滋腎育胎丸水提液通過調控TGF-β 通路對DOR 秀麗隱桿線蟲卵巢儲備功能的影響

許 云，陶叢珊，劉 梟，姜孫旻，姚 熒

（無錫市婦幼保健院，江蘇 無錫 214000）

卵巢儲備功能下降（diminished ovarian reserve，DOR）是指卵巢皮質區內的卵母細胞數量減少和（或）質量下降，屬于生殖系統功能退行性疾?。?］，進一步可發展為卵巢早衰。隨著我國女性生育年齡的延遲，DOR 的發病率持續增高并呈現年輕化態勢，其在女性不孕因素中約占10%［2］，嚴重影響了女性的生殖健康和生活質量。

滋腎育胎丸源于全國中醫婦科泰斗羅元愷教授經驗方，臨床研究發現其可以顯著改善不孕癥患者的卵巢儲備功能［3-7］，但對其作用機制研究較少，因此進一步深入探討滋腎育胎丸對DOR 的干預作用機制對于臨床合理用藥具有重要意義。

秀麗隱桿線蟲Caenorhabditiselegans，以下簡稱線蟲，是目前生命科學研究中重要的模式動物之一，具有分化完整、結構簡單的生殖系統，與哺乳動物卵子發生的生理過程高度保守。調控卵子發生的細胞凋亡通路，調控卵母細胞質量的轉化生長因子-β （transforming growth factor-β，TGF-β）信號通路，在線蟲和哺乳動物之間也高度保守［8］。這些基礎研究的快速發展，為以線蟲為模型的藥物篩選和機制研究打下了很好的基礎。本實驗擬采用可致卵巢功能下降的雷公藤甲素進行應激暴露［9-10］，構建線蟲DOR 模型，研究滋腎育胎丸水提液改善卵巢儲備功能的作用機制，明確其治療靶點和分子通路，為滋腎育胎丸的臨床應用提供理論依據。

1 材料

1.1 動物 秀麗隱桿線蟲蟲株，野生型線蟲N2，MD701（bcIs39v）、JK2868 （qIs56v），均來源于美國明尼蘇達大學線蟲遺傳中心。

1.2 藥物 滋腎育胎丸 （國藥準字Z44020008，批號A01026）購自廣州白云山中一藥業有限公司。將藥丸碾碎成粉末，稱取15.00 g，用適量去離子水浸泡30 min，大火煮沸后轉小火熬制30 min，過濾后取濾液，濾渣再次用適量的去離子水浸泡30 min，大火煮沸后轉小火熬制25 min，過濾后，合并2 次濾液，定容至50 mL，此時貯備液質量濃度為300 mg／mL （按生藥量計）［11］。臨用時，用純水配制成5、10、20 mg／mL 使用。

1.3 試劑 雷公藤甲素對照品 （純度98%，批號FY105B211）購自南通飛宇生物科技有限公司，稱取1.0 mg 雷公藤甲素，溶于50.0 μL 二甲基亞砜，50 ℃超聲振蕩30 min，搖勻，用K 溶液配制為1 mg／mL 溶液。胰蛋白胨、酵母提取物（英國Oxoid 公司，批號3176539、4263680-02）； 瓊脂糖（美國HydraGene 公司，批號EZ6789A160）；TRIzol （德國BioFrox 公司，批號R0016）； PrimeScriptTMRT Master Mix （日本TaKaRa 公司，批號AL22263A）； FSE DNA Green Master （瑞士Roche 公司，批號54460200）；Triton-X-100 （廣東光華科技股份有限公司，批號201811106）。

1.4 儀器 正置熒光顯微鏡Axio ScopeA1 （德國Zeiss 公司）； Nanodrop1000 Spectrophotometer （美國Thermo Fisher Scientific 公司）； LightCycler96 Real-Time PCR （瑞士Roche公司）； 連續變倍體視顯微鏡XTZ-E （上海光學儀器六廠）。

2 方法

2.1 線蟲分組、造模與給藥 線蟲培養于含有大腸桿菌OP50 的線蟲生長培養基 （nematode growth medium，NGM），20 ℃恒溫培養，同步化獲得大量年輕成蟲期線蟲［12］。在表面涂布有大腸桿菌OP50 的直徑30 mm 的瓊脂培養基上，加入200 μL 0.1 mg／mL 雷公藤甲素溶液，使其均勻分布于培養基表面。待其晾干后將年輕成蟲期線蟲轉移到加入雷公藤甲素溶液的培養基中，于20 ℃培養箱中處理10 h，制備DOR 線蟲模型［10］。同期，另挑取未喂飼雷公藤甲素的線蟲10 條作為空白組。將造模線蟲隨機分為雷公藤甲素組和滋腎育胎丸水提液5、10、20 mg／mL 組，每組10 條。各組線蟲分別處理24、48、72 h，轉移至無藥物處理液的NGM 培養基中，觀察后代數目、DTC 細胞熒光強度、粗線期凋亡細胞數目、終變期卵母細胞數目。處理48 h后，檢測線蟲細胞凋亡通路、TGF-β 通路關鍵基因mRNA 表達。

