酪蛋白-金銀合金納米簇的制備及其對金霉素的熒光檢測

張嘉偉,徐 凡,耿永康,曹 蕾,王佳茜,周夢艷,付丁伊*

(1.南通大學 杏林學院,江蘇 南通 226236 ; 2.南通大學 藥學院 ,江蘇 南通 226001)

金霉素(CTC)是一種四環素類抗生素藥物,具有很強的抗菌消炎作用,臨床主要用于治療細菌引起的感染性疾病等,但其毒副作用較大,使用不當易引起胃腸道紊亂和肝毒性等[1-3]。此外,CTC常被用作飼料添加劑,可促進生長、改善飼養效率,同時具有預防動物疾病、改善消化代謝、抑制有害微生物等作用[4-6]。然而,過量使用會導致CTC在農副產品中殘留,這將嚴重威脅人類健康,導致不良的生理反應如過敏性反應,還會造成環境污染并引起細菌耐藥性。目前常用的測定方法有高效液相色譜法、免疫層析法、化學發光法和微生物法等[7-10]。但這些方法操作繁瑣,且易受雜質影響,抗干擾效果差[11]。因此,開發一種更加簡便快捷的方法定量檢測CTC具有重要意義。

近年來,金屬納米簇因其獨特的熒光特性,在環境檢測、細胞標記及成像等領域受到越來越多的關注,其中,蛋白質保護的金屬納米簇表現出優異的水溶性和熒光特性、光穩定性、低毒性等優點而被廣泛使用[12-17]。酪蛋白作為一種含磷鈣的結合蛋白,來源廣泛,極易獲取,且包含多個酪氨酸、色氨酸等還原性氨基酸,可以作為一種合成金屬納米簇的配體分子[18]?；诖?本研究以酪蛋白為保護劑和還原劑,通過一鍋加熱法優化制備金銀合金納米簇,并研究其對CTC的響應傳感。

1 實驗部分

1.1 實驗儀器

水浴鍋、漩渦震蕩儀,中國群安實驗儀器有限公司;RF-6000熒光光譜儀,日本島津公司;UV-3600紫外可見吸收光譜儀,日本島津公司;紅外光譜儀,德國布魯克公司;JEM-2200FS透射電鏡,日本電子株式會社。

1.2 試劑材料

HAuCl4·3H2O,Aladdin試劑公司;AgNO3,分析純,上海滬試生藥集團化學試劑有限公司;鹽酸金霉素、鹽酸土霉素、鹽酸四環素、鹽酸強力霉素,純度≥98%,麥克林試劑公司;NaOH、ZnCl2、CaCl2、KCl、Na2CO3、KBr、Mg(NO3)2·6H2O,純度≥98%,北京化工廠;亮氨酸、脯氨酸、絲氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、天冬酰胺、酪氨酸、組氨酸、半胱氨酸、纈氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸、色氨酸、異亮氨酸,純度≥98%,上海源葉生物科技有限公司。

1.3 Au-AgNCs@casein的合成

向2 mL樣品管中依次加入30 mg酪蛋白固體,750 μL的去離子水和50 μL濃度為3 mol/L的NaOH溶液,振蕩搖勻后在70 ℃條件下加熱20 min,再加入300 μL濃度為10 mmol/L的HAuCl4和50 μL濃度為10 mmol/L的AgNO3溶液,混合均勻,在70 ℃下加熱3 h,得到淡黃色溶液,產物置于4 ℃冰箱保存。

1.4 Au-AgNCs@casein的表征

利用熒光分光光度計測量Au-AgNCs@casein的熒光圖譜;使用紫外-可見光度計測量產物的紫外-可見吸收光譜(UV);使用透射電鏡(TEM)對Au-AgNCs@casein的形貌進行表征,并根據電鏡照片統計顆粒的尺寸大小分布。

1.5 Au-AgNCs@casein為熒光探針檢測CTC

將Au-AgNCs@casein凍干粉溶于去離子水,最終濃度為100 mg/L。然后向系統體系中加入不同濃度的CTC,混合均勻后室溫下孵育20 min,使用熒光光譜儀檢測325 nm激發波長條件下產物的熒光發射光譜,同時在日光或手提紫外燈照射條件下,拍攝加入不同濃度CTC的Au-AgNCs@casein照片,得到不同濃度的CTC對Au-AgNCs@casein溶液及熒光強度的影響。

1.6 評價CTC檢測的選擇性和抗干擾能力

利用熒光光譜評價Au-AgNCs@casein探針對CTC傳感的選擇性和抗干擾能力,將Au-AgNCs@casein探針分別與鹽酸金霉素、鹽酸土霉素、鹽酸四環素、鹽酸強力霉素在相同條件下孵育反應5 min,監測其熒光強度變化。在含有氨基酸,或含有Ca2+、K+、Br-、Mg2+等離子的條件下監測含/不含CTC的Au-AgNCs@casein的熒光發射強度。

