經顱重復針刺對血管性癡呆模型大鼠認知功能及海馬突觸超微結構的影響

于國強,孫婧妍,關瑩,唐祎周,楊添淞,石光煜,馮秋菊,曹燚,吳壯,張良,李紅偉

(1.黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院,哈爾濱 150001;2.黑龍江中醫藥大學,哈爾濱 150040;3.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院,哈爾濱 150040;4.孫申田名老中醫工作室,哈爾濱 150006)

血管性癡呆(vascular dementia,VaD)是指因由各類腦血管疾病造成腦區低灌注導致智能獲得性損傷,引起記憶減退,行為、認知障礙的綜合征。VaD有高發病率和高致殘率的特點。流行病學調查[1]發現,VaD在中國的發病率已超過阿爾茨海默病,成為發病率最高的癡呆類型;VaD不但導致患者生活無法自理、生活質量下降,還給患者家庭帶來極大負擔。目前,現代醫學對VaD缺乏公認的治療方案[2],現有治療方案,對患者認知功能改善效果不明顯[3],無法有效提高患者工作、學習和社交能力。經顱重復針刺刺激(repetitive transcranial acupuncture stimulation,rTAS)可對神經系統產生良性影響[4],對帕金森病導致輕度認知障礙,能明顯改善患者臨床癥狀[4];對原發性失眠及卒中后睡眠障礙療效確切[5-6];對VaD伴失語有顯著臨床優勢[7],于情感區行經顱重復針刺刺激對于改善腦梗死后輕度認知障礙患者視空間與執行功能、注意和計算力、延遲回憶能力等優于常規針刺手法[8],但作用機制尚不完全明確,本研究應用rTAS干預VaD模型大鼠,觀察其對大鼠認知功能及海馬CA1區海馬突觸素(synaptophysin,SYN)、微管相關蛋白-2(microtubule associated protein-2,MAP-2)表達的影響,探討經顱重復針刺對VaD的作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級雄性SD 大鼠56 只,體質量(200±20)g,由黑龍江中醫藥大學動物實驗中心提供,許可證號SCXK(黑)2019012。在自然晝夜采光,室溫18～28 ℃,相對濕度40%～70%中適應性喂養1 周。

1.2 主要試劑與儀器

MAP-2 單克隆抗體(ab33580,美國Abcam);SYP 單克隆抗體(sc-365447,美國 Santa);RIPA 裂解液(AWB-0101,美國Abmart);BCA 蛋白濃度測定試劑盒(P0011,上海碧云天);熒光染料試劑盒(B2261-1G,德國SIGMA);反轉錄試劑盒(mlT6101-2,上海Mlbio);預染蛋白質量標準(P0060M,上海碧云天)。Morris 水迷宮(SN0159858,重慶威斯騰);曠場箱(ZH-OFT,安徽正華);電泳儀電源(PowerPac,美國BIO-RAD);電泳槽(Mini-PROTEAN Tetra,美國BIO-RAD);SYD-K4080A 切片機(81-0478-02,日本Asone);透射電子顯微鏡(Tem,北京藍木)。

1.3 模型制備與分組

根據隨機數字表法將大鼠分為空白組(14只)和造模組(42只)。造模組采用大腦中動脈線栓缺血再灌注造模方法建立左側局灶缺血性腦卒中模型大鼠[9]。步驟為麻醉→激光多普勒血流儀定位左側大腦中動脈→切開頸部皮膚→暴露左側頸總動脈、頸內動脈、頸外動脈→結扎頸外動脈、近心端頸總動脈→動脈微血管夾夾閉頸內動脈→頸總動脈遠端剪V型切口→0.28 mm直徑線栓于切口導入18～22 mm,阻斷左側大腦中動脈起始部血流→激光多普勒血流儀顯示血流下降至基礎值10%～20%→頸內動脈結扎→固定線栓→缺血2 h后回抽線栓至頸總動脈分叉處,使左側大腦中動脈恢復灌注→縫合、消毒、抗感染[10]。大鼠生命體征平穩后,參照Zea Longa評分[11-12],評估造模組大鼠神經功能缺損情況,1～3分說明模型成功。選擇造模成功大鼠進行Morris水迷宮檢測,以正常組大鼠的平均逃避潛伏期為參考值,計算手術組大鼠平均逃避潛伏期和參考值差值與該鼠平均逃避潛伏期的比值,比值＞20%為造模成功[13]。實驗過程和蘇醒期間,大鼠體溫保持在(37±0.5)℃?？瞻捉M僅分離頸總動脈、頸內動脈、頸外動脈,但不結扎、插線,稍后縫合傷口。將最終造模成功大鼠隨機分為模型組(14只)、常規針刺組(14只)和rTAS組(14只)。

