微酸性電解水對產氣莢膜梭菌芽孢的殺滅效果及作用機制

林婷婷 孫芝蘭 劉芳 吳海虹 張春紅 王道營

林婷婷，孫芝蘭，劉? 芳，等. 微酸性電解水對產氣莢膜梭菌芽孢的殺滅效果及作用機制［J］. 江蘇農業學報，2023，39（8）：1755-1761.

doi：10.3969/j.issn.1000-4440.2023.08.016

收稿日期：2022-10-18

基金項目：江蘇省農業科技自主創新基金項目[CX（22）2044]

作者簡介：林婷婷（1996-），女，河南信陽人，碩士研究生，研究方向為食品微生物。（E-mail）Ltt9625@163.com

通訊作者：吳海虹，（E-mail） 305087638@qq.com；張春紅， （E-mail）zhangchsy@163.com

摘要：微酸性電解水（SAEW）是一種安全有效的新型殺菌劑。本研究分析了SAEW對產氣莢膜梭菌芽孢的殺滅效果，并研究了其殺滅芽孢的作用機制。結果顯示，10 mg/L、20 mg/L和30 mg/L SAEW處理30 min后產氣莢膜梭菌芽孢存活數明顯降低，SAEW殺滅效果明顯。并且40 mg/L SAEW處理5 min就可以完全滅活芽孢。掃描電子顯微鏡觀察結果表明，質量濃度為40 mg/L SAEW處理可使芽孢干癟皺縮，失去原本飽滿的芽孢形態。激光共聚焦顯微鏡觀察結果顯示，與對照組相比，40 mg/L SAEW處理過的芽孢均呈現紅色，說明芽孢的外膜被SAEW破壞，并且芽孢全部死亡。相同處理時間，隨著SAEW質量濃度的不斷提高，芽孢的疏水性不斷降低， Zeta-電位絕對值和粒徑不斷變小，并且芽孢內核物質DPA大量釋放，這說明SAEW處理破壞了芽孢的內膜結構。因此，SEAM可通過破壞芽孢的內膜結構及外層結構達到殺滅效果。

關鍵詞：微酸性電解水；產氣莢膜梭菌；芽孢

中圖分類號：TS201.6????? 文獻標識碼：A????? 文章編號：1000-4440（2023）08-1755-07

Bactericidal effect and mechanism of action of slightly acidic electrolyzed water on Clostridium perfringens spores

LIN Ting-ting1，2 SUN Zhi-lan2 LIU Fang2 WU Hai-hong1 ZHANG Chun-hong1 WANG Dao-ying1，2

（1.College of Food Science， Shenyang Agricultural University， Shenyang 110866， China;2.Institute of Agricultural Products Processing， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China）

Abstract：Slightly acidic electrolyzed water （SAEW） is a new safe and effective bactericide. In this study， the bactericidal effect of SAEW on Clostridium perfringens spores was analyzed， and the mechanism of its action in killing the spores was studied. The results showed that the survival number of Clostridium perfringens spores decreased significantly after 30 minutes of treatment with 10 mg/L， 20 mg/L， and 30 mg/L SAEW， indicating a significant bactericidal effect. Moreover， the C. perfringens spores were completely inactivated after treatment with 40 mg/L SAEW for 5 min. Scanning electron microscopy results showed that treatment with 40 mg/L SAEW could make the spores shrivel and shrink. Confocal laser scanning microscopy showed that all the SAEW-treated spores at 40 mg/L showed red color compared with the control group， indicating that the outer membrane of the spores was destroyed by SAEW， and all the spores died. With the increasing of SAEW concentration， the hydrophobicity of spores decreased， the absolute value of zeta-potential and particle size became smaller， and the spore core substance DPA was released more and more， which indicated that SAEW treatment disrupted the inner membrane structure of the spores. Therefore， SAEM can achieve bactericidal effect by disrupting the inner membrane structure and outer structure of spores.

