新傷濕敷液醇提工藝優化

張喜利，梁慧慧，劉文龍*

（1.湖南中醫藥大學藥學院，湖南 長沙 410208； 2.中藥成藥性與制劑制備湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410208）

新傷濕敷液由鉆骨風、虎杖、紅花、白芍、黃芪、鐵箍散、千年健、尋骨風、見風消、小血藤等飲片組成，其療效顯著。本復方制劑是其乙醇浸提液制得的液體制劑，用濕藥液紗布敷于患處，可明顯減輕患者腫脹疼痛和縮短圍手術期。新傷濕敷液的傳統提取工藝為是采用75%乙醇浸漬20 d，此法效率低，且高醇度可能導致部分患者皮膚過敏。因此，提高產品生產效率、降低隱患十分重要。

采用質量源于設計（QbD）理念對制劑處方工藝進行優化時，可管理最終產品質量風險，提高生產效率，節約生產成本［1-2］，它以目標產品質量特性描述為起點，對藥物質量特性、有效性深入研究分析［3］。結合熵權結合變異系數法權衡浸膏得率與6 種有效成分含量指標，用以評價指標間的對比強度和沖突性為基礎，確定各指標的客觀權數［4-5］，同時采用魚骨圖分析法對影響新傷濕敷液醇提工藝的關鍵質量屬性的各類因素進行分析，篩選關鍵工藝參數，最后再擬合Box-Behnken 設計，篩選出最優新傷濕敷液醇提工藝［6］，以期為其臨床推廣應用奠定基礎。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 型高效液相色譜儀，配置Agilent 1260 型色譜分析工作站、UV 檢測器（美國Agilent 公司）；DZF-6020B 型真空干燥箱 （廣東宏展科技有限公司）；DZTW 電子調溫電熱套（北京市永光明醫療儀器有效公司）； RHP-400 型中藥粉碎機（永康市榮浩工貿有限公司）； 15B243 型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）； SHZ-DⅢ型真空式旋轉蒸發儀（鞏義市予華儀器有限責任公司）。

1.2 試劑與藥物 鉆骨風、虎杖、紅花等復方飲片均由湖南省常德市第一中醫醫院提供，經湖南中醫藥大學藥學院炮制教研室石繼連教授鑒定為正品。兒茶素、大黃素、原兒茶酸、羥基紅花黃色素、五味子醇甲對照品（純度≥98%，批號 P02A9F57645、T02S8F42983、H21J9Z64031、R03J10F77660、Y14F10H80840，上海源葉生物科技有限公司）； 馬兜鈴酸A 對照品（批號110746-201309，中國食品藥品檢定研究院）。甲醇、乙腈為色譜純 （美國天地公司）； 無水乙醇為分析純（湖南匯虹試劑有限公司）； 水為純凈水［華潤怡寶飲料（中國）有限公司］。

2 方法與結果

2.1 有效成分含量測定 采用HPLC 法。

2.1.1 色譜條件 ACQUITY UPLC? HSS T3 色譜柱（1.8 μm，2.1 mm×100 mm）； 流動相0.1% 磷酸 （A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～3 min，1% ～10%B； 3～6 min，10%B；6～9 min，10% ～25% B； 9 ～12 min，25% B； 12 ～15 min，25% ～40%B； 15～18 min，40%B； 18 ～21 min，40% ～50%B； 21～24 min，50% ～60% B； 24 ～27 min，60% ～10% B；27～30 min，10%B）； 柱溫30 ℃； 檢測波長210、254、300 nm； 進樣量1 μL。色譜圖見圖1。

圖1 供試品（A）、對照品（B）溶液HPLC 色譜圖

2.1.2 供試品溶液制備 取新傷濕敷液復方藥材30 g，研成較細粉末，用布袋包裝后，將藥物浸泡于75% 乙醇中（料液比1 ∶8），在干燥室溫環境條件下放置7 d，以上操作反復2 次，取2 次浸泡液合并混合，得新傷濕敷液浸提液樣品溶液。將樣品溶液濃縮揮近干后置入干燥箱中，60 ℃恒溫干燥至恒定質量得干浸膏。取0.050 g 干浸膏，使用色譜甲醇溶解并稀釋至0.010 g／mL，0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得供試品溶液，備用。

2.1.3 對照品溶液制備 分別取6 種對照品各約2 mg，精密稱定后用甲醇定容至10.0 mL，即得。

2.1.4 精密度試驗 取“2.1.3” 項下對照品溶液適量，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定6 次，測得原兒茶酸、兒茶素、羥基紅花黃色素、五味子醇甲、馬兜鈴酸A、大黃素色譜峰保留時間RSD 為0.552% ～1.296%，峰面積RSD 為3.118% ～7.908%，表明儀器精密度良好。

