昆葵保腎顆粒提取工藝優(yōu)化

田明鑫，倪昌榮，周洪亮，余江毅*

（1.南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029； 2.南京中醫(yī)藥大學，江蘇 南京 210029）

糖尿病腎病是糖尿病導致終末期腎臟病、心血管死亡的主要原因之一［1-2］，本病發(fā)病初期較隱匿，至中后期出現大量蛋白尿、腎功能衰竭等［3-4］。昆葵保腎方為江蘇省名中醫(yī)余江毅教授臨床經驗方，由黃蜀葵花、火把花根、黃芪、酒萸肉組成，具有減輕蛋白尿、保護腎功能、逆轉糖尿病腎病等作用，但本方還停留在臨床應用階段，無法大規(guī)模生產，故將其開發(fā)成醫(yī)療機構制劑。

目前，中藥提取工藝研究以選擇指標成分含量較高的工藝參數為主，并未與臨床湯劑進行比較，后者經多年臨床應用證實了其安全性、有效性，但一味地追求某一含量較高的工藝參數則忽略了中藥多成分之間的協(xié)同作用，并且往往采用砂鍋、陶罐進行煎煮，其工藝參數無法直接應用于多功能提取罐等工業(yè)化生產設備，故實現現代提取工藝與傳統(tǒng)制法的質量一致性是中藥制劑開發(fā)的關鍵［5-8］。本實驗采用Box-Behnken 響應面法優(yōu)化昆葵保腎顆粒提取工藝，以期為該制劑研發(fā)提供參考依據、技術支持。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1100 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）； BP-211D 電子分析天平 （德國賽多利斯公司）；SK6200H 超聲儀（上海科導超聲儀器有限公司）； HH-6 數顯恒溫水浴鍋（常州國華儀器制造有限公司）。

1.2 試劑與藥物 所有對照品均購于南京聚康醫(yī)藥化工有限公司，純度均≥98%，其中金絲桃苷批號220522，異槲皮苷批號220317，棉花皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷批號220421，表兒茶素批號220421，毛蕊異黃酮批號220405，毛蕊異黃酮葡萄糖苷批號220509，芒柄花苷批號220314，芒柄花黃素批號220314，莫諾苷批號220510，馬錢苷批號220412。黃蜀葵花 （批號220805，產地安徽）、酒萸肉（批號220801，產地河南）均購于馬鞍山井泉中藥飲片有限公司，火把花根（批號20220901-01，產地云南）、黃芪（批號20220801-01，產地甘肅）均購于貴州同德藥業(yè)股份有限公司，經南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院主任中藥師劉志輝鑒定為正品，符合2020 年版《中國藥典》 及地方標準要求。乙腈為色譜純（美國Tedia 公司）； 其余試劑均為分析純； 水為超純水。

2 方法與結果

2.1 臨床湯劑制備 依據《醫(yī)療機構中藥煎藥室管理規(guī)范》［9］及江蘇省中醫(yī)院草藥煎服須知，按處方比例稱取黃蜀葵花30 g、火把花根15 g、黃芪30 g、酒萸肉10 g，第一煎加水超過液面3～5 cm，浸泡30 min，煮沸后小火煎煮30 min； 第二煎加水至藥面，煮沸后小火煎煮20 min，紗布趁熱過濾，合并2 次煎液，混勻，即得。

2.2 指標成分含量測定 采用HPLC 法。

2.2.1 色譜條件 Agilent Poroshell 120 EC-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，4 μm）； 流動相乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脫（0～5 min，7%A； 5 ～22 min，7% ～17%A； 22 ～40 min，17% A； 40 ～55 min，17% ～60% A； 55 ～60 min，60% ～80%A； 60～70 min，80%A）； 體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃； 檢測波長240 nm； 進樣量10 μL。

2.2.2 對照品溶液制備 精密稱取各對照品適量，置于25 mL 量瓶中，甲醇定容，得到金絲桃苷、異槲皮苷、棉花皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、表兒茶素、毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花黃素、莫諾苷、馬錢苷對照品質量濃度分別為0.404、0.400、0.350、0.396、0.411、0.354、0.406、0.407、0.400、0.405 mg／mL 的貯備液，分別精密吸取適量，置于同一10 mL 量瓶中，甲醇定容，即得 （各成分質量濃度分別為27.742、15.520、34.645、6.178、0.122、2.195、0.811、0.070、15.185、8.347 μg／mL）。