2.2 后代數目測定 后代數目是指將一個年輕成蟲期線蟲放入培養皿中處理，處理結束后，每隔24 h 將線蟲轉至1個新的NGM 培養皿，直至線蟲停止產卵，于體視顯微鏡下觀察，將每天所產子代數目（各期幼蟲和受精卵）相加，即得該線蟲的后代數目。

2.3 DTC 細胞熒光強度分析 于熒光顯微鏡下觀察處理結束后的JK2868 線蟲（GFP 特異性標記DTC 細胞的轉基因線蟲），分別在U 型性腺臂雙側遠端頂部確定DTC 細胞，熒光顯微鏡下DTC 細胞為邊界清晰、亮綠色傘狀細胞，固定曝光時間，定焦拍照，應用Image J 軟件對DTC 細胞的熒光強度進行分析。

2.4 粗線期細胞凋亡數目測定 于熒光顯微鏡下觀察處理結束后的MD701 線蟲（GFP 特異性標記生殖腺凋亡細胞的轉基因線蟲），凋亡細胞呈亮綠色圓形紐扣狀。于熒光顯微鏡下統計線蟲單側性腺臂減數分裂區凋亡細胞的數目。

2.5 終變期卵母細胞數目測定 于顯微鏡下觀察處理結束后的N2 線蟲，統計線蟲單側性腺臂遠端Loop 區轉折處到性腺臂近端納精囊之間卵母細胞的數目。

2.6 線蟲卵子發生相關通路關鍵基因mRNA 表達檢測 每組取約6 000 條線蟲，以TRIzol 法提取RNA 后，逆轉錄為cDNA，配制25 μL 體系 （cDNA 2 μL、FSE DNA Green Master 12.5 μL、正向引物1.0 μL、反向引物1.0 μL、H2O 8.5 μL），在熒光實時定量PCR 儀上進行擴增反應，條件為95 ℃預變性5 s，特異退火30 s，采集熒光信號40 個循環； 72 ℃延伸10 min，并繪制熔解曲線。目的基因的引物用Primer 5.0 設計，序列見表1。以比較域值法測定目的基因相對表達，以2-ΔΔCT相對定量法計算目的基因與內參基因熒光的比值，用于表示目的基因的表達情況。

表1 引物序列

2.7 統計學分析 通過SPSS 24.0 軟件進行處理，計量資料以（x±s）表示，各組間比較采用方差分析。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 雷公藤甲素致線蟲卵巢儲備功能下降模型評判 如表2 所示，與空白對照組比較，N2 線蟲經0.1 mg／mL 雷公藤甲素處理10 h 后，后代數目、卵母細胞數量減少 （P＜0.05，P＜0.01）。結果顯示雷公藤甲素對線蟲的生育能力和卵母細胞形成能力有抑制作用，可用于構建卵巢儲備功能下降模型。

表2 雷公藤甲素對N2 線蟲生育能力的影響（個，x±s，n＝10）

3.2 滋腎育胎丸水提液對DOR 線蟲后代數目的影響 如表3 所示，與空白對照組比較，雷公藤甲素組后代數目減少（P＜0.01）； 與雷公藤甲素組比較，滋腎育胎丸水提液5、10、20 mg／mL 組線蟲后代數目均增加（P＜0.01），滋腎育胎丸水提液1、2.5 mg／mL 組線蟲后代數目無明顯變化（P＞0.05）。因此，后續實驗使用5、10、20 mg／mL 這3 個劑量進行。

表3 滋腎育胎丸水提液對DOR 線蟲后代數目的影響（x±s，n＝10）

3.3 滋腎育胎丸水提液對DOR 線蟲卵母細胞數量的影響 如表4 所示，與空白對照組比較，雷公藤甲素組線蟲卵母細胞數量減少（P＜0.01）； 與雷公藤甲素組比較，處理24、48 h 后，滋腎育胎丸水提液5、10 mg／mL 組線蟲卵母細胞數量均增加（P＜0.01），處理72 h 后，滋腎育胎丸水提液各劑量組線蟲卵母細胞數量均增加 （P＜0.01）。

表4 滋腎育胎丸水提液對DOR 線蟲卵母細胞數的影響（±s，n＝10）

表4 滋腎育胎丸水提液對DOR 線蟲卵母細胞數的影響（±s，n＝10）

注：與空白對照組比較，＃＃P＜0.01； 與雷公藤甲素組比較，**P＜0.01。

組別劑量／（mg·mL-1）卵母細胞數目／個24 h48 h72 h空白對照組—9.7±0.39.3±0.49.7±0.4雷公藤甲素組0.15.5±0.3＃＃5.2±0.5＃＃4.8±0.4＃＃滋腎育胎丸水提液組57.7±0.4**7.4±0.4**8.1±0.4**108.4±0.3**8.3±0.6**8.9±0.6**206.3±0.56.0±0.36.5±0.3**

