益腎化濕顆粒對MsPGN 大鼠腎組織TGF-β1 信號通路和ERK1／2 磷酸化的影響

許曉剛，張春江，付彥杰，董王鈺，楊曉萍

（石河子大學醫學院第一附屬醫院，新疆 石河子 832000）

在我國，腎小球腎炎仍是引起慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）的主要原因［1］。系膜增生性腎小球腎炎（mesangial proliferative glomerulonephritis，MsPGN）為原發性腎小球腎炎最常見的類型［2-3］，其以腎小球系膜細胞增生和細胞外基質積累為主要病理特征，隨著病情發展可出現腎小球硬化以及腎間質纖維化，并進一步進展至CKD乃至終末期腎病［4］。

目前，有關于MsPGN 的發病原因及進展機制尚未完全闡明，有研究指出，在MsPGN 大鼠腎組織中，TGF-β1、p-Smad2／3 及p-ERK1／2 表達升高［5-6］。TGF-β／Smads 信號通路在多種類型腎臟疾病中被認為是驅動腎小球硬化和小管間質纖維化的關鍵，是CKD 進展的核心［7］。ERK 作為MAPK 的家族成員之一，參與細胞的增殖、分化、遷移［8］，有學者認為活化的ERK1／2 是出現蛋白尿和腎小球硬化的主要上游中介［9］。因此，靶向TGF-β／Smads 和ERK 信號通路延緩腎臟病進展是MsPGN 的主要治療策略。

多項臨床研究表明，益腎化濕顆?？蓽p輕慢性腎小球腎炎患者尿蛋白，具有消腫及延緩腎功能惡化功效，然而其分子機制尚未闡明［10-11］。課題組前期研究發現，益腎化濕顆?？上抡{PI3K／Akt 信號通路降低MsPGN 大鼠蛋白尿，同時可延緩腎小球硬化及腎間質纖維化的進展，具體機制有待進一步闡明［12］。本研究旨在建立大鼠慢性抗Thy-1 腎炎模型探究益腎化濕顆粒是否介導TGF-β／Smads／ERK 通路活化參與MsPGN 的腎保護作用。

1 材料

1.1 動物 雄性SPF 級別SD 大鼠30 只，8 周齡，體質量200～250 g，購自新疆醫科大學動物實驗中心［實驗動物生產許可證號SCXK （新）2018-0002］，飼養環境為室內溫度22～26 ℃，相對濕度40% ～70%，自由飲水攝食。本實驗相關操作均通過石河子大學醫學院第一附屬醫院實驗動物倫理委員會批準［倫理號2022 倫審（151）號］。

1.2 藥物與試劑 益腎化濕顆粒（規格10g／袋，國藥準字Z20090250，廣州康臣藥業有限公司）； 纈沙坦分散片（規格80 mg／片，國藥準字H20090092，魯南貝特制藥有限公司）。兔抗大鼠Thy-1 多克隆抗體（貨號bs-0778R，北京博奧森生物技術有限公司）； 尿蛋白定量測試盒（貨號C035-2-1，南京建成生物工程研究所有限公司）； TGF-β1抗體（貨號ab215715，英國Abcam 公司）； 兔抗p-Smad2／3［貨號abs130992，愛必信（上海）生物科技有限公司］；Smad2／3 抗體、ERK1／2 抗體、p-ERK1／2 抗體、Fibronectin抗體、GAPDH 多克隆抗體、HRP-山羊抗兔二抗 （貨號BA1395、BM4326、BM4156、M00564-3、A00227-1、BM3894，武漢博士德生物工程有限公司）； 二氨基聯苯胺（DAB）、牛血清白蛋白（BAS）、ECL 發光液、RIPA 裂解液、蛋白酶抑制劑及磷酸化蛋白酶抑制劑（武漢賽維爾生物科技有限公司）。

1.3 儀器 光學顯微鏡（日本Olympus 公司）； 高速冷凍離心機、NanoDrop2000 核酸蛋白定量儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）； 凝膠成像系統（上海天能科技有限公司）；酶標儀、電泳儀、PCR 擴增儀（美國Bio-Rad 公司）。

2 方法

2.1 造模、分組及給藥 所有大鼠適應性飼養1 周后在麻醉下行左腎摘除術，術前禁食不禁水10 h，術后自由攝食水。單腎摘除1 周后隨機選取6 只大鼠經尾靜脈注射生理鹽水作為對照組，其余24 只大鼠參考文獻［13］報道，經尾靜脈注射2.5 mg／kg 的Thy-1 抗體復制慢性不可逆型大鼠腎炎模型。將抗Thy-1 腎炎大鼠隨機分為為模型組、纈沙坦（8.5 mg／kg）組和益腎化濕顆粒低、高劑量組（3.125、6.25 g／kg），每組6 只分籠飼養。益腎化濕顆粒溶于40 ℃生理鹽水配制成質量濃度為0.5 g／mL 的溶液； 纈沙坦分散片溶于40 ℃生理鹽水配制成質量濃度為2.0 mg／mL 的溶液。各給藥組灌胃給予相應藥物，對照組和模型組灌胃給予等體積生理鹽水，每天1 次，連續6 周。

