不同生長階段馬口魚腸道菌群差異性研究

崔雁娜郝貴杰丁蘭鄭夢蘭王雨辰涂金玉孫家棟林鋒

(1.農業農村部淡水漁業健康養殖重點實驗室/ 浙江省魚類健康與營養重點實驗室/湖州市水產品品質提升與加工技術重點實驗室/浙江省淡水水產研究所，浙江 湖州 313001；2.安吉縣農業農村局，浙江 湖州313300；3.安吉縣梅溪鎮農業農村辦公室，浙江 湖州 313306；4.安吉梅溪草灘家庭農場，浙江 湖州 313306；5.安吉梅溪孫傅家庭農場，浙江 湖州 313306)

前言

馬口魚(Opsariichthys bidens)俗名花杈魚、桃花魚、山鳡等，雜食偏肉食性淡水魚類，溪流中多見，肉質鮮美，營養及經濟價值高，投苗養殖當年即可上市[1]。2017年浙江省淡水水產研究所突破了馬口魚種苗規模化繁育關鍵技術，實現催產率86.87%、受精率82.73%、出苗率80.58%，獲仔魚20萬尾，育成平均規格4.4cm的夏花魚種12.9萬尾[2]。馬口魚人工規模化繁育也在不斷實現突破[3]：人工繁育試驗，進行人工催產，人工授精，親魚優選，親魚強化培育等方面都取得了飛速發展。很多學者對不同的水體馬口魚養殖模式也進行了研究，包括池塘、磚砌水泥池、塑料膜鋪底土池、一般土池、稻田輪養、河水土池、廢棄鰻池、平原河流水、室內工廠化、跑道養殖等[4]，各種不同水體養殖的馬口魚所耗費的成本及獲得的收益有很大差別，但是相比其他魚類，經濟效益依然非常客觀。然而，關于馬口魚體內腸道菌群的研究還比較少見。魚類的腸道菌群在魚類生長過程中的營養供應、代謝穩態和免疫防疫中都會起到重要的作用[5]。魚類的微生物群可以是多樣的，包括原生動物、真菌、酵母、病毒以及細菌和古菌[6]。雖然原生動物、真菌、酵母、病毒以及細菌和古菌在魚類生長中都有不同程度的貢獻，但細菌是魚類腸道的主要微生物群[7]。因此，本課題組基于16SrRNA檢測對2月齡、5月齡、9月齡的馬口魚體內腸道菌群進行了研究，以期對馬口魚保健及用藥提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

2022年4月底在浙江湖州某家庭農場放水花苗，放養密度7萬尾·667m-2。放苗之前池塘已經清塘、曬干、消毒。分別在2022年6月底、9月底和2023年1月底進行采樣檢測，樣品分別對應2月齡、5月齡、9月齡的馬口魚。

選取活力好、無外傷，平行樣品大小相近的2月齡、5月齡、9月齡的馬口魚各25尾，對取樣工具消毒后，分別取樣并測體重、體長、腸重、肝重，并將馬口魚腸道放置于-80℃保存待測腸道微生物。

1.2 儀器設備

PCR儀，ABI GeneAmp?9700型(美國ABI公司)；QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統(Promega公司)；分析天平(SECURA125-1CN/SQP)，德國Sartorius科學儀器有限公司；多功能水質測定儀HQ40d(美國哈希)。

1.3 試驗方法

1.3.1 水質常規指標檢測

對2月齡、5月齡、9月齡馬口魚養殖水質的pH、水溫、溶解氧進行了檢測。

1.3.2 生長性能測定

取2月齡、5月齡、9月齡馬口魚樣品各25尾，測量其體重、體長，解剖后取內臟和肝臟，稱重，計算各組特定生長率(specific growth rate，SGR)、肥滿度(condition factor，CF)、肝體指數(hepatopancreas somatic indices，HSI)、臟體指數(Visceral SensitivityIndex，VSI)。各指標計算公式：

SGR(%·d-1)=100×[(lnW2-lnW1)/(t2-t1)]

(1)

CF(%)=100×W/L3

(2)

HSI(%)=100×W肝臟/W

(3)

VSI(%)=100×W內臟/W

(4)

式中，W1和W2分別為t1和t2時的體重，g；W肝臟表示肝臟重，g；W內臟表示內臟重，g；W表示對應的體重，g；L表示體長，cm。

1.3.3 腸道微生物的檢測

采用以2月齡、5月齡、9月齡馬口魚的腸道微生物DNA為模板，通過聚合酶鏈式反應(PCR)，采用515F-907R引物對16S rRNA基因進行擴增，并用Illumina Hiseq 2500測序平臺測序獲得原始數據。

