酚基殼聚糖季銨鹽的結(jié)構對抗菌和抗生物被膜活性的影響

王林, 辛梅華, 李明春, 石露露, 賴旺坤

(華僑大學 材料科學與工程學院, 福建 廈門 361021)

細菌生物被膜是多種表面附著的細菌細胞包裹在自分泌的細胞外聚合物中的多細胞三維組合,頑固的生物被膜廣泛存在。與獨立的、自由游動的浮游細菌相比,被包裹在生物被膜中的細菌對抗生素表現(xiàn)出更強的抵抗力,因此,一旦細菌生物被膜感染形成,就很難根除或治愈[1-2]。

酚類化合物在自然界中廣泛存在,且酚類化合物具有一定的抗菌活性,如香芹酚、沒食子酸、丁香酚和水楊酸等,將天然酚酸接枝到殼聚糖上可以改善殼聚糖的抗菌活性[3]。常見的酚基殼聚糖的制備方法有自由基接枝法、酶介導反應、EDC/NHS縮合反應、席夫堿反應等[4-8]。Kim等[9]研究了咖啡酸、阿魏酸和芥子酸接枝的殼聚糖對銅綠假單胞菌和單核細胞增多性李斯特菌的抗菌和抗生物被膜活性,制備的殼聚糖衍生物在0.5MIC(最低抑菌質(zhì)量濃度)可以顯著降低生物被膜的黏附,具有抗菌和抗生物被膜的潛力。Yang等[10]采用碳二亞胺法制備殼聚糖接枝綠原酸(CS-g-CA),產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌(S.aureus)的MIC為0.625 mg·mL-1,MIC能顯著抑制生物被膜的形成,2MIC可以清除77.53%的成熟生物被膜。Khan等[11]采用離子凝膠化技術將間苯三酚(PG)封裝到殼聚糖納米顆粒(CSNP)中,制備的PG-CSNP對白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、變形鏈球菌具有抑制作用,且PG-CSNP抑制生物被膜形成和清除生物被膜能力優(yōu)于間苯三酚。

酚類改性殼聚糖可以得到具有良好抗菌活性的酚類殼聚糖衍生物,但各種酚基結(jié)構對抗菌活性、抗生物被膜活性的影響缺乏系統(tǒng)的比較。基于此,本文以殼聚糖為原料,制備鄰羥基苯甲酰化殼聚糖(OPC)、間羥基苯甲酰化殼聚糖(MPC)、對羥基苯甲酰化殼聚糖(PPC)、3,5-二羥基苯甲酰化殼聚糖(DPC)、3,4,5-三羥基苯甲酰化殼聚糖(TPC)5種酚基殼聚糖,研究酚基殼聚糖中酚基位置、酚基數(shù)量對殼聚糖抗菌活性及抗生物被膜活性的影響,在此基礎上制備酚基殼聚糖季銨鹽,并對抗菌活性和抗生物被膜活性進行比較。

1 實驗部分

1.1 主要試劑和儀器

殼聚糖(CS,脫乙酰度為89%,分子質(zhì)量為50 ku),山東省青島市海匯生物工程有限公司;2,3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨,山東省東營市國豐精細化工有限公司;水楊酸、苯甲醛、對羥基苯甲酸,上海市國藥集團化學試劑有限公司;間羥基苯甲酸、3,5-二羥基苯甲酸,上海市安耐吉化學技術有限公司;沒食子酸,上海市阿拉丁生化科技股份有限公司。其他試劑均為市售分析純。

Avance Ⅲ 500 MHz型核磁共振波譜儀,德國Bruker公司;Vario EL cube型元素分析儀,德國Elementar公司;FD-1B-50型冷凍干燥機,北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司。

1.2 殼聚糖衍生物的制備

1.2.1 酚基殼聚糖的制備[12]將1.6 g殼聚糖機械攪拌溶解于50 mL體積分數(shù)為2%的醋酸溶液中,稱取和殼聚糖氨基等物質(zhì)的量的酚酸溶解于50 mL甲醇中,加入1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS),攪拌至完全溶解。將酚酸溶液緩慢滴加到殼聚糖溶液中,30 ℃反應24 h,反應結(jié)束后經(jīng)透析、冷凍干燥,可得酚基殼聚糖。