Key words：slightly acidic electrolyzed water;Clostridium perfringens;spores

產氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）是一種可產芽孢、形成生物被膜的革蘭氏陽性條件致病菌，普遍存在于自然環境中，尤其是存在于人和動物腸道內以及土壤中[1]。該菌有分解動植物體內大部分糖分的能力，并且產生氣體和毒素，因此稱為產氣莢膜梭菌[2]。該菌體積較大，呈桿狀，其芽孢經常位于菌體兩端，對于特殊條件的抵抗力，芽孢比營養體更強。產氣莢膜梭菌可形成芽孢，芽孢內部含水量極低，條件不適宜時，會形成休眠體，且休眠體對外界環境的改變抵抗性極強[3]。待到外界環境適宜時，芽孢便會萌發，此時就會污染所處的環境，由于芽孢致病性極強，因此常常造成巨大的經濟損失[4]。據統計，每年因為產氣莢膜梭菌導致的壞死性腸炎給全球畜禽業造成的經濟損失高達2.0×109美元[5]。高溫、強酸、強堿、高壓等條件都不足以滅活芽孢，所以普通殺菌條件并不能殺死芽孢，因此可以選擇協同滅菌方法去滅活芽孢。

微酸性電解水（Slight acidic electrolyzed water，SAEW）是指pH為5.0～6.5、有效氯質量濃度為10～90 mg/L的電解水[6]。SAEW具有殺菌范圍廣、殺菌效果顯著、對人體和環境無害、獲取方法簡便等眾多優勢，所以被用于食品、農業、醫療等領域[7]。研究結果顯示，SAEW對水產品表面的有害菌例如單增李斯特菌具有良好的滅活作用[8]。Okanda等[9]利用SAEW對生菜進行沖洗和浸泡處理，結果顯示其有較好的殺菌效果。劉如霆等[10]研究SAEW對凈化太平洋牡蠣的殺菌效果，與未經SAEW處理的對照組太平洋牡蠣相比，經過SAEW處理的太平洋牡蠣的菌落總數顯著降低，并且在之后的暫養過程中也呈現良好的抑菌效果。

產氣莢膜梭菌在現實生活中嚴重影響食品安全，由于其污染的范圍廣、污染種類多、污染途徑多，并且其產生的毒素對人類和畜禽都有巨大的毒性。因此控制與消除產氣莢膜梭菌污染對保證食品安全至關重要。本試驗主要研究不同質量濃度的SAEW對產氣莢膜梭菌芽孢的殺滅效果，并探索了SAEW對產氣莢膜梭菌芽孢的滅活機制，為食品和其他領域提供一種新的滅活產氣莢膜梭菌芽孢的思路。

1? 材料與方法

1.1? 產氣莢膜梭菌芽孢的制備

產氣莢膜梭菌C1是從實驗室購買的生雞中獲取的，并通過16S rRNA測序確定其準確性。將產氣莢膜梭菌C1接入到胰蛋白胨葡萄糖酵母浸膏肉湯培養基（TPGY）中，放入厭氧罐厭氧培養24 h。參考Juneja等[11]的方法，將上述培養基里的0.1 ml產氣莢膜梭菌C1菌液接入新鮮制備的10 ml液體硫乙醇酸鹽培養基（FTG）中，75 ℃水浴激活20 min，冷卻后放入厭氧罐厭氧培養18 h。再從剛才培養的FTG中吸取1 ml接入新1支液體硫乙醇酸鹽培養基中，厭氧培養4 h，之后再重復上述步驟1次。然后將FTG中的菌體接入新鮮制備的鄧肯（Duncan strong，DS）強培養基中。放入厭氧罐厭氧培養3 d。將培養好的產氣莢膜梭菌芽孢進行離心，4 ℃下10 000 g 離心10 min，反復離心3次。將離心好的芽孢保存在無菌水中并存放在4 ℃冰箱中。用光學顯微鏡計數來測定孢子的含量。首先，取10 ml培養液到載玻片上涂抹、干燥并固定，然后加入3～5滴孔雀綠染色液，加熱染色液使其變熱，但不煮沸，在染色溶液出現熱蒸汽4～5 min后，倒出染色溶液并洗滌，之后在光學顯微鏡下觀察孢子。

1.2? 微酸性電解水（SAEW）的制備與試驗設計

SAEW是利用一個電解水裝置（HD-240L，上海旺普貿易有限公司產品）制備的，制備的SAEW質量濃度分別為10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L和40 mg/L。采用Seven Mult pH計對SAEW的pH值進行測定，利用碘量法測定其有效氯濃度。將培養好的產氣莢膜梭菌芽孢和不同質量濃度的SAEW等量混合處理5 min、15 min、30 min。產氣莢膜梭菌芽孢的初始含量在1×105? CFU/ml左右，加入SAEW后芽孢的含量為1×104? CFU/ml左右。SAEW處理之后，進行梯度稀釋，吸取等量的菌液接入FTG中進行厭氧培養，如在FTG中澄清透明說明芽孢被完全滅活，如在平板上未形成菌落，FTG中有絮狀物和氣泡產生，則低于檢測限以下。