2.2.3 供試品溶液制備 取臨床湯劑、各試驗號樣品各1 mL，置于10 mL 量瓶中，甲醇溶解定容至刻度，過0.22 μm 微孔濾膜，即得。

2.2.4 系統(tǒng)適用性試驗 取供試品、對照品溶液適量，在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定，結果見圖1。由此可知，對照品、供試品溶液在同一保留時間內有對應成分色譜峰，并且與相鄰峰之間的分離度較好（均大于1.5），表明該方法系統(tǒng)適用性良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖

2.2.5 線性關系考察 取“2.2.2” 項下對照品溶液適量，甲醇依次稀釋成6 個質量濃度，在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定。以對照品質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，結果見表1，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表1 各成分線性關系

2.2.6 精密度試驗 取“2.2.3” 項下臨床湯劑適量，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定6 次，測得莫諾苷、馬錢苷、表兒茶素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、金絲桃苷、異槲皮苷、棉花皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花黃素峰面積RSD 分別為1.40%、0.37%、1.94%、0.96%、0.36%、0.37%、0.30%、1.16%、2.02%、2.34%，表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗 取“2.2.3” 項下臨床湯劑適量，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，測得莫諾苷、馬錢苷、表兒茶素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、金絲桃苷、異槲皮苷、棉花皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花黃素峰面積RSD 分別為

2.15%、1.06%、2.03%、0.67%、0.84%、1.65%、1.09%、1.02%、2.81%、2.52%，表明溶液在24 h 內穩(wěn)定性良好。2.2.8 重復性試驗 按“2.2.3” 項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得莫諾苷、馬錢苷、表兒茶素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、金絲桃苷、異槲皮苷、棉花皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花黃素峰面積RSD 分別為2.17%、1.13%、1.83%、1.33%、0.93%、1.77%、1.58%、1.29%、2.11%、2.36%，表明該方法重復性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗 取臨床湯劑0.5 mL，共6 份，按100%水平加入對照品，按“2.2.3” 項下方法制備供試品溶液，在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，莫諾苷、馬錢苷、表兒茶素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、金絲桃苷、異槲皮苷、棉花皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花黃素平均加樣回收率分別為96.69%、96.18%、100.33%、99.63%、104.46%、100.79%、102.97%、100.23%、100.92%、100.10%，RSD 分別為2.42%、1.37%、2.18%、2.42%、1.49%、1.92%、2.02%、2.51%、2.29%、2.24%。

2.3 干膏率測定 取適量提取液至蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，置于105 ℃烘箱中干燥3 h 至恒重，再放到干燥器中冷卻30 min，精密稱定質量，計算干膏率，公式為干膏率＝ ［（浸膏質量×樣品總體積）／ （飲片質量×取樣量）］×100%。

2.4 提取工藝優(yōu)化

2.4.1 單因素試驗 影響提取效果的主要因素包括加水量、浸泡時間、提取時間、提取次數［10］，其中提取次數為非連續(xù)變量，不宜作為Box-Behnken 響應面法優(yōu)化的考察因素，故根據實際生產情況固定為2 次［11］。本實驗以加水量（6、8、10、12 倍）、浸泡時間（0、20、40、60 min）、提取時間（30、45、60、75 min）為影響因素進行單因素試驗，測定各指標成分含量、干膏率，計算其綜合評分，其中為第n（n＝1，2，3，…，17）個試驗樣品的i指標（指標成分含量、干膏率）與X實驗組i指標的比值，結果見圖2。由此可知，隨著加水量增加綜合評分呈升高趨勢，10 倍后趨于平緩，故以10 倍量水為中心點； 隨著浸泡、提取時間延長綜合評分呈升高-平緩-降低的趨勢，從實際生產中的節(jié)能省時角度出發(fā)，以20 min 為浸泡時間中心點，45 min 為提取時間中心點。

圖2 加水量（A）、浸泡時間（B）、提取時間（C）單因素試驗結果

2.4.2 Box-Behnken 響應面法 在單因素試驗基礎上，固定提取次數2 次，以加水量（A）、提取時間（B）、浸泡時間（C）為影響因素，綜合評分（M）為評價指標，采用Design-Expert 13.0 軟件建立三因素三水平試驗［12］，因素水平見表2，結果見表3。