2.2 一般情況觀察 觀察大鼠精神、活動度、飲水攝食情況、皮毛光澤度及體質量變化。計算大鼠體質量增速，公式為體質量增速＝ （處死前體質量-造模前體質量）／42。

2.3 尿蛋白定量檢測 造模后第7、14、28、42 天，采用代謝籠分別收集各組大鼠24 h 尿液，采用考馬斯亮藍法（CBB）測定尿蛋白水平。

2.4 血清肌酐、尿素氮水平檢測 給藥結束后，腹腔采血，離心取血清，于-80 ℃冰箱中保存，采用全自動生化分析儀檢測血清肌酐、尿素氮水平。

2.5 腎組織病理學檢測 給藥結束后處死大鼠，取右腎稱量濕重，部分腎組織置于-80 ℃冰箱冰凍保存； 其余部分腎組織于4%多聚甲醛中固定，脫水、透明后浸蠟，石蠟包埋并切片（厚度3.0 μm）。分別對切片進行HE、Masson染色，于顯微鏡下觀察并拍照； 采用Image J 軟件對采集的圖像進行半定量分析，估計腎小球內細胞核數，計算藍色染色面積并賦分評估腎組織纖維化程度（藍染面積≤5%記為0 分，5%＜藍染面積≤25%記為1 分，25% ＜藍染面積≤50%記為2 分，50%≤藍染面積＜75%記為3 分，藍染面積≥75%記為4 分），每只大鼠至少評估10 個腎小球。

2.6 免疫組化（IHC）染色檢測腎組織TGF-β1的分布及表達強度 石蠟切片常規脫蠟至水，EDTA 微波抗原修復后磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗，3% 過氧化氫（H2O2）室溫孵育10 min 清除內源性過氧化物酶活性，PBS 沖洗，BSA 室溫封閉20 min，加入TGF-β1一抗（1 ∶500），4 ℃孵育過夜，PBST 沖洗后加入二抗（1 ∶500），室溫孵育30 min，PBST 沖洗后DAB 顯色，自來水沖洗，復染細胞核，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，樹膠封片，于光鏡下觀察細胞漿或細胞膜出現棕色顆粒沉積為陽性。將采集圖片參考文獻［14］報道方法，應用Image J 軟件計算平均光密度值（AOD），以此評估TGF-β1染色面積及強度。

2.7 Western blot 法檢測腎組織TGF-β1、Smad2／3、FN 及ERK1／2 蛋白表達 取于-80 ℃冰箱中保存腎組織，剪取約50 mg 放入無酶EP 管中，加入RIPA 裂解液并在預冷研磨機中充分研磨至懸混液，12 000 r／min 離心30 min 后取上清液，采用BCA 法測定蛋白濃度后統一配平為2 μg／μL 的蛋白樣品，水浴鍋中煮沸10 min 使蛋白充分變性。取5 μL 樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離目的蛋白，轉至PVDF 膜，加入脫脂奶粉或BSA 封閉，加入TGF-β1（1 ∶ 1 000）、Smad2／3 （1 ∶ 500）、p-Smad2／3（1 ∶500）、FN （1 ∶1 000）、ERK1／2 （1 ∶500）、p-ERK1／2（1 ∶500）及GADPH （1 ∶1 000）一抗于4 ℃冰箱中搖床孵育過夜，TBST 溶液洗滌3 次，每次10 min，室溫下孵育二抗（1 ∶5 000）2 h，清洗后加入ECL 發光液并于暗室曝光。以GAPDH 為內參，應用Image J 軟件分析各組蛋白相對表達量。

2.8 RT-qPCR 法檢測腎組織TGF-β1、FNmRNA 表達 取于-80 ℃冰箱中保存腎組織，采用TRIzol 法提取總RNA，通過Nanodrop 儀器測定RNA 濃度，將其反轉錄為cDNA，按照試劑盒說明書配制25 μL 反應體系，進行PCR 擴增，反應條件為95 ℃預變性30 s，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，共循環40 次。以GAPDH為內參計算各組CT值，以2-ΔΔCT法計算TGF-β1、FNmRNA 表達。根據美國國家生物信息中心（NCBI）Primer-BLAST 設計引物，由美國Thermo Fisher Scientific 公司合成，序列見表1。