1.2.2 酚基季銨化殼聚糖的制備[13]經(jīng)苯甲醛和殼聚糖的氨基反應得到N-苯亞甲基殼聚糖(CSBA),在CSBA的羥基上引入季銨鹽制備O-(2-羥丙基三甲基氯化銨)-N-苯亞甲基殼聚糖(QACSBA),經(jīng)脫保護,可得O-(2-羥丙基三甲基氯化銨)殼聚糖(QACS)。

將1.6 g QACS攪拌溶解于50 mL去離子水中,稱取0.7 g對羥基苯甲酸溶解于50 mL甲醇中,加入1.0 g的EDC和0.6 g的NHS,攪拌至完全溶解。將對羥基苯甲酸溶液緩慢滴加到QACS溶液中,30 ℃攪拌反應24 h,反應結(jié)束后經(jīng)透析、冷凍干燥,可得O-(2-羥丙基三甲基氯化銨)-N-對羥基苯甲酰化殼聚糖(QAPPC)。酚基殼聚糖季銨鹽的制備路線,如圖1所示。

圖1 酚基殼聚糖季銨鹽的制備路線Fig.1 Preparation route of phenol-based chitosan quaternary ammonium salt

1.3 產(chǎn)物的表征

1.3.1 核磁共振氫譜(1H NMR)分析 將制備的殼聚糖衍生物溶解于D2O中,使用Avance Ⅲ 500 MHz型核磁共振波譜儀測定產(chǎn)物的1H NMR,測試溫度為22 ℃,采樣次數(shù)為64次。

1.3.2 取代度測定 殼聚糖及其衍生物經(jīng)真空干燥至恒質(zhì)量,使用Vario EL cube型元素分析儀測定其C,N,H的質(zhì)量分數(shù),依據(jù)碳氮比計算殼聚糖的脫乙酰度和產(chǎn)物的取代度[12]。

1.4 產(chǎn)物的抗菌活性測試

通過最低抑菌質(zhì)量濃度、最低殺菌質(zhì)量濃度(MBC)、抑菌率表征產(chǎn)物的抗菌活性;通過最低生物被膜形成抑制質(zhì)量濃度(MBIC)、最低生物被膜殺滅質(zhì)量濃度(MBBC)、生物被膜抑制率和生物被膜清除率表征產(chǎn)物抗生物被膜活性,具體測試參照文獻[12]。

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)物的1H NMR

殼聚糖衍生物的1H NMR譜圖,如圖2所示。圖2中:δ為化學位移;4.7對應的是D2O的溶劑峰。

(a) OPC (b) MPC

由圖2可知:不同結(jié)構酚基殼聚糖的1H NMR譜圖主要區(qū)別在于6～8處的苯環(huán)氫質(zhì)子的特征峰;OPC和MPC由于酚基取代基位于苯環(huán)的鄰位或間位上,空間不對稱, 在核磁氫譜上苯環(huán)的特征峰的位置存在偏差;PPC和DPC產(chǎn)物的1H NMR譜圖在6～8處出現(xiàn)的氫質(zhì)子特征峰有兩個,這是因為兩種產(chǎn)物上接枝的苯酚基團屬于對稱結(jié)構,PPC的1H NMR譜圖在結(jié)構上出現(xiàn)的兩個氫質(zhì)子特征峰的峰面積一致,DPC的1H NMR譜圖雖然也有兩個苯環(huán)上的氫質(zhì)子特征峰,但這兩個特征峰的峰面積比例為1∶2;TPC的1H NMR譜圖中3個酚基占用苯環(huán)上的3個氫,剩余的2個氫在空間屬于對稱結(jié)構,在核磁共振氫譜上有相同的化學位移,故只有1個特征峰[14];QAPPC的1H NMR譜圖在3.1處出現(xiàn)季銨鹽上甲基的質(zhì)子峰,此外,在6～8處出現(xiàn)2個氫質(zhì)子的特征峰,對應苯環(huán)上的氫質(zhì)子,表明QAPPC分子結(jié)構中含有苯環(huán)。核磁共振氫譜表明酚基殼聚糖季銨鹽已成功制備。

