暖宮七味散中揮發(fā)性成分超臨界CO2 提取及定性定量研究

高彥全，劉衛(wèi)東，梁國棟，李慧慧，彭佩瑾，王少峽，劉志東，祁東利*

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)組分中藥國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 301617； 2.天津中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥發(fā)現(xiàn)與制劑技術(shù)教育部工程研究中心，天津 301617； 3.天津中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，天津 301617； 4.內(nèi)蒙古大唐藥業(yè)股份有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 01001； 5.內(nèi)蒙古自治區(qū)蒙藥新藥企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 01001）

暖宮七味散是蒙古族傳統(tǒng)特色方藥，出自《觀者之喜》，由白豆蔻，肉豆蔻，丁香，沉香，天門冬，手掌參和黃精組成，具有抑制心、腎赫依，調(diào)經(jīng)養(yǎng)血，暖宮止帶等功效，現(xiàn)代臨床常用于治療婦科痛經(jīng)、月經(jīng)不調(diào)、更年期綜合征、不孕不育等癥［1-3］。暖宮七味散質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究薄弱（ 《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》 蒙藥分冊ZZ8423），有學(xué)者［4-5］分別采用氣相色譜法和高效液相色譜法測定了暖宮七味散中桉油精和丁香酚含量，此外，巴根那等［6］補(bǔ)充了白豆蔻、肉豆蔻、丁香、沉香的薄層色譜鑒別； 侯峰等［7］增加了顯微鑒別、氣相色譜法鑒別豆蔻中桉油精及測定方中總丁香酚含量。

白豆蔻和肉豆蔻化濕行氣、醒脾開胃［8-9］； 丁香溫中降逆、補(bǔ)腎助陽［10］； 沉香行氣止痛、溫中止嘔［11］。揮發(fā)性成分為其主要藥效物質(zhì)，如豆蔻揮發(fā)油具有抗氧化、抗菌、鎮(zhèn)痛等藥理作用； 丁香酚等酚類物質(zhì)具有抗炎、保護(hù)肝腎損傷、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞對抗阿爾茲海默病等重要活性［12-16］；沉香揮發(fā)油具有抗炎鎮(zhèn)痛、抑菌等多種藥理活性［17］。

本實(shí)驗(yàn)采用超臨界CO2萃取法和水蒸氣蒸餾法提取暖宮七味散的揮發(fā)性成分，用GC-MS 進(jìn)行成分鑒別，選用含量高、活性明確且與復(fù)方療效一致的成分建立對應(yīng)含量測定的質(zhì)量控制方法，以期為完善暖宮七味散質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料

1.1 儀器 超臨界CO2萃取裝置（型號HA320-40-21，南通市華安超臨界萃取有限公司）； XP-205 型天平（十萬分之一，瑞士Mettler-Toledo 公司）； WN-V69-6006 型天平（十分之一，廈門巨林儀器有限公司）； EN1434 型天平（千分之一，上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司）； FW177 型高速萬能粉碎機(jī)（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）； KQ-400KDE 型數(shù)控超聲波清洗儀器（昆山市超聲儀器有限公司）； Agilent 7890B 氣相色譜儀，串聯(lián)Agilent 5977A 質(zhì)譜儀（美國Agilent 公司）。

1.2 試劑與藥物 白豆蔻（批號20170413）、沉香（批號20171031）、肉豆蔻 （批號 20170414）、丁香 （批號20161115）藥材均由內(nèi)蒙古盛唐國際蒙醫(yī)藥研究院有限公司提供，經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)祁東利老師鑒定為正品。丁香酚對照品（純度≥99.6%，批號110725-201716）、桉油精對照品（純度100%，批號110788-201707）購自中國食品藥品檢定研究院； 去離子水由超純水機(jī)（Millipore-Q）制備； 無水乙醇、乙酸乙酯、正己烷均為分析純，購自天津市康科德科技有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 揮發(fā)油提取

2.1.1 水蒸氣蒸餾法 按照暖宮七味散原處方比例稱取含揮發(fā)油的4 味藥材 （白豆蔻、沉香、肉豆蔻、丁香共225 g）混合，參照2015 年版《中國藥典》 一部修訂版附錄XD 揮發(fā)油測定法甲法提取揮發(fā)油至揮發(fā)油體積不再增加，收集揮發(fā)油，平均得率為4.11 mL／100 g。