表1 引物序列

2.9 統計學分析 通過SPSS 22.0 軟件進行處理，符合正態分布的計量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 大鼠一般情況 實驗過程中無大鼠死亡。對照組大鼠精神狀態、活動性、皮毛光澤度、飲食情況以及大小便方面表現均良好； 模型組大鼠有不同程度的精神狀態不佳，食量、活動度及皮毛光澤度下降等情況，總體體質量增長率較對照組稍偏低； 而益腎化濕顆粒各劑量組大鼠隨著藥物干預進程，精神狀態、攝食積極性較前有明顯好轉，食量、活動度增加。如表2 所示，益腎化濕顆粒各劑量組體質量增長速率較模型組和纈沙坦組均升高（P＜0.05，P＜0.01）。

表2 各組大鼠體質量增速比較（x±s，n＝6）

3.2 益腎化濕顆粒對慢性MsPGN 大鼠24 h 尿蛋白定量的影響 如表3 所示，與對照組比較，模型組大鼠各時間點24 h 尿蛋白水平均升高（P＜0.01）； 與模型組比較，益腎化濕顆粒各劑量組和纈沙坦組隨著給藥時間推移，24 h 尿蛋白水平降低更明顯（P＜0.05，P＜0.01）； 與益腎化濕顆粒低劑量組比較，益腎化濕顆粒高劑量組和纈沙坦組大鼠24 h 尿蛋白水平降低更明顯（P＜0.05）。

表3 各組大鼠24 h 尿蛋白定量比較（mg，x±s，n＝6）

3.3 益腎化濕顆粒對慢性MsPGN 大鼠腎功能的影響 與對照組比較，模型組大鼠血清肌酐、尿素氮水平升高（P＜0.05）； 與模型組比較，益腎化濕顆粒各劑量組和纈沙坦組大鼠血清肌酐、尿素氮水平降低（P＜0.05），見表4。

表4 各組大鼠腎功能比較（x±s，n＝6）

3.4 益腎化濕顆粒對慢性MsPGN 大鼠腎組織病理變化的影響 如圖1A 所示，對照組大鼠腎小球結構基本正常； 而模型組大鼠腎組織主要呈現出不同程度且不可逆的系膜細胞增生及細胞外基質彌漫性增多的病理改變，部分腎小球內毛細血管受壓、管腔狹窄，出現廣泛膠原蛋白沉積，結合尿蛋白定量結果，提示本實驗慢性MsPGN 動物模型復制成功； 益腎化濕顆粒各劑量組和纈沙坦組大鼠腎組織系膜細胞及系膜基質異常增殖情況有一定程度的改善。

圖1 益腎化濕顆粒對慢性MsPGN 大鼠腎組織病理變化的影響（×400，±s，n＝6）

如圖1B～1C 所示，與對照組比較，模型組大鼠腎小球內核計數增加（P＜0.01），纖維化程度加重（P＜0.01）；與模型組比較，益腎化濕顆粒各劑量組和纈沙坦組腎小球內核計數減少（P＜0.01），纖維化程度減輕（P＜0.01）；與益腎化濕顆粒低劑量組比較，益腎化濕顆粒高劑量組和纈沙坦組腎組織病理損傷緩解效果更佳 （P＜0.05，P＜0.01）。

3.5 益腎化濕顆粒對慢性MsPGN 大鼠腎組織TGF-β1分布及表達強度的影響 如圖2、表5 所示，與對照組比較，模型組大鼠腎小管上皮細胞胞漿及腎小球系膜區呈現不同程度的棕色顆粒沉積，AOD 值較高（P＜0.01）； 與模型組比較，益腎化濕顆粒各劑量組和纈沙坦組大鼠腎組織TGF-β1表達強度降低（P＜0.01）； 與益腎化濕顆粒低劑量組比較，益腎化濕顆粒高劑量組和纈沙坦組大鼠AOD 值較低（P＜0.05）。

圖2 各組大鼠腎組織TGF-β1 免疫組化染色（×200）

表5 各組大鼠腎組織TGF-β1 AOD 值比較（x±s，n＝6）

3.6 益腎化濕顆粒對慢性MsPGN 大鼠腎組織TGF-β1、Smad2／3、FN 及ERK1／2 蛋白表達的影響 如圖3 所示，與對照組比較，模型組大鼠腎組織TGF-β1、p-Smad2／3、FN 及p-ERK1／2 蛋白表達升高（P＜0.01）； 與模型組比較，纈沙坦組和益腎化濕顆粒各劑量組大鼠腎組織TGF-β1、p-Smad2／3、FN 及p-ERK1／2 蛋白表達降低（P＜0.01）； 與益腎化濕顆粒低劑量組比較，益腎化濕顆粒高劑量組和纈沙坦組大鼠腎組織TGF-β1、p-Smad2／3、FN 及p-ERK1／2 蛋白表達降低（P＜0.05，P＜0.01）。