2.2 產(chǎn)物的取代度

殼聚糖衍生物的元素分析和取代度,如表1所示。表1中:w為質(zhì)量分數(shù);DD為脫乙酰度;DS為取代度。由表1可知:殼聚糖的脫乙酰度為86.0%;OPC,MPC,PPC,DPC和TPC的取代度相近;CSBA中用于保護殼聚糖氨基的苯亞甲基的取代度為64.9%,進一步在CSBA的羥基進行季銨化得到的QACSBA中季銨鹽的取代度為20.1%,經(jīng)脫保護后發(fā)現(xiàn),用于保護氨基的苯亞甲基并未完全脫除,未脫除的苯亞甲基的殘余量僅為1.6%,以此為原料制備的QAPPC對羥基苯甲酰的取代度為16.9%,與PPC中對羥基苯甲酰的取代度基本一致(15.4%),相近的取代度有利于后續(xù)性能的比較。

表1 殼聚糖衍生物的元素分析和取代度Tab.1 Elemental analysis and substitution degree of chitosan derivatives

2.3 酚基季銨化殼聚糖的抗菌活性

2.3.1 最低抑菌質(zhì)量濃度和最低殺菌質(zhì)量濃度 大腸桿菌(E.coli)和金黃色葡萄球菌(S.aureus)生物被膜形成前后耐藥性變化,如表2所示。

表2 大腸桿菌和金黃色葡萄球菌生物被膜形成前后耐藥性變化Tab.2 Changes of drug resistance before and after biofilm formation in E. coli and S. aureus

由表2可知:酚基殼聚糖對E.coli的MIC均為625 μg·mL-1,MBC均為1 250 μg·mL-1; PPC,TPC對E.coli的MBIC為1 250 μg·mL-1, 而OPC,MPC和DPC的MBIC為2 500 μg·mL-1;清除E.coli生物被膜需要的PPC,TPC的最低質(zhì)量濃度為5 000 μg·mL-1,清除E.coli生物被膜需要的OPC,MPC和DPC的最低質(zhì)量濃度均大于5 000 μg·mL-1;QACS,PPC對E.coli的MIC,MBIC相同,分別為625,1 250 μg·mL-1,而QAPPC對E.coli的MIC和MBIC均低于QACS,PPC,分別為313,625 μg·mL-1;QACS對E.coli的MBC為2 500 μg·mL-1,而PPC,QAPPC對E.coli的MBC均為1 250 μg·mL-1,QACS,PPC對E.coli的MBBC均為5 000 μg·mL-1,而QAPPC的MBBC為2 500 μg·mL-1;將季銨鹽和對羥基苯甲酰基同時引入殼聚糖分子結(jié)構中,得到的QAPPC對E.coli的抑菌效果優(yōu)于PPC,QACS。

由表2可知:除PPC外,其余4種酚基殼聚糖對S.aureus的MIC和MBC一致,分別為78,313 μg·mL-1,而PPC對S.aureus的MIC為39 μg·mL-1;當形成生物被膜后,最低殺菌質(zhì)量濃度出現(xiàn)差異,當PPC質(zhì)量濃度為1 250 μg·mL-1時,可以完全清除S.aureus形成的生物被膜,而清除S.aureus形成的生物被膜的OPC,MPC,DPC和TPC需要的最低質(zhì)量濃度為2 500 μg·mL-1。

2.3.2 產(chǎn)物的抑菌率 不同質(zhì)量濃度(ρ)的酚基殼聚糖季銨鹽的抑菌率(η1),如圖3所示。

(a) E. coli (b) S. aureus 圖3 酚基殼聚糖季銨鹽的抑菌率Fig.3 Antibacterial rates of phenol-based chitosan quaternary ammonium salt

由圖3可得以下3點結(jié)論。

1) 酚基的位置和數(shù)量均能影響殼聚糖的抗菌活性。在相同質(zhì)量濃度時,單酚基殼聚糖衍生物的抗菌活性排序為PPC>OPC>MPC;酚基殼聚糖的抗菌活性不僅與酚基的位置有關,還與酚基的數(shù)量有關,這是因為酚基殼聚糖是通過酰胺鍵將苯酚接枝到殼聚糖的氨基上,將殼聚糖的單元糖苷鏈看成是一個整體,酰胺基團是吸電子基團,吸電子的取代基可以增強苯酚的酸性,酰胺基團位于酚基的鄰位和對位時,苯氧基負離子的負電荷可以分散到酰胺基團上,使苯酚的酸性強于間位異構體[15],當酚基位于取代基的對位時,空間位阻較小,暴露在外面的酚基與細菌接觸幾率增加,抗菌活性優(yōu)于鄰位酚基,這與抗菌活性變化趨勢一致。