2.1.2 超臨界CO2萃取法 按照暖宮七味散原處方比例稱取含揮發(fā)油的4 味藥材（白豆蔻、沉香、肉豆蔻、丁香共2.5 kg）混合，粉碎后置于超臨界CO2萃取釜中，在2 種萃取條件下進(jìn)行提取。

萃取條件1：萃取溫度45 ℃，萃取壓力28 MPa，CO2體積流量50 L／h，分離I 壓力9 MPa，分離I 溫度65 ℃，分離Ⅱ溫度35 ℃，分離Ⅱ壓力為常壓，萃取90 min，收集精油（常溫液體）即得，其得率為4.50 mL／100 g。

萃取條件2：萃取溫度50 ℃，萃取壓力28 MPa，CO2體積流量50 L／h，分離I 壓力9 MPa、溫度65 ℃，分離Ⅱ溫度35 ℃、常壓，萃取90 min，收集精油（常溫液體）即得，其得率為4.52 mL／100 g。

2.1.3 2 種提取方式比較 如表1 所示，與水蒸氣蒸餾法相比，超臨界CO2提取揮發(fā)性成分得率提高10%，投藥量大，用時(shí)短，能耗低。

表1 2 種提取方式比較

2.2 GC-MS 定性分析

2.2.1 GC-MS 條件 色譜：HP-5MS 毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）； 程序升溫（初始溫度60 ℃，保持2 min，以5 ℃／min 升溫至250 ℃，保持20 min）； 進(jìn)樣口溫度280 ℃； 載氣高純He （99.999%）； 柱前壓19 psi（1 psi＝6.895 kPa）； 分流比150 ∶1； 進(jìn)樣量0.2 μL。

質(zhì)譜：電子轟擊EI 離子源70 eV； 離子源溫度230 ℃；四級桿溫度150 ℃； 接口溫度280 ℃； 電子倍增器電壓1 680 V； 質(zhì)譜延遲時(shí)間1.5 min； 正離子模式采集數(shù)據(jù)； 質(zhì)量掃描范圍m／z30～550。

2.2.2 結(jié)果 得到19 個(gè)化合物，匹配度均為100%，GC-MS總離子流圖見圖1，其中化合物6、12、3、2、16、14、1、11 這8 個(gè)化合物的峰面積百分比占總峰面積的91.45%。

圖1 揮發(fā)油樣品的GC-MS 總離子流圖

總離子流圖中的各峰經(jīng)質(zhì)譜計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索并與Nist 14.L 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖核對，質(zhì)譜鑒別結(jié)果見表2，化合物6 桉油精的峰面積百分比最高（49.35%），其次是化合物12 （丁香酚，16.01%）、3 （β-蒎烯，6.59%）、2 （檜烯，6.21%）、16 （ 2-甲氧基-4- （ 1-丙烯基）-苯酚乙酸，4.77%）、14 （石竹烯，3.81%）、1 （1，3，3-三甲基-三環(huán)［2.2.1.02，6］庚 烷，2.86%）、11 （ α-松 油醇，1.85%）。

表2 揮發(fā)油成分GC-MS 鑒定結(jié)果

桉油精具有抑菌、抗炎、鎮(zhèn)痛、神經(jīng)保護(hù)、降血脂、防治糖尿病的藥理作用［18-21］，丁香酚具有抗氧化應(yīng)激、抗炎、抗病毒、局部麻醉、鎮(zhèn)痛等作用［22-25］，與暖宮七味散抑赫依、強(qiáng)身、調(diào)經(jīng)養(yǎng)血、暖宮止帶等功效契合，能一定程度上代表暖宮七味散治療疾病的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，故選擇桉油精和丁香酚作為指標(biāo)性成分建立含量測定方法，用于暖宮七味散的質(zhì)量控制研究。

2.3 暖宮七味散中桉油精、丁香酚含量的測定2.3.1 色譜條件 Agilent DB-WAX 毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）； FID 檢測器； 程序升溫（起始溫度80 ℃，保持3 min，以10 ℃／min 升至190 ℃，保持10 min）； 分流比40 ∶1，進(jìn)樣口溫度240 ℃，檢測器溫度280 ℃； 載氣N225 mL／min，燃?xì)釮240mL／min，助燃?xì)饪諝?50 mL／min； 進(jìn)樣量1 μL； 柱流量1 mL／min。