圖3 各組大鼠腎組織TGF-β1、FN、p-Smad2／3 及p-ERK1／2 蛋白表達（±s，n＝6）

3.7 益腎化濕顆粒對慢性MsPGN 大鼠腎組織TGF-β1、FNmRNA 表達的影響 如表6 所示，與對照組比較，模型組大鼠腎組織TGF-β1、FNmRNA 表達升高（P＜0.01）； 與模型組比較，纈沙坦組和益腎化濕顆粒各劑量組大鼠腎組織TGF-β1、FNmRNA 表達降低（P＜0.01）； 與益腎化濕顆粒低劑量組比較，益腎化濕顆粒高劑量組和纈沙坦組大鼠腎組織TGF-β1、FNmRNA 表降低（P＜0.05，P＜0.01）。

表6 各組大鼠腎組織TGF-β1、FN mRNA 表達比較（x±s，n＝6）

4 討論

隨著腎臟病學及腎臟病理學的發展，MsPGN 的病因機制越來越明確，非特異性情況下不再被描述為一種特定的腎小球疾病，而是許多腎小球疾?。ㄈ鏘gA 腎病、Ⅱ型狼瘡腎炎、感染后腎小球腎炎、IgM 腎病等）共通的病理損傷模式［15］。因此，對MsPGN 治療策略的研究可為一眾腎小球疾病的治療提供參考和依據。

臨床上，MsPGN 的基線治療主要是血管緊張素轉換酶抑制劑或血管緊張素受體拮抗劑，有CKD 進展風險時加用糖皮質激素、免疫抑制劑等［16］，考慮到上述藥物的局限性，越來越多的學者提倡中西醫結合治療慢性腎小球疾病。本研究結果顯示，益腎化濕顆粒可降低抗Thy-1 腎炎大鼠蛋白尿，減輕腎小球系膜細胞增殖、ECM 積累、腎小球硬化和腎間質纖維化等病理改變，表明益腎化濕顆粒對MsPGN 大鼠具有保護作用。

蛋白質能量消耗在CKD 患者中很常見，會隨著腎小球濾過率的降低而逐漸明顯［17］。同時，腎臟病營養指南表明低水平的身體質量指數是CKD1-5 期非透析者及CKD5D 期維持性血透患者死亡率升高的因素之一［18］。益腎化濕顆粒在臨床應用中表現出具有改善患者食欲的作用［19］。本研究發現，益腎化濕顆粒低、高劑量組大鼠體質量增長趨勢較纈沙坦組、模型組明顯，推測這與其降低大鼠蛋白尿、改善腎功并增加大鼠食欲相關，而增加體質量或許在一定程度上有助于延緩疾病進程。

越來越多的研究證實TGF-β1與腎臟纖維化關系密切［20］。在腎臟疾病中，TGF-β1激活經典的Smads 信號通路，在細胞核內調控促纖維分子的轉錄和翻譯，誘導肌成纖維細胞激活和ECM 蛋白合成［21］。本研究發現，模型組大鼠腎組織TGF-β1表達升高，下游p-Smad2／3 亦呈上調趨勢，免疫組化顯示TGF-β1集中表達在腎小管上皮細胞和系膜區，提示TGF-β1／Samds 信號通路參與了慢性MsPGN 纖維化進程。從蛋白和基因層面發現，益腎化濕顆粒可抑制抗Thy-1 腎炎大鼠腎組織TGF-β1、p-Smad2／3、FN 的表達。此外，TGF-β1還可調控非經典信號通路，如磷脂酰肌醇-3激酶，絲裂原活化蛋白激酶家族等［22］，后者主要包括ERK1／2，p-38 和JNK［23］。ERK 信號通路的活化參與腎小球系膜細胞的增殖及ECM 沉積［24］，與腎臟纖維化密切相關［25］。有研究指出ERK 可磷酸化Smad2 和Smad3 連接子區域殘基，調控Smad3 依賴的基因轉錄［26］，提示TGF-β1／Samds 與ERK1／2 之間存在環形信號交互。本研究發現，抗Thy-1 腎炎大鼠腎組織p-ERK1／2 表達升高，益腎化濕顆?？梢种艵RK 活化，提示益腎化濕顆粒可下調TGF-β1／Samds信號通路，抑制ERK1／2 磷酸化。

綜上所述，益腎化濕顆?？筛纳坡钥筎hy-1 腎炎大鼠蛋白尿，減輕系膜細胞增殖及細胞外基質積累，增加大鼠體質量，延緩腎功能進展，發揮腎保護作用，該作用可能與抑制TGF-β1／Smad2／3／ERK1／2 信號通路的活化相關。