2) 酚基的數(shù)量發(fā)生改變時,抗菌活性排序為TPC>MPC>DPC,并不隨酚基數(shù)量變化呈現(xiàn)規(guī)律性變化,酚基的數(shù)量對殼聚糖抗菌活性的影響還與酚基的位置有關。DPC的抗菌活性弱于MPC,雖然增加了酚基的數(shù)量,但這兩個酚基均可視為間位酚基,進一步弱化了苯酚的酸性,表現(xiàn)出較差的抗菌活性。TPC的抗菌活性較DPC得到增強,盡管TPC有兩個酚基位于間位上,但對位酚基的存在增強了苯酚的酸性,表現(xiàn)出的抗菌活性優(yōu)于DPC。由酚基季銨化殼聚糖對S.aureus的抑菌率可知,除MPC,DPC外,其余3種酚基殼聚糖對S.aureus的抑菌率均為100.0%。在制備的5種酚基殼聚糖中,PPC的抗菌活性最強,質(zhì)量濃度為0.5 mg·mL-1的PPC,TPC對E.coli的抑菌率分別為78.2%,51.4%。

3) 對比相同質(zhì)量濃度下的PPC,QACS和QAPPC的抑菌率,QAPPC的抗菌活性優(yōu)于QACS和PPC,QAPPC是將對羥基苯甲酸通過縮合反應接枝到QACS的分子結(jié)構中,故季銨鹽基團和酚基對提升殼聚糖的抗菌活性具有協(xié)同作用,質(zhì)量濃度為0.5 mg·mL-1的QAPPC對E.coli和S.aureus的抑菌率分別為83.3%,100.0%。

2.3.3 菌懸液中的蛋白質(zhì)含量 通過考馬斯亮藍法測定菌懸液中的蛋白質(zhì)含量,因受標準曲線誤差、細菌培養(yǎng)批次等的影響,故實驗中以波長595 nm下的OD值(D)表示蛋白質(zhì)含量。將殼聚糖衍生物與細菌共培養(yǎng)30 min后,可得酚基殼聚糖季銨鹽作用后菌懸液中蛋白質(zhì)含量,如圖4所示。由圖4可知:在酚基數(shù)量相同時,MPC處理后的菌懸液中蛋白質(zhì)含量最低,這與抑菌率測試結(jié)果一致;當酚基的數(shù)量發(fā)生改變時,TPC處理后的菌懸液中蛋白質(zhì)含量最高;對于E.coli,經(jīng)PPC處理后的菌懸液中蛋白質(zhì)含量高于DPC,而S.aureus卻出現(xiàn)相反的結(jié)果,這與細菌結(jié)構及抗菌機理有關。

(a) E. coli (b) S. aureus圖4 酚基殼聚糖季銨鹽作用后菌懸液中蛋白質(zhì)含量Fig.4 Content of protein effected by phenol-based chitosan quaternary ammonium salt

結(jié)合抑菌率的數(shù)據(jù)可知,在相同質(zhì)量濃度下,抑菌率排序為PPC>TPC>DPC,然而,菌懸液中蛋白質(zhì)含量的變化并不完全相符,這可能是酚基殼聚糖與細菌相互作用時,不僅與破壞細胞膜結(jié)構改變細胞膜通透性有關,還可能與抑制胞內(nèi)酶的活性有關[16]。QAPPC與細菌接觸后的菌懸液中蛋白質(zhì)含量高于PPC,QACS,菌懸液中蛋白質(zhì)含量的變化趨勢與抑菌率的變化趨勢一致。

2.3.4 產(chǎn)物對生物被膜形成的抑制率 酚基殼聚糖季銨鹽對生物被膜形成的抑制率(η2),如圖5所示。由圖5可得以下3點結(jié)論。

(a) E. coli (b) S. aureus圖5 酚基殼聚糖季銨鹽對生物被膜形成的抑制率Fig.5 Inhibition rates of phenol-based chitosan quaternary ammonium salt on biofilm formation

1) 酚基殼聚糖季銨鹽對兩種細菌的生物被膜形成的抑制率出現(xiàn)相同的趨勢,當酚基數(shù)量相同時,對生物被膜形成的抑制效果排序為PPC>OPC>MPC,與抑菌率和蛋白質(zhì)含量變化趨勢一致;1/2MIC的PPC對E.coli和S.aureus生物被膜形成的抑制率分別為70.7%,76.3%。