2.3.2 對照品溶液制備 精密稱取桉油精對照品71.03 mg于10 mL 量瓶中，加乙酸乙酯溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成1 mL 含桉油精7.10 mg 的對照品溶液。

精密稱取丁香酚對照品125.13 mg 于10 mL 量瓶中，加乙酸乙酯溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成1 mL 含丁香酚1.25 mg 的對照品溶液。

精密吸取桉油精對照品溶液5 mL，丁香酚對照品溶液2 mL 于10 mL 量瓶中，加乙酸乙酯稀釋至刻度，搖勻，制成1 mL 含桉油精3.55 mg、丁香酚2.50 mg 的混合對照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備與優(yōu)化

2.3.3.1 評價(jià)指標(biāo) 藥材中桉油精含量提取液中桉油精質(zhì)量／投入藥材總質(zhì)量×100%，藥材中丁香酚含量＝提取液中丁香酚質(zhì)量／投入藥材總質(zhì)量×100%。

2.3.3.2 有機(jī)溶劑種類考察（n＝6）取暖宮七味散揮發(fā)性藥材適量，粉碎，過3 號篩，按照1／50 處方量精密稱取白豆蔻、肉豆蔻、丁香、沉香合并后，置于一定體積具塞三角瓶中，加入10 倍量有機(jī)溶劑（依次考察無水乙醇、乙酸乙酯、正己烷），稱定質(zhì)量，室溫條件下，超聲功率400W，超聲提取30 min，冷卻后再次稱定質(zhì)量，補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定桉油精、丁香酚含量。結(jié)果表明，當(dāng)選用乙酸乙酯時(shí)，提取所得桉油精的含量為2.83%，高于無水乙醇組，略低于正己烷組； 丁香酚的含量為1.57%，高于其余2 組，兩者兼顧，故選用乙酸乙酯作為提取溶劑。

2.3.3.3 料液比考察（n＝6）取暖宮七味散揮發(fā)性藥材適量，粉碎過3 號篩，按照1／50 處方量精密稱取白豆蔻、肉豆蔻、丁香、沉香合并后，置于一定體積具塞三角瓶中，加入一定量（依次考察10、15、20、25、30 倍量）乙酸乙酯，稱定質(zhì)量，室溫條件下，超聲功率400 W，超聲提取30 min，冷卻后再次稱定質(zhì)量，補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定桉油精、丁香酚含量。結(jié)果表明，在其余條件不變的情況下，藥材質(zhì)量與溶劑用量比例為1 ∶25 時(shí)，桉油精含量為3.02%，高于其余各組； 丁香酚含量為1.51%，與相鄰組別差異不大，較為穩(wěn)定，故選用藥材質(zhì)量與溶劑用量最佳比例為1 ∶25。

2.3.3.4 超聲功率考察（n＝6）取暖宮七味散揮發(fā)性藥材適量，粉碎過3 號篩，按照1／50 處方量精密稱取白豆蔻、肉豆蔻、丁香、沉香合并后，置于一定體積具塞三角瓶中，加入25 倍量乙酸乙酯，稱定質(zhì)量，室溫條件下，考察240、280、320、360、400 W，超聲提取30 min，冷卻后再次稱定質(zhì)量，補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定桉油精、丁香酚含量。結(jié)果表明，在其余條件不變的情況下，超聲功率為280 W時(shí)，桉油精含量為3.11%，遠(yuǎn)高于其余各組； 丁香酚含量為1.59%，且后續(xù)基本未增長，故選用最佳超聲功率為280 W。

2.3.3.5 超聲時(shí)間考察（n＝6）取暖宮七味散揮發(fā)性藥材適量，粉碎過3 號篩，按照1／50 處方量精密稱取白豆蔻、肉豆蔻、丁香、沉香合并后，置于具塞三角瓶中，加入25 倍量乙酸乙酯，稱定質(zhì)量，室溫條件下，超聲功率280 W，依次考察超聲20、30、40、50、60 min，冷卻后再次稱定質(zhì)量，補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定桉油精、丁香酚含量。結(jié)果表明，在其余條件不變的情況下，隨超聲時(shí)間延長，桉油精和丁香酚含量均呈先增加再降低的趨勢，當(dāng)超聲50 min 時(shí)，桉油精和丁香酚含量均達(dá)到頂峰，分別為3.26%和1.71%，故選擇最佳超聲時(shí)間50 min。