1.4 干預方法

1.4.1 rTAS組

造模后,參考《實驗針灸學》[14]中的定位方法(百會,項骨正中,向后斜刺2 mm;神庭,前正中線上,在額頂骨縫交界線前方處,向上斜刺2 mm)。穴位局部碘伏消毒2次后,采用經顱重復針刺。具體操作為用0.5寸毫針,與皮膚呈15°角斜向刺入3 mm;然后行快速捻轉手法200轉/min,每穴捻轉3～5 min,留針30 min,每日1次,共14 d,術后第2天開始干預。

1.4.2 常規針刺組

造模后,大鼠固定、選穴、針刺時間、針刺深度、針刺角度、干預開始日期及干預天數同rTAS組,僅給予常規刺激量,即行捻轉手法,60轉/min左右,每穴捻轉1 min。得氣后,行平補平瀉手法,每日1次,共14 d,術后第2天開始干預。

1.4.3 模型組

造模后,將大鼠回籠飼養,僅予以同等條件抓取及固定,不予針刺。

1.4.4 空白組

大鼠回籠飼養,同等條件抓取及固定,不予針刺。

1.5 觀察指標與檢測方法

1.5.1 Morris 水迷宮測試

實驗用水迷宮為高60 cm、直徑150 cm的圓形水池,水深30 cm,水溫維持(24±2)℃,于水池第三象限放置直徑6 cm 圓柱形平臺。干預后第10 天進行定位航行實驗,用時4 d。實驗前讓大鼠放置在平臺上自由活動1 min 以熟悉周圍環境及實驗人員,然后從水池四個象限順時針依次將大鼠放入水中,記錄其在90 s 內找到平臺的時間作為逃避潛伏期。若在90 s 內大鼠未能找到平臺,由研究人員輔助其到平臺,并停留15 s,同時記錄其潛伏期為90 s。干預后第14 天進行空間探索試驗,用時1 d。具體方法為先將第三象限的平臺撤除,大鼠同樣由第一象限放入水中,記錄大鼠90 s 內穿過平臺所在位置的次數。

1.5.2 曠場實驗

干預后第14 天進行曠場實驗,用時1 d。實驗用曠場箱尺寸為60 cm×100 cm×100 cm。具體方法為將曠場箱底面平均分為25 個小方格,記錄大鼠3 min內穿越格子數(水平運動)和后肢站立數(垂直運動)。

1.5.3 海馬CA1 區SYN、MAP-2 蛋白表達

采用Western blot 法,4 組取10 只大鼠快速斷頭處死后,在冰盤上每只大鼠于視交叉后1 mm 及4 mm處冠狀切面切開,快速取中間腦組織即海馬CA1 區組織50 mg,加入裂解液,60 Hz、90 s 勻漿2 次后,4 ℃,12 000 r/min 離心5 min,采用BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定上清蛋白含量。取40 μg 總蛋白進行SDS-PAGE電泳,轉膜,質量分數5%脫脂奶粉封閉,分別加入一抗SYP 鼠單抗(1:1 000)、鼠單抗MAP-2(1:1 000),4 ℃過夜,以β-actin 鼠單抗為參照,再分別加入相應二抗IgG(HRP-標記羊抗鼠)室溫孵育1 h。ECL 曝光成像,化學發光系統分析結果。

1.5.4 海馬組織中突觸超微結構

取每組剩余4 只-80 ℃保存的大鼠海馬組織50 mg,依次進行固定、磷酸鹽緩沖、2%四氧化鋨孵育、再固定、脫水、包埋、60 ℃聚合、切片、2.5%乙酸鈾酰和1%檸檬酸鉛染色、沉淀、透射電鏡下觀察。

1.6 統計學方法

采用SPSS22.0 統計軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差表示,多組間比較采用單因素方差比較,兩兩比較采用邦弗倫尼校驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 4 組大鼠學習記憶能力比較

干預后第10 天進行定位航行實驗,記錄4 組大鼠在90 s 內找到平臺的時間作為逃避潛伏期;干預后第14 天進行空間探索試驗,記錄4 組大鼠90 s 內穿過平臺所在位置的次數。與空白組比較,模型組逃避潛伏時間明顯增加(P＜0.05),穿越平臺次數明顯減少(P＜0.05);與模型組比較,常規針刺組與rTAS 組逃避潛伏時間明顯減少(P＜0.05),穿越平臺次數明顯增加(P＜0.05);與常規針刺組比較,rTAS 組逃避潛伏時間與穿越平臺次數改變不明顯(P＞0.05)。詳見表1。