1.4 數據分析

需要根據barcode得到所有樣品的有效序列；根據序列首尾兩端的barcode和引物區分樣品，并調整序列方向，barcode允許的錯配數為0，最大引物錯配數為2；用Usearch軟件和gold數據庫，采用denovo和reference結合的方式去除嵌合體。使用軟件：Trimmomatic、FLASH、Usearch、qiime、perl程序。

2 結果與分析

2.1 馬口魚養殖水質檢測

對2月齡、5月齡、9月齡馬口魚養殖水質的pH、水溫、溶解氧進行了檢測，檢測結果見表1。3組樣品pH值、養殖水溫均有顯著性差異；2月齡、5月齡馬口魚的溶解氧無顯著性差異，5月齡、9月齡馬口魚溶解氧存在顯著性差異；2月齡、9月齡馬口魚的溶解氧存在顯著性差異。

表1 3組馬口魚養殖水質情況

2.2 馬口魚生長性能測定

2月齡、5月齡、9月齡馬口魚的生長性能檢測結果見表2。從體重來看，2月齡、5月齡、9月齡馬口魚呈遞增關系，但2月齡、5月齡存在顯著性差異，5月齡、9月齡無顯著性差異；從體長來看，2月齡、5月齡、9月齡馬口魚也呈遞增關系，2月齡、5月齡、9月齡馬口魚之間均存在顯著性差異；從肥滿度來看，5月齡與2月齡和9月齡均存在顯著性差異，2月齡和9月齡無顯著性差異，2月齡、5月齡、9月齡呈先增長后下降關系。

2.3 樣品腸道微生物測序質量分析

對2月齡、5月齡、9月齡馬口魚的腸道微生物16S rRNA 基因測序數據進行雙端拼接、質控以及嵌合體過濾后，共獲得有效序列1837607條。序列長度范圍為1～400bp，其中99.5%集中在361～380bp。3組樣品的覆蓋度均達到了0.999以上，表明檢測的樣本量具有代表性。從圖1也可以得出同樣的結論。物種累積曲線是用于描述隨著樣本量的加大物種增加的狀況，是調查樣本的物種組成和預測樣本中物種豐度的有效工具，在生物多樣性和群落調查中，被廣泛用于樣本量是否充分的判斷以及物種豐富度的估計。

表2 馬口魚不同生長階段生長性能

圖1 2月齡、5月齡、9月齡馬口魚腸道菌群的物種累計曲線

2.4 樣品腸道微生物多樣性分析

2月齡、5月齡、9月齡馬口魚OTU特征序列韋恩圖見圖2。共有OTU 43個，占總數的2.46%；2月齡、5月齡、9月齡馬口魚獨有OTU分別為886個、18個、552個。2月齡、5月齡共有OTU 56個，占兩者總數的4.56%，占各自總數的4.66%、68.3%；2月齡、9月齡共有OTU 302個，占兩者總數的17.4%，占各自總數的25.1%、36.3%；5月齡、9月齡共有OTU 51個，占兩者總數的5.91%，占各自總數的62.2%、6.13%。可見，2月齡、9月齡馬口魚的腸道菌群相似度更高。

圖2 馬口魚不同生長階段特征序列韋恩圖

2月齡、5月齡、9月齡馬口魚的腸道菌群多樣性情況見表3。從表3可以看出，描述物種豐富度的指標中，從Ace來看，2月齡、5月齡存在顯著性差異，而9月齡和2月齡、5月齡均無顯著性差異；從Chaol指數來看，2月齡、5月齡存在顯著性差異，2月齡、9月齡無顯著性差異，5月齡、9月齡存在顯著性差異。因算法不同，樣品之間的顯著性差異有細微差別。但2月齡、5月齡存在顯著性差異，2月齡、9月齡無顯著性差異是可以確定的。

Simpson指數值越大，說明群落多樣性越低。Shannon指數值越大，說明群落多樣性越高。從表3可以看出，無論根據Simpson指數值還是Shannon指數值，群落多樣性最高的樣品是2月齡，其次是9月齡，最低的是5月齡。2月齡與5月齡存在顯著性差異，5月齡與9月齡存在顯著性差異，2月齡與9月齡無顯著性差異。

表3 馬口魚不同生長階段腸道菌群多樣性統計

2.5 樣品腸道菌群組成分析

對3組樣品進行群落結構分析后，總共發現26個屬，見圖3。2月齡馬口魚腸道菌群豐度較高(≥1%)的為產堿桿菌屬(Alcaligenaceae)20.7%、氣單胞菌屬(Aeromonas)29.5%、鯨蠟桿菌屬(Cetobacterium)7.67%，醋酸桿菌屬(Cetobacterium)7.47%、足桿菌屬(Pedobacter)4.61%、假單胞菌屬(Pseudomonas)2.36%、未分類的桿菌屬(Bacilli_unclassified)3.50%、羅斯氏菌屬(Romboutsia)6.71%、Chloroplast4.85%、未分類的細菌屬(Bacteria_unclassified)2.76%、副梭菌屬(Paraclostridium)1.89%、毛螺菌屬(Lachnospiraceae)1.19%、Candidatus1.17%、其他(Others)13.1%。