1.3? 產氣莢膜梭菌芽孢形態變化觀察

使用掃描電子顯微鏡對經過SAEW處理的產氣莢膜梭菌芽孢形態變化進行觀察。參考前人的方法[12]，通過離心（6 000 r/min、10 min、4 ℃）收集經過SAEW處理的產氣莢膜梭菌的芽孢，使用0.1 mol/L磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗滌3次。然后，加入1 ml 2.5%戊二醛溶液，芽孢在4 ℃下固定12 h，隨后在不同體積分數（50%、70%、80%、90%）的乙醇中脫水，每個梯度10 min，最后用100%無水乙醇脫水3次，每次30 min。將脫水之后的芽孢懸浮于乙醇，吸取一定量到載玻片上并風干[12]。將處理后的芽孢固定在金屬載板上，然后進行噴金處理。制備后，用掃描電鏡觀察不同質量濃度SAEW對產氣莢膜梭菌芽孢的表面形態的影響。

1.4? 激光共聚焦顯微鏡觀察芽孢通透性

產氣莢膜梭菌芽孢經過方法1.2處理后，參考Liu[13]的方法，將芽孢以6 000 r/min離心10 min，離心溫度為4 ℃。加入0.1 mol/L PBS，用LIVE/DEAD BacLightTM活力試劑盒避光染色30 min，之后，將樣品以6 000 r/min離心3次，每次5 min，離心溫度設置為4 ℃。最后加入0.1 mol/L PBS并混合均勻，用Leica Ultra View VOX共聚焦激光掃描顯微鏡觀察芽孢的通透性。

1.5? 2，6-吡啶二羧酸（DPA）釋放率測定

參考Alistair等[14]的方法并進行適當修改，用熒光分光光度計測定芽孢上清液熒光強度。根據方法1.2中的方法利用不同質量濃度的SAEW對芽孢進行試驗處理，在10 000 r/min條件下離心10 min，收集上清液。同時在100 ℃下分別準備相同含量的芽孢進行水浴1 h，測定的2，6-吡啶二羧酸作為芽孢總2，6-吡啶二羧酸（DPA）含量。激發波長為270 nm，發射波長為545 nm。通過以下公式計算DPA釋放率：

DPA含量=Fd/Fi×100%

式中DPA含量是初始DPA的含量，Fd是對照組產氣莢膜梭菌芽孢釋放的DPA的含量，Fi為不同SAEW處理組產氣莢膜梭菌芽孢中DPA的含量。

1.6? 芽孢粒徑和Zeta-電位的測定

參考Lyu等[15]和Chen等[16]的方法并進行修改，對芽孢進行不同質量濃度的SAEW處理之后，采用Nano-ZS粒徑分析儀對芽孢進行粒徑和Zeta-電位測量。測定之前開機進行自動調節參數，加樣量超過容器體積的3/4，每次換樣前都用清水清理儀器，以蒸餾水作為空白對照。

1.7? 疏水性的測定

根據Lyu[15]和Noma等[17]的研究方法并稍作修改，首先對未處理和處理后的芽孢懸浮液進行測定，其在600 nm處的光度值記作A0，取3.0 ml芽孢懸浮液加入0.5 ml正十六烷渦旋混合，室溫下靜置15 min，測定其上清液在600 nm處光度值記作Af，芽孢疏水性（RSH）按照以下公式進行計算：

RSH=（A0-Af）/A0×100%

1.8? 數據處理及分析

采用Origin2019作圖，本試驗的所有處理均重復3次，數據用平均值和標準差計算。使用SPSS軟件通過單向方差分析（ANOVA）和LSD檢驗進行統計分析，其中組間顯著性水平為P<0.05。