表1 4 組大鼠學習記憶能力比較(±s)

表1 4 組大鼠學習記憶能力比較(±s)

注:與空白組比較1)P＜0.05;與模型組比較2)P＜0.05。

組別 n 逃避潛伏時間/s 穿越平臺次數/次空白組 14 18.48±5.82 8.74±2.12模型組 14 50.49±16.091) 4.53±0.991)常規針刺組 14 20.09±7.382) 7.41±2.072)rTAS 組 14 19.23±6.682) 7.92±2.092)

2.2 4 組大鼠探索行為和自主活動能力比較

干預后第14 天進行曠場實驗,記錄大鼠3 min 內穿越格子數(水平運動)和后肢站立數(垂直運動)。與空白組比較,模型組穿越格子數與后肢站立數明顯減少,差異有統計學意義(P＜0.05);與模型組比較,常規針刺組與rTAS 組穿越格子數與后肢站立數明顯增加,差異有統計學意義(P＜0.05);與常規針刺組比較,rTAS 組穿越格子數與后肢站立數明顯增加,差異有統計學意義(P＜0.05)。詳見表2。

表2 4 組大鼠探索行為和自主活動能力比較(±s)單位:次

表2 4 組大鼠探索行為和自主活動能力比較(±s)單位:次

注:與空白組比較1)P＜0.05;與模型組比較2)P＜0.05;與常規針刺組比較3)P＜0.05。

組別 n 穿越格子數 后肢站立數空白組 14 89.65±7.65 17.44±8.52模型組 14 41.49±12.141) 7.53±3.911)常規針刺組 14 80.65±12.352) 10.95±5.072)rTAS 組 14 90.26±10.382)3) 16.92±9.552)3)

2.3 4 組大鼠海馬CA1 區SYP 和MAP-2 表達水平比較

與空白組比較,模型組海馬CA1 區SYP 和MAP-2表達水平顯著降低,差異有統計學意義(P＜0.05);與模型組比較,常規針刺組與rTAS 組SYP 和MAP-2 表達水平顯著增高,差異有統計學意義(P＜0.05);與常規針刺組比較,rTAS 組SYP 和MAP-2 表達水平顯著增高,差異有統計學意義(P＜0.05)。詳見表3,圖1。

圖1 4 組大鼠海馬CA1 區SYP 和MAP-2 蛋白表達水平比較

表3 4 組大鼠海馬CA1 區SYP 和MAP-2 蛋白表達水平比較(±s)

表3 4 組大鼠海馬CA1 區SYP 和MAP-2 蛋白表達水平比較(±s)

注:與空白組比較1)P＜0.05;與模型組比較2)P＜0.05;與常規針刺組比較3)P＜0.05。

組別 n SYP MAP-2空白組 6 1.48±0.24 1.50±0.30模型組 6 0.95±0.141) 0.93±0.191)常規針刺組 6 1.35±0.212) 1.21±0.112)rTAS 組 6 1.73±0.632)3) 1.63±0.632)3)

2.4 4 組大鼠海馬CA1 區突觸超微結構比較

空白組內可見完整的突觸結構,突觸前可見大量突觸小泡,突觸周圍可見大量電子致密物質,基質均勻、周邊細胞器豐富,可見線粒體、高爾基體分布排列均勻;模型組突觸結構欠清晰,突觸間隙模糊不清,突觸小泡較少,突觸前致密物質減少,胞漿內細胞器稀疏,線粒體變形腫大明顯;常規針刺組突觸結構大體完整,突觸前膜欠清晰,致密物質較厚,較空白組質核素略增多,個別線粒體有輕微腫脹;rTAS 組突觸結構較完整,突觸間隙、突觸前后膜分界清晰,突觸前膜內囊泡較多,突觸后膜均勻增厚,周邊線粒體豐富、結構完整。詳見圖2。