5月齡馬口魚腸道菌群豐度較高(≥1%)的為氣單胞菌屬(Aeromonas)41.6%、支原體屬(Mycoplasmataceae)32.9%、鯨蠟桿菌屬(Cetobacterium)24.5%。

9月齡馬口魚腸道菌群豐度較高(≥1%)的為產堿桿菌屬(Alcaligenaceae)46.2%、足桿菌屬(Pedobacter)10.8%、假單胞菌屬(Pseudomonas)6.95%、未分類桿菌屬(Bacilli_unclassified)3.81%、Chloroplast1.62%、不動桿菌屬(Acinetobacter)4.35%、丙酸桿菌屬(Propionibacteriaceae)3.55%、未分類的細菌屬(Bacteria_unclassified)1.33%、明串珠菌屬(Trichococcus)3.24%、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)1.01%、其他(Others)16.3%。

圖3 2月齡、5月齡、9月齡屬水平下細菌相對豐度

從2月齡、5月齡、9月齡馬口魚的腸道菌群數據來看，馬口魚在2～5個月生長過程中，以氣單胞菌屬(Aeromonas)、鯨蠟桿菌屬(Cetobacterium)為主導菌屬，9個月時這2種菌屬幾乎消失，出現了更多種類的其他菌屬。通過PERMANOVA分析，發現有顯著性差異的菌屬有產堿桿菌屬(Alcaligenaceae)P<0.01，Enterobacterales_unclassified P<0.05，MesotogaP<0.01，Methyloparacoccus P<0.05，足桿菌屬(Pedobacter)P<0.01，PropioniciclavaP<0.01，假單胞菌屬(Pseudomonas)P<0.01，羅斯氏菌屬(Romboutsia)P<0.05，Spirochaetaceae_uncultured P<0.05.對3組樣品進行群落結構分析后，總共發現7個門。見圖4。

圖4 2月齡、5月齡、9月齡門水平下細菌相對豐度

2月齡馬口魚腸道菌群豐度較高(≥1%)的為變形菌門(Proteobacteria)55.6%、厚壁菌門(Firmicutes)17.6%、梭桿菌門(Fusobacteriota)7.78%、擬桿菌門(Bacteroidota)6.36%、放線菌門(Actinobacteriota)1.89%、藍菌門(Cyanobacteria)4.89%、未分類的細菌(Bacteria_unclassified)2.76%、Synergistota1.18%、其他(Others)2.02%。

5月齡馬口魚腸道菌群豐度較高(≥1%)的為變形菌門(Proteobacteria)41.9%、厚壁菌門(Firmicutes)33.2%、梭桿菌門(Fusobacteriota)24.5%。

9月齡馬口魚腸道菌群豐度較高(≥1%)的為變形菌門(Proteobacteria)63.1%、厚壁菌門(Firmicutes)10.1%、擬桿菌門(Bacteroidota)13.4%、放線菌門(Actinobacteriota)8.11%、藍菌門(Cyanobacteria)1.66%、未分類的細菌(Bacteria_unclassified)1.33%、其他(Others)2.15%。

從2月齡、5月齡、9月齡馬口魚的腸道菌群數據來看，馬口魚在2～5個月的生長過程中，以變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、梭桿菌門(Fusobacteriota)為主，占比達到81.0%～99.6%。9個月的馬口魚梭桿菌門(Fusobacteriota)消失。2月齡的馬口魚與成魚馬口魚菌門的群落結構呈現高度相似性。通過PERMANOVA分析，發現有顯著性差異的菌門有放線菌門(Actinobacteriota)P<0.05，擬桿菌門(Bacteroidota)P<0.01，PlanctomycetotaP<0.05，ThermotogotaP<0.01。

3 討論

3.1 馬口魚生長性能

本研究發現，2月齡、5月齡、9月齡的馬口魚體重在馬口魚水花下塘后2～5個月期間迅速增長，5～9個月期間生長速度減緩，表現為體重2～5個月有顯著差異，5～9個月無顯著性差異；2月齡、5月齡、9月齡的馬口魚之間體長均存在顯著性差異。肥滿度在2～5月齡期間上升，5～9月齡期間下降。這與塔里木裂腹魚的生長規律相同。原因是小個體的魚正處于生長階段，攝入能量主要供給身體的生長發育，肥滿度增加較快，隨著魚的生長，較大個體的魚攝入的能量除了供應身體生長發育外，還需要儲存足夠的能量進行繁殖活動，導致肥滿度下降[8]。