2? 結果與分析

2.1? 產氣莢膜梭菌芽孢的滅活

為觀察不同質量濃度SAEW處理對產氣莢膜梭菌芽孢的作用效果，本試驗選取10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L的SAEW分別處理產氣莢膜梭菌5 min、15 min、30 min，比較不同質量濃度SAEW處理下產氣莢膜梭菌芽孢的失活情況。由圖1可知，微酸性電解水質量濃度越大，芽孢失活越明顯。當SAEW處理質量濃度為10 mg/L，處理5 min、15 min芽孢的失活效果沒有明顯區別，芽孢最大失活量為4.31×104? CFU/ml；當SAEW質量濃度為20 mg/L，處理5 min芽孢的失活量為5.74×104? CFU/ml，處理15 min芽孢的失活量為5.82×104? CFU/ml，當處理時間延長到30 min，芽孢的失活量為5.92×104? CFU/ml。結果顯示，當微酸性電解水質量濃度為20 mg/L時，隨著處理時間的延長，微酸性電解水處理滅活芽孢效果顯著提高；當SAEW質量濃度為30 mg/L，處理時間為5 min，芽孢的失活量為5.97×104? CFU/ml，當處理時間延長至15 min和30 min，芽孢的失活量為6.02×104? CFU/ml和6.03×104? CFU/ml。芽孢失活量與SAEW的質量濃度有關，與處理時間的關系緊密且隨著時間的變化而變化；當SAEW質量濃度為40 mg/L時，芽孢在5 min內就全部失活，證明隨著微酸性電解水處理時間的延長和微酸性電解水質量濃度提高，殺滅產氣莢膜梭菌芽孢的效果越好。由以上結果得知，隨著微酸性電解水質量濃度增加，微酸性電解水對產氣莢膜梭菌芽孢的殺滅效果越強，這一結果與Ni等[18]的研究結果相似。Han等[19]通過用有效氯質量濃度為20～80 mg/L的微酸性電解水，1～7 min的處理時間單獨處理生菜，可使生菜上的沙門氏菌減少一半的數量。Issa-Zacharia等[20]采用有效氯質量濃度為21～22 mg/L的SAEW對新鮮即食蔬菜和芽苗菜處理15 min，并與用次氯酸鈉處理的進行比較，結果顯示SAEW處理比次氯酸鈉處理顯著（P＜0.05）降低了芹菜、生菜和大白菜芽中大腸桿菌和沙門氏菌的數量。

圖柱上不同小寫字母表示處理間差異達0.05顯著水平。

2.2? 芽孢形態

不同質量濃度的SAEW處理后，產氣莢膜梭菌芽孢的表觀結構變化見如圖2。圖2A顯示，未處理的芽孢表面光滑圓潤，沒有任何的破損和褶皺。圖2B呈現的是20 mg/L SAEW處理30 min后產氣莢膜梭菌芽孢的狀態，芽孢表面仍未有明顯變化，說明此時的芽孢仍未受到嚴重傷害。圖2C顯示的是產氣莢膜梭菌芽孢經過40 mg/L SAEW處理30 min后的形態。與對照組相比，40 mg/L SAEW處理30 min后芽孢形態發生明顯變化，芽孢表面出現褶皺，芽孢外膜受到破壞，表明SAEW對產氣莢膜梭菌芽孢的外膜有破壞作用。梁鐸[21]在微酸性電解水對李斯特菌進行抑菌作用的研究中發現，對照組李斯特菌菌體完整，表面光滑，而經過SAEW處理的李斯特菌表面出現褶皺，菌體變形，菌體內容物也出現泄露。

2.3? 芽孢通透性

采用激光共聚焦顯微鏡分析不同質量濃度SAEW處理產氣莢膜梭菌芽孢后細胞膜滲透性的變化（圖3）。對照組的芽孢整體呈綠色（圖3A），這說明此時芽孢處于存活狀態。經過20 mg/L SAEW處理30 min后，有小部分芽孢呈現橙紅色，但大部分還是處于綠色（圖3B），這說明此時的芽孢有小部分處于死亡狀態。經過40 mg/L SAEW處理30 min后，大部分芽孢轉變成紅色（圖3C），可以看出芽孢此時大部分已經死亡。這一結果也與SAEW處理其他菌的結果相似，如Liu等[22]用30 mg/L SAEW殺滅克雷伯菌，在激光共聚焦顯微鏡下可以觀察到30 mg/L SAEW處理下，克雷伯菌大部分都變成了紅色，此時菌體處于被滅活狀態。

2.4? 2，6-吡啶二羧酸釋放率

2，6-吡啶二羧酸（DPA）是細菌芽孢內核特有的物質，當芽孢萌發或內核結構完整性受到破壞時，DPA就被釋放出來[23-24]。不同質量濃度SAEW處理產氣莢膜梭菌芽孢后其結構變化如圖4所示，未處理的芽孢（對照）結構較完整，不能釋放DPA，經過10 mg/L SAEW處理15 min后，芽孢DPA釋放率與對照組相比顯著增加。經過20 mg/L和30 mg/L SAEW處理后，尤其是40 mg/L SAEW處理后，導致芽孢內DPA大量釋放。從圖4可知，隨著SAEW質量濃度的增加，DPA的釋放量也呈現不斷上升的趨勢（P＜0.05）。說明，微酸性電解水可能通過擴散作用穿透芽孢外衣，破壞芽孢內膜，導致芽孢內特有物質DPA大量釋放。Fan等[25]研究發現被超聲聯合熱處理殺死的孢子在隨后的熱處理中比未處理的孢子更容易釋放DPA。