2.1.5 穩定性試驗 取“2.1.2” 項下同一供試品溶液適量，于1、2、4、6、8、12、24 h 在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，測得原兒茶酸、兒茶素、羥基紅花黃色素、五味子醇甲、馬兜鈴酸A、大黃素色譜峰保留時間RSD 為0.079% ～0.327%，峰面積RSD 為0.177% ～9.974%，表明溶液在24 h 穩定性良好。

2.1.6 重復性試驗 取同一批新傷濕敷液復方6 份，按“2.1.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，測得原兒茶酸、兒茶素、羥基紅花黃色素、五味子醇甲、馬兜鈴酸A、大黃素色譜峰保留時間RSD 為0.684% ～1.506%，峰面積 RSD 為0.568% ～9.228%，表明該方法重復性較好。

2.1.7 加樣回收率試驗 精密量取新傷濕敷液提取液1 mL，分別精密加入原兒茶酸、兒茶素、羥基紅花黃色素、五味子醇甲、馬兜鈴酸A、大黃素對照品溶液適量，加乙醇定容至10 mL，平行制備9 份，搖勻，過0.22 μm 微孔濾膜，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，進樣量10 μL，計算回收率。結果，原兒茶酸、兒茶素、羥基紅花黃色素、五味子醇甲、馬兜鈴酸A、大黃素平均加樣回收率分別為 99.88%、100.34%、99.53%、100.24%、99.75%、100.72%，RSD 分別為 1.43%、1.04%、1.42%、1.36%、1.82%、1.05%。

2.2 含量測定 精密稱取已干燥至恒定質量的干浸膏0.050 g，甲醇溶解并稀釋定容至5.0 mL，即得浸膏含量為0.010 g／mL 的供試品溶液，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，得到各供試品溶液的HPLC 色譜圖。結合6 種混合對照品的HPLC 色譜圖，分析其相對保留時間及對應的色譜峰峰面積，即可計算出樣品中有效成分的含量。

2.3 浸膏得率測定 精密稱取新傷濕敷液復方藥粉適量，使用乙醇回流提取法進行提取，得到相應的醇提液，將此醇提液使用真空旋轉蒸發儀揮去溶劑至濃稠液后，轉移至蒸發皿（已干燥至恒定質量）中，將此蒸發皿置入真空干燥箱，60 ℃恒溫干燥至恒定質量，將其冷卻至室溫后迅速精密稱定，得干浸膏質量，然后計算浸膏得率，公式為浸膏得率＝ （干浸膏質量／新傷濕敷液復方藥粉質量）×100%。

2.4 熵權法計算權重系數 熵權法是一種客觀賦權方法，在具體使用過程中，根據各指標數據的分散程度，利用信息熵計算出各指標的熵權，再對熵權進行一定的修正，從而得到較為客觀的指標權重。根據公式（1）進行無量綱處理，其中Xab是在第a次實驗中b指標試驗值，mb為該組指標中的最小值，Mb為該組指標中的最大值。再根據公式（2）建立偏離度矩陣P，其中n為成分數量； 根據公式（3）計算標準信息熵e； 根據公式（4）計算信息效用值；最后根據公式（5）將信息效用值歸一化，即可獲得各指標的熵權W1，W1b為第b項指標的權重系數，m為試驗指標個數。

2.5 變異系數法計算權重系數 根據公式（6）（7）計算各評價指標的權重W2，其中Sb是第b個指標的標準偏差，xab為第b個指標中的每1 個，是第b個指標的平均值。

2.6 熵權變異系數法耦合權重系數 根據最小信息熵原理，將通過傳統熵權法、變異系數法分別計算得到的權重進行耦合，根據拉格朗日乘子法［7］，按照公式（8）計算組合權重W。

2.7 QTPP 分析 以QbD 理念中的產品研發思路為指導，確定一些影響力較大的質量屬性為關鍵質量屬性。用風險評估魚骨圖法探究可能影響新傷敷濕液的質量風險因素，主要包括設備、環境和人員等不可控風險因素以及物料、處方配比和制備工藝等可控因素，初步對各因素潛在風險因素進行定性評估和標記，見圖2。

圖2 新傷敷濕液工藝質量關鍵因素魚骨圖

2.8 頭腦風暴法試驗篩選關鍵影響因素 通過對新傷敷濕液混懸液處方及制備工藝的分析，以料液比（X1）、乙醇體積分數（X2）、藥材粒度（X3）、藥材成分（X4）、堆積密度（X5）、提取次數（X6），提取時間（X7）、提取溫度（X8）為考察對象，以6 種有效成分含量與浸膏量作為評價指標，利用頭腦風暴法篩選出對新傷敷濕液性質影響較顯著因素考察，本實驗以提取時間，料液比和乙醇體積分數為自變量，以6 種有效成分含量及浸膏得率為因變量，篩選最優乙醇提取的工藝參數。所得實驗數據首先進行無量綱標準化處理，公式為標準化數據＝ ［（實測值-最低值）／ （最高值-最低值）］×100； 然后采用熵權變異系數法耦合權重系數計算6 種有效成分和浸膏得率的權重系數，以此評價新傷濕敷液醇提各工藝的優劣。

