HS-SPME-GC-MS 結合主觀嗅覺評價研究不同批次地龍腥臭氣特征性物質基礎

葉 慧，張定堃，韓 麗，劉 倩，阮世發，包曉明，高繼海，廖嘉寶*，許潤春*

［1.成都中醫藥大學藥學院西南特色中藥資源國家重點實驗室，四川 成都 611137； 2.華潤三九現代中藥制藥有限公司，廣東 深圳 518110； 3.島津企業管理（中國）有限公司，四川 成都 610023］

地龍為環節動物門鉅蚓科動物參環毛蚓Pheretima Aspergillum（E.Perrier）、通俗環毛蚓P.VulgarisChen、威廉環毛蚓P.Guillelmi（Michaelsen）或櫛盲環毛蚓P.PectiniferaMichaelsen 的干燥體［1］，性寒，味咸，歸肝、脾、膀胱經，具有清熱息風、通絡、平喘、利尿的功效，臨床常用于治療高熱神昏、驚癇抽搐、關節麻痹、半身不遂、肺熱喘咳、水腫尿少等癥，尤其對于小兒驚風、高熱抽搐、咳喘等兒科疾病療效顯著。但地龍藥材腥臭氣強烈，遇水更甚，臨床用藥時患者易出現惡心嘔吐等不良反應，服藥依從性不佳［2］，因此地龍腥臭氣問題亟待解決。

劉曉梅等［2］采用電子鼻和HS-GC-MS 技術發現地龍腥味物質基礎主要為醛類（異戊醛，2-甲基丁醛，異丁醛，2-乙基己醛，己醛）和胺類（三甲胺）。但該研究僅選擇了一批地龍作為研究對象，HS-GC-MS 監測成分較少（僅42 種），并缺少反映人體真實感受的主觀評價，主客觀評價之間的關聯性有待深入挖掘。

地龍藥源動物蚯蚓在我國分布比較廣泛，主產于我國東南地區，均處于自然的生長和繁殖狀態，不同產地的氣候、水質、微生物種群、飼養方式等差異必然會導致不同產地地龍品質差異。地龍的前處理也會導致地龍品質差異，地龍藥源蚯蚓采集后及時剖開腹部，除去內臟和泥沙，洗凈，曬干或低溫干燥即得到地龍飲片［1］。目前市場上普遍將地龍分級售賣，按照地龍剖開洗凈的開口程度分為統貨（不經處理的小地龍）、小開（開口約1／4）、中開（開口約地龍長度的1／3）、半開（開口1／2）、全開 （全部開口）。課題組在市場調研與生產實踐中，發現地龍均存在明顯腥臭氣，且不同批次地龍藥材腥臭氣差異明顯，存在部分批次地龍魚腥味重，或土腥氣重，或煙熏味重等情況。而這種腥臭氣差異將持續傳遞到地龍湯劑、配方顆粒或其他相關中成藥，影響臨床服用的順應性。因此，有必要明確地龍腥臭氣物質基礎及特征異味物質，針對特征異味物質的理化性質，開發高效的矯味技術。本研究采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用技術（headspace-solid phase micro-extraction gas chromatography mass spectrometry，HSSPME-GC-MS），結合志愿者感官評價對多批次地龍藥材的共有腥臭氣物質進行分析，旨在明確地龍代表性腥臭氣物質基礎，并定位不同批次地龍腥臭氣差異的特征性物質，為地龍去腥除臭研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器 TQ8050 三重四極桿氣質聯用儀 （日本Shimadzu 公司），配置PAL 加熱磁力攪拌模塊、數據分析軟件、Off-flavor-TQ-MS 數據庫，PAL SPME Arrow 固相微萃取進樣器、PAL SPME Fiber 固相微萃取進樣器（1.5 mm×120 μm × 20 mm，PN ARR15-DVB／C-WR-120／20CT；95 μm×10 mm，Carbon WR Fiber，PN FIB-C-WR-95／10； 瑞士思特斯分析儀器有限公司）； BT125D 型分析天平（十萬分之一，德國Sartorius 公司）； UPR-11-5T 型純水儀（四川優普超純科技有限公司）； HX-200K 型扣式中藥粉碎機（浙江省永康市溪岸五金藥具廠）。

1.2 藥材 11 批地龍藥材采購于成都荷花池藥材市場，樣品信息見表1，經成都中醫藥大學藥學院國家中藥種質資源庫高繼海副教授鑒定均為鉅蚓科動物參環毛蚓Pheretimaaspergillum（E.Perrier）的干燥體。