3.2 樣品腸道微生物多樣性

無論是OTU韋恩圖還是ACE、Chaol指數、Shannon指數、Simpson指數，都說明2月齡、9月齡馬口魚樣品的腸道菌群相似度更高。本試驗2月齡、5月齡、9月齡的馬口魚飼料成分都一樣，所以不同月齡馬口魚的腸道菌群的差異性可排除飼料的影響因素。2月齡、9月齡馬口魚樣品的肥滿度也無顯著性差異，與腸道菌群的變化規律相同。養殖水質也是需要考慮的因素。2月齡養殖水溫最高，從4個指數來看，2月齡腸道菌群菌種豐富度和多樣性也是最高的，這和Macmillan、Al-Harbi等的研究結論相同[9，10]。

3.3 樣品腸道菌群組成

無論是從屬還是門水平來看，都是2月齡、9月齡馬口魚樣品的腸道菌群相似度更高，5月齡馬口魚樣品腸道菌群物種豐富度都明顯低于2月齡、9月齡馬口魚樣品。這和樣品腸道微生物多樣性的規律相同。具體來看，2月齡和5月齡相同的菌屬是氣單胞菌屬(Aeromonas)和鯨蠟桿菌屬(Cetobacterium)，占比分別是37.2%、66.1%。氣單胞菌屬(Aeromonas)被鑒定為可能有助于消化的魚腸道微生物群[11]。2月齡、9月齡相同的菌屬是產堿桿菌屬(Alcaligenaceae)、足桿菌屬(Pedobacter)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、Chloroplast，占比分別是32.5%、65.6%。5月齡、9月齡沒有相同的菌屬。Neuman C等對鮭魚的研究發現了季節性水溫變化與腸道微生物組成變化之間的關系。這項研究表明，溫度升高(高達21℃)與乳酸菌(LAB)和不動桿菌屬(acinetoobactspp)的消失有關[12]。2月齡和5月齡馬口魚樣品養殖水溫均超過21℃，未發現乳酸菌(LAB)和不動桿菌屬(acinetoobactspp)，9月齡馬口魚養殖水溫降到10℃以下時，出現了不動桿菌屬(acinetoobactspp)，這與Neuman C等的研究結論相同。

2月齡和5月齡相同的門是變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、梭桿菌門(Fusobacteriota)，分別占比81.1%、99.6%；2月齡和9月齡相同的門是變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidota)、放線菌門(Actinobacteriota)、藍菌門(Cyanobacteria)，分別占比86.3%、96.4%；5月齡和9月齡相同的門是變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)，分別占比75.1%、73.2%。研究發現，變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidota)是魚類腸道菌群中最常見的菌門[13]。

4 結論

魚類的腸道微生物群負責關鍵的生理功能，有助于消化，能夠影響魚類的營養、生長、繁殖、總體種群動態以及宿主對疾病的抵抗力[14]。也有文獻證明，在水生動物中，腸道微生物負責消化藻細胞，產生氨基酸和分泌抑制性化合物，以防止細菌病原體對腸道的定殖[15]。以上這些功能都有助于維持宿主的健康。鑒于魚類所面臨的環境變化，尤其是鑒于水產養殖業的增長和氣候變化導致的養殖水溫度上升，了解其組成及其在健康和疾病方面的確切功能作用至關重要。

當喂養飼料不發生變化時，養殖水溫是影響馬口魚菌屬的關鍵因素之一。當水溫由29.0℃降到24.5℃時，存在共同的菌屬氣單胞菌屬(Aeromonas)和鯨蠟桿菌屬(Cetobacterium)；當水溫由24.5℃降到6.61℃時，共同的菌屬消失，但是菌屬種類增加。雖然水溫由24.5℃降到6.61℃時溶解氧也發生了顯著性差異，但還未查到相關文獻表明，溶解氧的變化是導致菌屬變化的原因。

馬口魚腸道菌群豐富度和多樣性和馬口魚的肥滿度變化規律相同。2月齡和9月齡的馬口魚腸道菌群豐富度和多樣性都無顯著性差異。但2月齡和9月齡的馬口魚腸道菌群豐富度和多樣性與5個月齡的馬口魚均存在顯著性差異。2月齡的馬口魚和9月齡的馬口魚肥滿度無顯著性差異，2月齡和9月齡的馬口魚肥滿度與5月齡的馬口魚均存在顯著性差異。

不同生長階段馬口魚腸道菌群與養殖水溫、溶解氧、肥滿度的關系可為養殖過程進行養殖環境調控提供科學依據。但關于溶解氧、肥滿度與馬口魚生長過程中菌群變化的機理還不夠明確，還需進行深入研究。