表2 因素水平

表3 試驗設計與結果

將表3 數據導入Design-Expert 12.0 軟件進行多元二次回歸擬合，得方程為M＝1.430 0-0.049 9A-0.139 3B-0.008 4C-0.103 7AB-0.054 0AC＋0.255 7BC-0.598 7A2-0.323 9B2-0.563 2C2（R2＝0.985 6），方差分析見表4。由此可知，模型P＜0.01，具有高度顯著性； 失擬項P＞0.05，表明模型擬合度較高，誤差較小，可用于預測分析； 因素B、BC、A2、B2、C2有顯著或極顯著影響（P＜0.05，P＜0.01）。

響應面分析見圖3。由此可知，沿B 軸的坡度與沿A軸的相比較陡，表明提取時間對綜合評分的影響比加水量大； 沿A 軸的坡度略陡于沿C 軸的，表明與浸泡時間相比加水量對綜合評分的影響稍大； 沿B 軸的坡度大于沿C 軸的，表明提取時間對綜合評分的影響大于浸泡時間，與方差分析結果一致。采用Design-Expert 12.0 軟件，得到最優(yōu)工藝為加水量9.96 倍，煎煮時間41.46 min，浸泡時間18.80 min，結合實際生產需求，將其修正為加水量10 倍，煎煮時間40 min，浸泡時間20 min，綜合評分為1.447 分。

圖3 各因素響應面圖

2.5 驗證試驗 按“2.4” 項下優(yōu)化工藝制備3 批樣品，進行驗證試驗，結果見表5。由此可知，平均綜合評分為1.452 分，與預測值（1.447 分）接近（相對誤差＜1.0%），表明該工藝穩(wěn)定可靠，模型預測性良好。

表5 驗證試驗結果（n＝3）

3 討論

本實驗通過前期文獻調研及網絡藥理學研究，明確了昆葵保腎顆粒中10 種與糖尿病腎病密切相關的指標成分，其中黃蜀葵花中棉花皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、金絲桃苷、異槲皮苷可通過抑制NADPH／ROS／ERK 信號通路來改善大鼠腎小管間質纖維化［13-14］； 王麗娟等［15］研究表明，火把花根片可升高HGF 水平，下調TGF-β1 水平； 黃芪中毛蕊異黃酮可顯著下調DKD 小鼠腎組織中TNF-α、IL-1β 表達；芒柄花黃素可增加T2DM 大鼠腎組織SIRT1 表達，減輕腎臟損害［16-17］； 沈紅勝等［18-19］發(fā)現，馬錢苷、莫諾苷可降低RAGE 蛋白表達，抑制NF-κB 表達。然后，采用DAD 檢測器進行200～400 nm 全波長掃描，考察各成分色譜峰數目、峰形、分離度等參數，發(fā)現它們在240 nm 左右均有較好吸收，并且峰形較好，故選擇240 nm 作為檢測波長。

Box-Behnken 響應面法將體系的響應作為一個或多個因素的函數，通過圖形技術顯示函數關系，可直觀選擇試驗設計中的最佳條件［20-21］。目前，采用響應面法考察中藥復方提取工藝時選取的指標較少，難以反映中藥多成分內在本質。本實驗將各成分含量及干膏率共同納入綜合評分，更能反映中藥多成分相互協(xié)同發(fā)揮藥效的內在本質。

4 結論

目前，對中藥提取工藝的研究大多采用均勻設計、正交設計等方法，對浸泡時間、提取時間等參數進行多因素、多水平分析，從而優(yōu)化指標成分較多的工藝，雖然能增加提取效率，但難以保證臨床湯劑與制劑質量的一致性及臨床使用的安全性、有效性。本實驗優(yōu)化昆葵保腎顆粒提取工藝，可最大程度地與臨床湯劑昆葵保腎方保持一致，并且所用的Box-Behnken 響應面法穩(wěn)定可行，重復性良好，可為該制劑進一步研發(fā)提供參考依據、技術支持，也能為后續(xù)其他醫(yī)療機構中藥制劑提取工藝優(yōu)化提供思路。