表1 樣品信息

2 方法與結果

2.1 地龍樣品制備 取S01 ～S11 號樣品適量，粉碎，收集能通過2 號篩而不能通過4 號篩的粉末，即得。

2.2 地龍腥臭氣味感官評價 經過培訓及篩選后，選擇身體健康、無鼻炎、嗅覺正常、無不良嗜好的12 名志愿者組成評定小組進行感官評定［3］。在評定前4 h，志愿者不得抽煙飲酒，不得食用具有嚴重氣味的食物，不得使用帶有氣味的化妝品、香水等［4］。本研究腥臭氣味評定采用5 分制，0 分：無腥臭氣味； 1 分：略有腥臭氣味； 2 分：腥臭氣味明顯； 3 分：腥臭氣味嚴重； 4 分：腥臭氣味極重； 5 分：無法忍受的腥臭氣味。稱取2 g 樣品裝于3 號樣品袋（100 mm×70 mm）內，密閉2 h，由志愿者對腥臭氣味進行評定并描述，評定結束后休息10 min，待志愿者嗅覺完全恢復后，再進行下一份樣品評定［4］。

由志愿者對S01 ～S11 地龍腥臭氣味進行評定并描述，結果見表2。結果顯示，魚腥味、煙熏味、發霉味、泥土味構成了地龍藥材主要氣味特征。S02、S03、S06、S10、S11 地龍魚腥氣明顯； S02、S07、S09、S11 地龍煙熏氣明顯； 11 批地龍發霉味、泥土味均不明顯。由志愿感官評價結果可知，11 批地龍總體氣味構成一致，但個別批次氣味特征突出。

表2 11 批地龍藥材氣味描述及腥臭氣評分（分，x±s，n＝3）

2.3 地龍腥臭氣味HS-SPME-GC-MS 分析

2.3.1 氣相色譜條件 InertCap Pure-WAX 毛細管柱（30 mm×0.25 mm×0.25 μm）； 進樣口溫度250 ℃，分流進樣，分流比5 ∶1，進樣口壓力83.5 kPa； 載氣高純氦氣，恒壓力模式； 吹掃體積流量3.0 mL／min； 程序升溫（初始溫度50 ℃，保持5 min，以10 ℃／min 升溫至250 ℃，保持20 min）； 柱平衡時間3.0 min。

2.3.2 質譜條件 離子源為電子轟擊源（EI）； 離子化能量70 eV； 離子源溫度200 ℃； 質譜傳輸接口溫度250 ℃；碰撞氣氬氣； MRM 監測模式，檢測器電壓相對于調諧結果＋0.3 kV，溶劑延遲時間1.16 min。質譜庫NIST17s、NIST17-1、NIST17-2［5］。

2.3.3 頂空-固相微萃取條件 精密稱取地龍藥材細粉0.1 g置于20 mL 惰性化頂空瓶內； 50 ℃平衡40 min。進樣前后，固相萃取頭在270 ℃老化裝置中自動老化3 min，通過聚四氟乙烯隔墊插入頂空瓶內，不接觸樣品，在50 ℃恒溫下萃取吸附10 min 后，抽出萃取頭，迅速插入在預運行狀態下的GC-MS 進樣口，于250 ℃條件下解吸2 min 后，進行GC-MS 分析［6］。

2.3.4 HS-SPME-GC-MS 分析結果 在 “2.3” 項下條件進樣。島津針對食品中的氣味成分專門開發了Smart MRM 氣味數據庫，包含對氣味影響的化合物 （約150種）、MRM／SIM 參數以及感官信息 （氣味特征和氣味閾值）等內容［7］。本實驗中目標化合物的定性是根據定性定量離子對確認，目標化合物的定量是根據島津Smart MRM 氣味數據庫的標準曲線來實現半定量分析［6］，采用面積歸一化法計算各成分的相對質量分數。11 批地龍中共檢出揮發性成分132 種，其中有醛類17 種、酮類18 種、酸類16 種、烴類17 種、酯類12 種、醇類19 種、酚類16 種、雜環類10 種、醚類2種、酰胺1 種、硫化物4 種等，典型的S11 地龍樣品MRM 監測總離子流圖見圖1。由于版面篇幅限制，本文并未列出所有揮發性成分，在下文中僅列出關鍵揮發性成分，見表3。