圖柱上不同小寫字母表示處理間差異達0.05顯著水平。

2.5? 粒徑和Zeta-電位

不同質量濃度SAEW對產氣莢膜梭菌芽孢的Zeta-電位的影響如圖5A所示，未經處理的芽孢Zeta-電位的絕對值最高，經過不同質量濃度的SEAW處理后，Zeta-電位的絕對值出現下降的趨勢。可能是在微酸性電解水處理過程中芽孢外層結構受到破壞，因此芽孢的Zeta-電位下降[17]。Zeta-電位的絕對值降低，可能是因為微酸性電解水通過擴散作用穿過芽孢外膜進入芽孢內部，使芽孢結構蛋白質發生變性，從而導致芽孢電位的絕對值降低[26]。Lyu等[15]研究發現，蠟樣芽孢的Zeta-電位值在未處理和處理過的樣品中均為負值。且隨著超聲波處理時間的增加而降低，這說明超聲波處理破壞了芽孢的外層結構。

不同質量濃度SAEW對芽孢粒徑的影響如圖5B所示，與對照組相比，經過不同質量濃度SAEW處理的芽孢粒徑變小，尤其是40 mg/L SAEW處理。經過10 mg/L SAEW處理5 min后，芽孢粒徑與對照組相比顯著縮小。20 mg/L SAEW處理，隨著處理時間的延長，芽孢粒徑逐漸縮小（P＜0.05）。經過30 mg/L SAEW處理后，芽孢的粒徑比10 mg/L和20 mg/L SAEW處理縮小更加明顯。用40 mg/L SEAW處理后，芽孢的粒徑達到最小，這與芽孢殘存數是一致的。圖5B顯示，相同處理時間，隨著SAEW質量濃度的增加，芽孢的粒徑呈現不斷下降的趨勢，這可能是因為芽孢被SAEW破壞了外層結構，因此芽孢粒徑減小。樊麗華[27]的研究結果顯示，在超聲波處理芽孢過程中，芽孢粒徑變小，這可能是由于芽孢外層蛋白質在超聲波處理中遭到破壞，從而導致芽孢粒徑減小。

2.6? 疏水性

如圖6所示，相同處理時間，隨著SAEW處理質量濃度的升高，芽孢的疏水性總體上呈現下降的趨勢。在10 mg/L SAEW處理下，芽孢疏水性變化不明顯；在30 mg/L SAEW處理下，芽孢疏水性出現明顯下降趨勢。在40 mg/L SAEW處理下，芽孢疏水性較對照顯著下降，但不隨處理時間變化而變化。這說明SAEW處理芽孢會破壞芽孢外層結構蛋白質，引起芽孢結構發生不可逆改變進而影響芽孢疏水性。據報道，SAEW（有效氯質量濃度為25.27 mg/L）會破壞大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的細胞膜[28]。研究結果顯示，這可能是由于SAEW中的有效成分通過芽孢外膜進入芽孢導致內部成分失活，芽孢自身抗性下降[29]。

圖柱上不同小寫字母表示處理間差異達0.05顯著水平。

圖柱上不同小寫字母表示處理間差異達0.05顯著水平。

3? 結? 論

SAEW處理質量濃度的不斷增加可以有效縮短產氣莢膜梭菌芽孢失活時間，破壞芽孢外層蛋白質中氨基酸帶電荷量，從而導致芽孢Zeta-電位絕對值降低，粒徑下降，疏水性也隨之下降，導致芽孢內物質DPA大量釋放，由此可知SAEW處理能使芽孢的內核結構崩潰。在掃描電鏡下觀察，可以明顯看到在SAEW處理質量濃度為40 mg/L時芽孢的狀態，芽孢整體結構遭到破壞，芽孢的表面變得粗糙甚至變形。SAEW的殺滅效果與其自身的質量濃度及處理時間有關，在使用時，可根據不同食品類型的特點來確定。本研究結果為滅活產氣莢膜梭菌芽孢提供了一定的科學依據，也為在那些不能高溫滅菌的食品上滅活芽孢提供了新方法。

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（責任編輯：陳海霞）