2 結果和討論

2.1 Au-AgNCs@casein的合成與表征

如前所述,使用NaOH溶液將酪蛋白進行蛋白變性處理后,與HAuCl4和AgNO3混合70 ℃加熱反應3 h獲得Au-AgNCs@casein的水溶液。利用TEM對所得產物的形貌和結構進行分析,結果如圖1a所示,表明Au-AgNCs@casein接近球形,尺寸均一且單分散,粒徑尺寸分布在1.5～4.5 nm,如圖1b所示,平均粒徑為2.7 nm,尺寸分布較窄。

圖1 Au-AgNCs@casein的TEM圖像及粒徑分布統計圖

2.2 熒光和紫外可見吸收光譜分析

優化合成條件后制備得到的Au-AgNCs@casein在325 nm的最佳激發波長下,在445、660 nm處有雙熒光發射(圖2a),斯托克斯位移達到345 nm,說明產物具有穿透性強、對生物樣品的光損傷小、檢測靈敏度高等優點。日光下觀察該納米簇溶液顏色呈淡黃色,而365 nm手提紫外燈照射下呈明亮的紅色熒光(圖2a)。利用紫外-可見吸收光譜對Au-AgNCs@casein進行表征,結果如圖2b所示,在300～800 nm處沒有產生明顯的吸收峰,證明溶液中沒有形成具有等離子體吸收的大型納米粒子,而是以小尺寸的納米簇形式存在。

圖2 Au-AgNCs@casein的熒光光譜和紫外可見吸收光譜

2.3 以Au-AgNCs@casein為熒光探針檢測CTC

將不同濃度的CTC逐漸加入到Au-AgNCs@casein的溶液中,445 nm處的熒光強度逐漸增強,而660 nm處的熒光強度保持不變(圖3a),當CTC濃度達到5.5 μmol/L時,Au-AgNCs@casein的熒光發射峰強度達到最大。通過分析可知,產物的熒光強度與CTC的濃度(0～5.5 μmol/L)呈現良好的線性關系(圖3b)。

圖3 加入CTC后Au-AgNCs@casein的熒光發射光譜

向各Au-AgNCs@casein樣品中加入不同濃度的CTC,在日光和手提紫外燈光照射下分別拍攝照片見圖4。

圖4 不同濃度CTC加入Au-AgNCs@casein溶液后產物的照片

日光下添加了不同濃度CTC的Au-AgNCs@casein顏色沒有明顯的變化(圖4a),而在手提紫外燈光照射下,隨著檢測的CTC濃度逐漸升高,溶液顏色由紅色漸漸變為粉紫色(圖4b)。結合CTC濃度與熒光強度的線性關系結果可以說明,Au-AgNCs@casein可以作為一種有效且靈敏的比率型熒光探針,用于定量檢測CTC。

2.4 Au-AgNCs@casein檢測CTC的選擇性

在不改變反應條件的前提下,用相同的方法分別檢測其他四環素類抗生素(TCs,如鹽酸土霉素、鹽酸強力霉素和鹽酸四環素)對Au-AgNCs@casein熒光強度的影響(圖5)。

圖5 加入不同四環素類藥物后Au-AgNCs@casein在420 nm與650 nm處熒光強度比

結果表明,CTC可以使Au-AgNCs@casein在445 nm處的熒光明顯增強,而其余的抗生素對其影響相對較小,這充分說明Au-AgNCs@casein可以作為熒光探針靈敏、特異地檢測CTC。

2.5 Au-AgNCs@casein檢測CTC的抗干擾能力評價

由圖6a和6b可以看出,這些干擾因子對Au-AgNCs@casein本身稍有影響,但對于CTC的檢測幾乎沒有影響,說明Au-AgNCs@casein的抗干擾能力較強。

圖6 加入干擾物后Au-AgNCs@casein的熒光發射光譜

3 結論

以酪蛋白為配體,使用一鍋法成功合成了酪蛋白保護的金銀合金納米簇,合成方法簡單、易操作、成本低廉。該納米簇在325 nm激發波長條件下,在445 nm和660 nm處有雙熒光發射,可以作為一種新型的比率型熒光探針高效、高靈敏度和特異性檢測溶液中的CTC,且具有良好的選擇性和抗干擾能力。基于Au-AgNCs@casein易于合成且擁有良好的發光性等優秀特性,為開發廉價、靈敏的生物和環境探針提供新策略,同時為CTC的快速特異性檢驗提供新的材料和思路。