圖1 S11 地龍樣品揮發性成分HS-SPME-GC-MS 總離子流圖

表3 地龍共有腥臭氣物質的相對質量分數和平均ROAV

已知醛類物質由肉中多不飽和脂肪酸氧化產生，且閾值較低，具有魚腥味、脂肪味，是動物藥氣味特征的主要組成［8］，低等碳鏈（C1～C5）的飽和醛具有令人不適的刺激氣味，中等碳鏈（C6～C9）醛產生脂肪、苦或油膩氣味，碳數更高的醛有柑橘皮香味； C5～C7 （Z）-2-烯醛有新鮮的油漆或油灰的氣味； C8～C9 的2-烯醛有堅果、牛脂或黃瓜的香味［9-10］。因此，正己醛、正辛醛、（E，E）-2，4-庚二烯醛、（E，E）-2，4-壬二烯醛、（E）-2-庚烯醛、反式-2-壬醛對地龍腥臭氣的貢獻較大。酸類成分是地龍揮發性成分的重要組成，不僅普遍存在且含量較高，氣味描述均為腐臭、酸味、汗臭等難聞的異味，對地龍腥臭氣的貢獻較大。芳烴類是魚肉中的異味成分［9］，在地龍中含量不高，且閾值較高，對氣味形成貢獻不大，但某些芳烴化合物如甲苯、萘等化合物閾值較低，且會產生化學刺激性氣味［11］。醇類與酮類成分可能來自于脂肪氧化［12-13］，羰基化合物對肉制品氣味的形成具有極大作用，但上述成分中酮類氣味多描述為香氣，而醇類物質中以飽和醇居多，但其嗅閾值較高，除非濃度較高，否則對氣味貢獻不大。酯類成分含量不高，且多具香氣。酚類成分具有典型的煙熏風味成分［14］，對地龍氣味貢獻大。雜環類中2-甲氧基-3-異丁基吡嗪嗅閾值較低，可能是地龍氣味的主要成分； 硫醚類物質（二甲基二硫、二甲基三硫）具有嗅閾值低和強烈刺激性氣味的特點，是一類典型的腥臭氣物質［15］； 萘、甲基萘等物質具有焦油味、腐臭味等，也是不良異味的常見組成。根據實驗及參考文獻［2］報道，可判斷醛類、酸類、酚類、硫化物是地龍腥臭氣味的主要來源。

2.3.5 關鍵揮發性物質評價 采用相對氣味活度值（relative odor activity value，ROAV）分析各化合物對樣品的總體貢獻［16］。“嗅覺閾值” 是指人的嗅覺能感受到物質的最小刺激時的物質濃度或稀釋倍數［17］。在一定的條件下，嗅覺閾值越低，濃度越高，則氣味越易被感知，對整體氣味的貢獻越大［18］。采用ROAV 法確定地龍中關鍵揮發性氣味物質，首先采用氣味活度值（odor activity value，OAV）方法先確定對樣品風味貢獻最大的揮發性組分。氣味活度值即揮發性物質相對質量分數（C）與其嗅閾值（T）之間的比值，公式為，首先定義對樣品氣味貢獻最大的組分為ROAVmax＝100，對其他揮發性成分ROAV 進行計算，公式為式中Ci和Ti分別為各揮發性物質的相對百分含量和相對應的嗅覺閾值；Cmax和Tmax分別為對樣品總體氣味貢獻最大的組分相對百分含量和相對應的嗅覺閾值［18］。

所有組分均滿足0＜ROAV≤100，且ROAV 越大說明組分對樣品總體氣味的貢獻也越大。一般認為ROAV≥1 的組分為樣品的關鍵氣味物質，0.1≤ROAV＜1 的組分對樣品的整體氣味具有重要的修飾作用［18］。S01、S02、S03、S07、S09 的ROAVmax成分為間甲基苯酚，S04、S05 的ROAVmax成分為正己醛，S06、S10 的ROAVmax成分為二甲基三硫、S08、S11 的ROAVmax成分為2-甲氧基-3-異丁基吡嗪，以此計算11 批地龍的ROAV 和平均ROAV，并篩選ROAV＞0.1（3 批及以上地龍符合）、單個地龍ROAV≥1 以上的揮發性成分（即11 批地龍中普遍存在的關鍵氣味成分），定位關鍵氣味成分和氣味修飾成分，共得到59 種主要揮發性成分。通過Smart MRM 氣味數據庫中揮發性成分的氣味描述篩出構成地龍腥臭氣的主要成分，以揮發性成分在11 批地龍藥材中的平均ROAV 進行從大到小排序，結果見表3，共33 個腥臭氣成分，其中構成11 批地龍腥臭氣的關鍵成分為間甲基苯酚、2-甲氧基-3-異丁基吡嗪、二甲基三硫、正己醛、4-甲基苯酚、2-甲基異冰片、愈創木酚、仲辛酮、庚酸、2-茨醇、反式-2-壬醛，多散發塑料味、糞便味、土味、魚味、油脂味、煙熏味、發霉味、汽油味等不愉悅氣味；具有修飾作用的成分為2，3-二甲酚、2，6-二氯苯酚、己酸、α-蒎烯、4-甲基戊酸、抗氧劑264、2-氯-6-甲酚、芐基丙酮、乙酸、異戊酸、十二醛、4-甲基-3-戊烯-2-酮、正辛醛、4，5-環氧- （E）-2-癸烯醛、2-己酮、反式-2，4-癸二烯醛、2-甲基萘、格噢三鈱、2-甲基丁酸、丙酸、正癸酸、異丁酸。