2) 增加酚基的數(shù)量可以改善殼聚糖衍生物對生物被膜的抑制效果。對生物被膜形成的抑制率排序為TPC>DPC>MPC,1/2MIC的TPC對E.coli和S.aureus生物被膜形成的抑制率分別為69.7%,77.7%。生物被膜的形成不僅與外界環(huán)境有關還與細菌多種基因的表達有關[10]。

3) 在相同質(zhì)量濃度下,對生物被膜形成的抑制率排序為QAPPC>PPC>QACS,表明將對羥基苯甲酰引入QACS中可以提高QACS對生物被膜形成的抑制率。1/2MIC的QAPPC對E.coli和S.aureus生物被膜形成的抑制率分別為74.7%,77.6%。

2.3.5 產(chǎn)物對生物被膜的清除率 酚基殼聚糖季銨鹽對生物被膜的清除率(η3),如圖6所示。由圖6可知以下2點結(jié)論。

(a) E. coli (b) S. aureus圖6 酚基殼聚糖季銨鹽對生物被膜的清除率Fig.6 Biofilm removal rates of phenol-based chitosan quaternary ammonium salt

1) 產(chǎn)物對S.aureus形成的生物被膜的清除率優(yōu)于對E.coli的生物被膜的清除率,這與抑菌率的結(jié)果一致;酚基的位置改變對生物被膜的清除效果與抑菌率的變化趨勢一致,對生物被膜的清除效果的排序為PPC>OPC>MPC,質(zhì)量濃度為2.5 mg·mL-1的PPC對E.coli和S.aureus形成的生物被膜的清除率分別為75.3%,87.7%。值得注意的是,增加酚基的數(shù)量并不能夠提高殼聚糖對生物被膜的清除效果。

2) 在相同質(zhì)量濃度下,對生物被膜的清除效果排序為QAPPC>PPC>QACS,這表明將對羥基苯甲酸接枝到QACS的分子結(jié)構中可以進一步提高QACS對生物被膜的清除率,季銨鹽基團和酚基具有協(xié)同作用;質(zhì)量濃度為2.5 mg·mL-1的QAPPC對E.coli,S.aureus形成的生物被膜的清除率分別為77.4%,92.4%。

3 結(jié)論

1) 制備酚基殼聚糖季銨鹽,通過核磁共振氫譜表征產(chǎn)物的結(jié)構。通過元素分析計算得出QACS季銨鹽取代度為20.1%,酚基的取代度為15.4%～24.4%。OPC,MPC,PPC,DPC和TPC的取代度分別為24.4%,21.6%,15.4%,22.3%和21.5%。以取代度為20.1%的QACS季銨鹽為原料制備的QAPPC中,對羥基苯甲酰基的取代度為16.9%。

2) 抗菌測試和抗生物被膜測試結(jié)果表明,影響酚基殼聚糖抗菌活性的主要因素是酚基的位置,其次是酚基的數(shù)量,PPC的抗菌活性和抗生物被膜活性最佳。抗菌活性和清除生物被膜的能力排序為PPC>OPC>MPC。酚基的數(shù)量對殼聚糖抗菌活性的影響與酚基的位置有關,增加酚基的數(shù)量并不一定能夠提高酚基殼聚糖的抗菌活性。質(zhì)量濃度為0.5 mg·mL-1的PPC對E.coli和S.aureus的抑菌率分別為78.2%,100.0%,1/2MIC的PPC對E.coli,S.aureus生物被膜形成的抑制率分別為70.7%,76.3%,質(zhì)量濃度為2.5 mg·mL-1的PPC對E.coli和S.aureus所形成的生物被膜的清除率分別為75.3%,87.7%。

3) QAPPC的抗菌活性和抗生物被膜活性均優(yōu)于單一改性的殼聚糖衍生物(QACS和PPC),季銨鹽和酚基具有協(xié)同抗菌活性.質(zhì)量濃度為0.5 mg·mL-1的QAPPC對E.coli的抑菌率為83.3%,高于相同質(zhì)量濃度下QACS對E.coli的抑菌率(39.5%)和PPC對E.coli的抑菌率(78.2%)。1/2MIC的QAPPC對E.coli和S.aureus生物被膜形成的抑制率分別為74.7%,77.6%。質(zhì)量濃度為2.5 mg·mL-1的QAPPC對E.coli和S.aureus形成的生物被膜的清除率分別為77.4%,92.4%。