3.4 滋腎育胎丸水提液對DOR 線蟲DTC 傘狀細胞熒光強度的影響 如表5 所示，處理24、48 h 后，與空白對照組比較，雷公藤甲素組線蟲DTC 傘狀細胞熒光強度減弱（P＜0.05）； 與雷公藤甲素組比較，滋腎育胎丸水提液10 mg／mL 組線蟲DTC 傘狀細胞熒光強度增強（P＜0.05）。

表5 滋腎育胎丸水提液對DOR 線蟲DTC 細胞熒光強度的影響（x±s，n＝10）

3.5 滋腎育胎丸水提液對DOR 線蟲凋亡細胞數量的影響 如表6 所示，處理24、48、72 h 后，與空白對照組比較，雷公藤甲素組線蟲凋亡細胞數量均增加（P＜0.05）；與雷公藤甲素組比較，滋腎育胎丸水提液5、10 mg／mL 組線蟲凋亡細胞數量均減少（P＜0.05，P＜0.01）。

表6 滋腎育胎丸水提液對DOR 線蟲凋亡細胞數的影響（x±s，n＝10）

3.6 滋腎育胎丸水提液對DOR 線蟲卵子發生相關信號通路基因mRNA 表達的影響 如表7～8 所示，與空白對照組比較，雷公藤甲素組線蟲細胞凋亡通路ced-3、ced-4 mRNA表達升高（P＜0.05），TGF-β 信號通路上daf-4 mRNA 表達降低（P＜0.05）； 與雷公藤甲素組比較，滋腎育胎丸水提液10 mg／mL 組線蟲細胞ced-3、ced-4 mRNA 表達降低（P＜0.05），daf-4、sma-2、sma-3 mRNA 表達升高（P＜0.05）。

表7 滋腎育胎丸水提液對DOR 線蟲凋亡通路基因mRNA表達的影響（x±s，n＝10）

表8 滋腎育胎丸水提液對DOR 線蟲TGF-β 通路基因mRNA 表達的影響（x±s，n＝10）

4 討論

中醫理論認為腎主宰女性生殖機能的發育、旺盛與衰退，對女性卵巢生理功能起決定作用。滋腎育胎丸方中菟絲子和人參能補腎益精，而巴戟天、續斷和杜仲能協同菟絲子補腎壯陽，白術和黨參有補氣健脾之功，全方合奏滋補肝腎、益氣培元之功，臨床上多用于脾腎虛弱型卵巢儲備功能減退的治療［13-14］。

滋腎育胎丸包含多種中藥成分，檢測任何一種活性成分均不能很好的體現其復方整體療效，最好采用復方給藥。但秀麗隱桿線蟲體積極其微小，成年線蟲也僅1.0 mm 左右長，無法采用嚙齒類動物的給藥方式。常規的線蟲給藥途徑多采用將藥物配制成溶液鋪涂在瓊脂培養板上給藥。滋腎育胎丸為濃縮水蜜丸，為較好的保留復方中的有效成分，且利于給藥，本實驗對藥物進行了水提，配制成適宜秀麗隱桿線蟲給藥的形式，但水提液和蜜丸狀藥物在制備方法上還是存在差異，可能會導致藥物成分的改變，也可能會影響藥物的藥理作用，這些尚需進一步的研究。本實驗先就滋腎育胎丸水提液提高生育力的藥理作用進行初步研究。

本研究發現低劑量滋腎育胎丸水提液能提高DOR 秀麗隱桿線蟲后代數目，提示其具有恢復卵巢功能的作用，繼而確定低劑量滋腎育胎丸水提液能恢復DTC 細胞，降低凋亡細胞、提高終變期卵母細胞的生成。凋亡是卵母細胞發生中必不可少的過程，與雷公藤甲素組比較，10 mg／mL 滋腎育胎丸水提液能降低ced-3、ced-4 mRNA 表達，提示藥物能通過抑制細胞凋亡來提高卵母細胞的生成。

TGF-β 信號通路在卵泡的發育中也起著重要作用，是調節秀麗隱桿線蟲卵母細胞質量的信號通路，在秀麗隱桿線蟲和哺乳動物中高度保守［8］。sma-6 和daf-4 編碼Ⅰ型和Ⅱ型受體，配體受體復合物募集和磷酸化信號傳導蛋白，該蛋白由sma-2、sma-3、sma-4 和sma-9 編碼形成［15-17］。磷酸化后的信號傳導蛋白進入細胞核，與DNA 結合后通過調控下游基因，調控卵母細胞質量［18］。與雷公藤甲素組比較，10 mg／mL 滋腎育胎丸水提液能升高daf-4、sma-2、sma-3 mRNA 表達。TGF-β 與細胞凋亡有相關性［19］，提示藥物可能通過TGF-β 通路影響細胞凋亡，從而促進卵母細胞的生成。

綜上所述，滋腎育胎丸水提液可以通過影響TGF-β 通路抑制細胞凋亡，從而提高卵母細胞的質量和數量，促進卵母細胞的發育成熟，提高卵巢儲備功能。但滋腎育胎丸成分復雜，富含豐富的活性物質，其具體的活性成分和作用機制尚需進一步的研究。