2.4 主客觀相關性分析 Pearson 二元相關分析可以預測和解釋2 個變量之間的線性關系，從而得到2 個變量之間關系的性質和緊密程度。將多批次地龍中各類物質的相對質量分數與感官評價中3 種氣味評分導入IBM SPSS Statistics 26.0 軟件，選擇雙變量相關分析進行Pearson分析。

將表3 中腥臭氣成分相對質量分數與志愿者感官評分進行皮爾遜雙變量相關分析，結果見圖2。相關性分析結果顯示，魚腥味與二甲基三硫呈正相關 （P＜0.05，R＝0.724）； 煙熏味與異丁酸（P＜0.05，R＝-0.622）呈強負相關； 與間甲基苯酚（P＜0.01，R＝0.738）、4-甲基苯酚（P＜0.05，R＝0.809）、異戊酸（P＜0.05，R＝0.667）呈正相關； 發霉味、泥土味與2-氯-6-甲酚 （P＜0.05，R＝0.686）、2，3-二甲酚（P＜0.05，R＝0.700）、2-甲基丁酸（P＜0.05，R＝0.686）、2-甲氧基-3-異丁基吡嗪（P＜0.01，R＝0.790）、2-甲基萘（P＜0.05，R＝0.703）呈正相關。其中二甲基三硫、間甲基苯酚、4-甲基苯酚、2-甲氧基-3-異丁基吡嗪平均ROAV＞1，氣味貢獻度高，為腥臭氣差異的關鍵成分。

圖2 腥臭氣成分相對質量分數與感官評價的皮爾遜相關系數矩陣熱圖

3 討論

研究結果表明，地龍藥材普遍存在腥臭氣味，HSSPME-GC-MS 明確了不同批次地龍共有腥臭氣物質基礎，關鍵腥臭氣物質為間甲基苯酚、2-甲氧基-3-異丁基吡嗪、二甲基三硫、正己醛、4-甲基苯酚、2-甲基異冰片、愈創木酚、仲辛酮、庚酸、2-茨醇、反式-2-壬醛，氣味描述與感官評價基本一致。志愿者感官評價發現個別批次地龍藥材腥臭氣突出，通過腥臭氣成分含量與感官評分的皮爾遜雙變量相關性分析發現，二甲基三硫、甲基苯酚（間甲基苯酚和4-甲基苯酚）、2-甲氧基-3-異丁基吡嗪分別是地龍魚腥味、煙熏味、發霉味、泥土味的關鍵特征性異味物質。

地龍腥臭氣特征物質可能主要來源于：（1）地龍自身轉化：地龍中富含蛋白質、氨基酸、核苷等成分，氨基酸發生脫氨基、脫羧基作用形成中間體和小分子，如吲哚、腐胺、酪胺、組胺、脂肪酸等，進而生成硫化氫、甲烷、氨、硫醇等［12］。尤其是在含硫氨基酸半胱氨酸的存在下，形成了許多雜環產物，例如吡嗪和甲基吡嗪、甲基噻唑等［19］。酪氨酸可能在微生物作用下生成4-甲基苯酚，地龍中的甲基苯酚可能來源于酪氨酸轉化［20］。地龍成分如蛋氨酸，是硫醚類物質產生前體。（2）生長環境及加工過程帶入：地龍藥源蚯蚓是腐食生物，生活在潮濕疏松的土壤中，以含有機物腐殖質土及分解產物為食，故體內積存了大量泥沙［21］。而二甲基三硫、甲基苯酚（間甲基苯酚和4-甲基苯酚）、2-甲氧基-3-異丁基吡嗪均是水體、土壤中常見的臭味物質。二甲基三硫作為地龍魚腥味的特征性物質，也是為沼澤／腐敗氣味的主要來源，中國東南地區（地龍主產區）水域可檢測到高濃度硫醚類物質［22-23］。水體中也常出現酚類污染，常造成魚類的“酚臭味”，可能是地龍中甲基苯酚的來源之一［24］。

因此，針對地龍中特征異味物質的理化性質、環境來源及生物轉化途徑，可開發不需輔料、炮制矯味的高效矯味方法。本研究通過明確地龍共有腥臭氣物質基礎及特征異味物質，為地龍去腥除臭提供新思路，為動物藥的腥臭氣研究提供參考。課題組將針對地龍不同氣味的特征物質進一步開展矯味方法研究。