 下相遠沒達到飽和，會增加香椿籽添加量，使得該成分會繼續在下相溶出，從而改變其在上、下相的分配比例，導致上相萃取率有所下降，與肖連冬、池汝安等［17，19］報道一致。

黃酮類物質含有酚羥基，能以供氫體還原自由基，從而發揮抗氧化作用，減少自由基對機體細胞的毒性作用，并可通過減少體內氧化應激損傷來避免疾病發生、減緩衰老［20］?？寡趸钚詫嶒灠l現，香椿籽總黃酮對DPPH、ABTS、羥自由基均表現出較強的清除能力，與趙二勞、李光輝等［21-22］報道一致，程度依次為DPPH 自由基＞羥自由基＞ABTS 自由基，表明該成分可作為天然抗氧化劑開發利用，但其作用機制及在動物體內的抗氧化活性還有待深入研究。