2.3.3.6 最佳供試品制備方法驗(yàn)證（n＝12）由上述超聲提取工藝考察可知，暖宮七味散揮發(fā)性藥材中揮發(fā)油超聲提取最佳供試品制備方法為：以乙酸乙酯為提取溶劑，料液比為1 ∶25，280 W 功率，超聲50 min。

取暖宮七味散揮發(fā)性藥材適量，粉碎過3 號篩，按照1／50 處方量精密稱取白豆蔻、肉豆蔻、丁香、沉香合并后，共12 份，分別置于一定體積具塞三角瓶中，按照最佳供試品制備方法制備，搖勻，取一定體積濾液過0.22 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液按“2.3.1” 項(xiàng)下色譜條件測定桉油精、丁香酚含量。結(jié)果顯示暖宮七味散揮發(fā)性藥材中桉油精含量為3.04%，丁香酚含量為1.61%，結(jié)果穩(wěn)定。

2.3.4 方法學(xué)考察

2.3.4.1 專屬性考察 取對照品溶液、供試品溶液、空白溶劑（乙酸乙酯），按“2.3.3.6” 項(xiàng)下方法分別制備的缺白豆蔻、缺肉豆蔻、缺丁香、缺沉香的陰性樣品溶液，按“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果表明丁香酚和桉油精與相鄰峰的分離度均大于1.5，陰性溶液對指標(biāo)成分無干擾，專屬性良好，氣相色譜圖見圖2。

圖2 各成分GC-MS 色譜圖

2.3.4.2 線性關(guān)系考察 分別吸取不同濃度的對照品溶液（桉油精 0.014、0.036、0.071、0.142、0.355、0.710、1.776、3.552 mg／mL，丁香酚 0.010、0.025、0.050、0.100、0.250、0.501、1.251、2.503 mg／mL ），在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行回歸可知桉油精在0.014 ～3.552 mg／mL 內(nèi)線性回歸方程為Y＝374.3X-0.788 2，R2＝0.999 9； 丁香酚0.010～2.503 mg／mL 內(nèi)線性回歸方程為Y＝351.22X-1.372 6，R2＝0.999 9，表明各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.4.3 精密度試驗(yàn) 取對照品溶液 （桉油精1.75 mg／mL，丁香酚1.25 mg／mL）適量，在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣測定6 次，測得桉油精、丁香酚峰面積RSD 分別為0.94%、1.00%，表明儀器精密度良好。

2.3.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批暖宮7 味揮發(fā)性藥材6份，按“2.3.3.6” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得桉得油精、丁香酚峰面積RSD 分別為1.00%、0.45%，表明該方法重復(fù)性好。

2.3.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按 “2.3.3.6” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12、18 h 在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得桉油精、丁香酚峰面積RSD 分別為0.94%、1.10%，表明溶液在18 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密移取各成分含量已知供試品提取液6 份，每份10 mL，置于25 mL 量瓶，均加入10 mg 桉油精對照品和6 mg 丁香酚對照品，用乙酸乙酯定容至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率。結(jié)果，桉油精、丁香酚平均加樣回收率分別為 101.65%、97.24%，RSD 分別為1.50%、2.97%。

3 討論

超臨界CO2提取效率高，全程低溫保證揮發(fā)性成分穩(wěn)定，從而保證活性和療效，且工藝綠色循環(huán)低耗，不僅是工業(yè)提取揮發(fā)性成分的重要方法，而且提取設(shè)備連接蒸餾塔，可做揮發(fā)性成分的精細(xì)分離，是中藥揮發(fā)性成分標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的重要制備方法和來源。

本研究進(jìn)行了超臨界CO2提取的工藝研究，GC-MS 定性鑒定出19 個(gè)揮發(fā)性成分，并建立了桉油精和丁香酚含量測定方法，該方法重復(fù)性好、穩(wěn)定性高、準(zhǔn)確可靠，可用于暖宮七味散的質(zhì)量控制。

暖宮七味散中桉油精和丁香酚等揮發(fā)性成分是復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)組成之一，然而復(fù)方中還有天門冬、手掌參、黃精等藥材，含有大量小分子非揮發(fā)性成分，這部分也是暖宮七味散的重要藥效物質(zhì)組成，有待于進(jìn)一步研究。