圖2 4 組大鼠海馬CA1 區突觸超微結構比較

3 討論

血管性癡呆(VaD)屬于中醫學“呆病”“癡呆”的范疇。古有“中風后善忘”“無記性者,腦髓漸空”等對該病的描述,認為癡呆病位在腦,髓減腦消、神機失用[15]為其病機。國醫大師孫申田教授根據其病機特點提出“神安病減”理論[16],認為治療癡呆以調神為根本?！吧瘛边@個概念在中醫學理論中占有重要的地位,它與人之起源、生死密切相關,“失神者死,得神者生也”。孫申田教授遵古訓“凡刺之法,必先本于神”,選擇巔頂之百會醒神益智[17],配以神庭醒腦開竅。同時,孫申田教授注重針刺手法,發現捻轉的時間和速度要達到一個定量的標準,針刺療效顯著[18],在經顱重復針刺運動誘發電位的研究[19]基礎上,開創了經顱重復針刺刺激療法[20],在捻針速度和持續時間給出定量標準[6],即選擇頭穴后,斜刺至帽狀腱膜下1.5～2.0寸深,施以捻轉手法,且捻轉頻率保持200 轉/min,每穴持續捻轉3～5 min[16]。該方法較之常規針刺存在“火候”差異[21],當針刺激頻率、時間達到一定程度的時候,產生的刺激信號是可以穿透高阻抗顱骨,對腦組織產生實質性影響[22]。運用經顱重復針刺額區(情感區)可以治療認知障礙[20]。

本研究采用大腦中動脈線栓缺血再灌注造模方法建立大鼠VaD 模型,造模后大鼠海馬神經組織受損、凋亡,降低神經代謝與蛋白合成能力,導致神經元突觸變性和丟失,突觸可塑性下降,相關蛋白SYP、MAP-2 表達改變[23]。SYP 為突觸前囊泡蛋白,與突觸生長、發育、成熟密切相關[24];MAP-2 分布于突觸后致密區,調控突觸形態與數量,與突觸可塑性密切相關[25]。由于SYP、MAP-2 表達改變導致突觸效能改變[26],中樞膽堿能神經元結構被破壞[27],神經遞質合成受損,造成個體交流缺陷和認識障礙與感覺、焦慮等神經精神癥狀及社會活動缺陷等[28]。而神經元結構受損又進一步影響突觸功能和結構,導致突觸變性和丟失[29]。因此突觸相關蛋白SYP、MAP-2 的表達是突觸數量及功能狀態的標志,能夠從微觀層面反映突觸的病理生理變化[30]。

本研究中發現,模型組大鼠電鏡下觀察,突觸結構欠清晰,突觸間隙模糊不清,突觸小泡較少,突觸前致密物質減少,其學習記憶能力與其余3 組有明顯差異。rTAS 組大鼠海馬CA1 區突觸素SYP、微管蛋白MAP-2 蛋白表達水平較模型組和常規針刺組有顯著提高,既然觸相關蛋白SYP、MAP-2 的表達是突觸數量及功能狀態的標志,那么rTAS 組大鼠海馬CA1 區突觸素SYP、微管蛋白MAP-2 蛋白表達的提升有助于提高突觸可塑性。由于記憶被認為是由突觸強度的改變來編碼的,突觸增強作用被普遍認為是構成學習與記憶基礎的主要分子機制之一。本研究發現rTAS 組大鼠的學習記憶能力明顯被改善,且探索行為和自主活動能力優于常規針刺組,其電鏡下突觸結構較完整,突觸間隙、突觸前后膜分界清晰,突觸前膜內囊泡較多,突觸后膜均勻增厚,較接近空白組。說明rTAS 較常規針刺可能通過調控SYP、MAP-2 表達,更有效促進突觸再生,改善突觸可塑性,修復受損神經元,改善VaD 模型大鼠的探索行為能力、自由活動能力以及學習記憶能力,從而改善其認知功能。

經顱重復針刺刺激是集國醫大師孫申田教授數十年臨床經驗及科學實驗總結探索出來新的頭穴針刺手法,是對頭針治療的重新認識,闡述了頭針的作用機制。其體現中醫大家傳承經典,指導實踐、用于臨床,臨床啟發理論創新,通過機理研究,探索新的診療模式,再用于臨床的學術思想。目前大量研究[31-33]表明經顱重復磁刺激和電刺激產生磁信號或電信號,穿過顱骨作用于大腦皮層,對大腦皮層及下游神經系統產生確切的調節作用,這點與經顱重復針刺刺激既相似又不同。而經顱重復針刺刺激產生的不是簡單磁場或電流,其作用是一個包含疼感、溫感、組織間摩擦、牽扯的復合刺激,涵蓋理性因素、感情因素、生理因素的多因素交互[34-36]。通過本研究發現經顱重復針刺刺激較常規針刺手法可以更有效影響神經突觸,通過改善突觸可塑性改善認知功能,然而顱內外神經突觸的聯結機制有待于進一步的研究與探索。