2.9 單因素試驗

2.9.1 乙醇體積分數 按新傷濕敷液處方配比稱取擬醇提的藥物30 g，分別加入60%、70%、80%、90%乙醇，料液比1 ∶10，提取時間1 h，按“2.8” 項下方法計算綜合評分，結果得70%乙醇體積分數的綜合評分最高，故將乙醇體積分數60%、70%、80%作為響應面設計的水平。

2.9.2 提取時間 按新傷濕敷液處方配比稱取擬醇提的藥物30 g，加入70%乙醇，料液比1 ∶10，提取時間分別為1、2、3、4 h，按“2.8” 項下方法計算綜合評分，結果得提取時間2 h 的綜合評分最高，故將提取時間1、2、3 h 作為響應面設計的水平。

2.9.3 料液比 按新傷濕敷液處方配比稱取擬醇提的藥物30 g，加入70% 乙醇，料液比1 ∶5、1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20，提取時間1 h，按“2.8” 項下方法計算綜合評分，結果得料液比1 ∶20 的綜合評分最高，故將料液比1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25 作為響應面設計的水平。

2.10 Box-Behnken 響應面法 參考文獻［8］報道。

在單因素試驗基礎上，以乙醇體積分數（A）、提取時間（B）、料液比（C）為影響因素，原兒茶酸、兒茶素、羥基紅花黃色素、五味子醇甲、馬兜鈴酸、大黃素含量及浸膏得率的綜合評分（Y）為評價指標，Box-Behnken 響應面法優化醇提工藝，因素水平見表1，結果見表2。

表1 因素水平

表2 試驗設計與結果

采用Design Expert 8.0 軟件［9］對表2 數據進行二次回歸擬合，得方程為Y＝89.53-6.23A＋5.68B＋3.81C＋2.11AB-1.74AC＋2.51BC- 10.15A2- 3.63B2- 2.89C2，方差分析［10-11］見表3。由此可知，模型F＝7.28，P＜0.05，具有高度顯著性； 失擬項P＞0.05，表明該模型穩定；R2＝0.903 5，＝0.779 4，表明該模型能解釋77.94%響應值變化，擬合程度較好，可用于分析預測； 各因素影響程度依次為A＞C＞B，即乙醇體積分數＞料液比＞提取時間。響應面分析［11］見圖3～5。

表3 方差分析

圖3 乙醇體積分數（A）、提取時間（B）對綜合評分的影響

圖4 乙醇體積分數（A）、料液比（C）對綜合評分的影響

圖5 提取時間（B）、料液比（C）對綜合評分的影響

最終確定，最優工藝乙醇體積分數67%，提取時間3 h，料液比1 ∶26，綜合評分為95.94 分。取3 批樣品，按上述優化工藝進行醇提，測得平均綜合評分為94.81 分，RSD 為2.51%，與理論值95.94 分接近，表明該工藝穩定可靠，可用于新傷濕敷液的臨床制備［12-14］。

3 討論

本實驗采用質量源于設計 （QbD）理念結合Box-Behnken 響應面法，通過考察新傷濕敷液復方的浸膏得率及有效成分的含量，優化了新傷濕敷液的工藝［15］。由于評價指標多，選擇熵權-變異系數法，使評價結果更具協調性、兼容性和科學性［16-17］。在對浸膏得率及有效成分含量影響較大的3 個因素中，乙醇體積分數是主要的影響因素，其次是料液比，在考察乙醇最佳體積分數的單因素實驗過程中，當乙醇體積分數達到90%時，提取得新傷濕敷液較為濃稠，猜測多為揮發油和酯類等成分，因新傷濕敷液使用時為紗布濕敷，而人體的皮膚角質層是類脂質分子形成的多層脂質雙分子層［18-19］，結構致密，無血管和淋巴管，故能有效透皮吸收的藥物成分主要為揮發油和酯類［20］，但90%乙醇提取效率較低，其浸膏得率和有效成分含量較低，而70%乙醇提取的藥液雖較為稀薄，但其浸膏得率和有效成分的含量較高，而且其與揮發油協同在一起發揮較強的透皮吸收的功效，故權衡多種因素，選用70%乙醇提取作為醇濃度單因素實驗的最佳條件。

在考察料液比的單因素實驗中，相同的提取液濃度和提取時間下，料液比越高，所提取得浸膏及有效成分越高。但料液比越高，對生產工藝的要求及生產所耗費的成本越高，故綜合多因素考慮，僅選用1 ∶20 料液比作為單因素實驗的最佳條件。而經過Design-Expert 8.0 軟件處理實驗數據所得到的最優工藝中料液比為1 ∶26。在生產工藝和生產成本允許的情況下，可考慮通過增加料液比，獲得更好的提取效率。