能量負平衡影響奶牛卵泡發育的機制

曹建華,楊柏高,張培培,馮肖藝,張 航,余 洲,牛一凡,郝海生,杜衛華, 朱化彬,楊 凌,趙學明*

(1.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所,北京 100193;2.河北工程大學生命科學與食品工程學院,邯鄲 056038)

奶牛的產奶量日益增加,然而對于生產性能的過度追求導致了其繁殖力逐年降低,在過去幾十年里,全球范圍內的奶牛生育率都在下降[1]。據報道,近些年奶牛發情率從80%下降到50%,發情持續時間也從15 h減少到5 h,奶牛單次人工授精的妊娠率每年下降約0.45%～1%[2-3],首次受精懷孕率更是從70%下降到40%[4]。在日本北海道的荷斯坦奶牛,2012和2018年初產母牛的平均受孕率分別為55.2%和39.2%[5]。奶牛能量負平衡(negative energy balance,NEB)導致卵泡發育異常而引起的繁殖力下降,給全球農業經濟造成重大損失,幾乎所有高產奶牛的國家都受到了影響,成為世界性難題。

NEB干擾奶牛正常的卵巢活動,對產后奶牛的代謝和卵泡正常發育產生不利影響[6],進而影響到奶牛的健康和正常發情周期,降低產奶量和牛奶品質。解決NEB問題勢在必行,近些年,組學技術的應用為解決奶牛NEB提供新方法,本文就近年來相關研究進展進行綜述及展望,以期為揭示NEB影響奶牛卵泡發育的機制提供參考。

1 奶牛能量負平衡的概述

NEB是奶牛在圍產期[7](臨產前3周至產后3周)經常發生的一種導致機體代謝紊亂的疾病,圍產期階段奶牛體內胎兒發育需要更多營養,同時奶牛開始分泌初乳,干物質采食量(dry matter intake, DMI)需求增加4～6倍[8],然而此階段奶牛應激嚴重,采食量下降,能量需求超過了DMI的能量供應[9]。當采食量無法滿足正常生理活動和產奶的能量需求時,奶牛可能出現NEB狀態[10]。

NEB通常會導致奶牛出現肝功能紊亂、圍產期疾病和繁殖性能降低等情況[11-12]。奶牛的脂質代謝在圍產期會發生顯著變化[13],為了滿足能量需求,奶牛體內會進行肝糖異生,脂肪組織和蛋白質被動員起來,大量非酯化脂肪酸(non esterified fatty acid,NEFA)被運輸到肝,在肝細胞中氧化或酯化為甘油三酯(TG)[13]。過多的TG再酯化使肝中出現脂肪堆積現象,形成脂肪肝[14],嚴重的脂肪肝會影響奶牛生殖能力。同時,血漿中過多的NEFA無法完全氧化,產生大量酮體如β-羥丁酸(β-hydroxybutyric acid,BHBA),可能會使奶牛患酮病[15]。NEB使高產奶牛發生代謝紊亂[6],持續存在會導致奶牛體脂減少,體況評分(body condition score,BCS)降低,影響奶牛生產性能和生育能力,NEB的持續時間及其程度因奶牛的遺傳性狀、產奶量和采食量的不同而產生差異[16]。

2 能量負平衡對奶牛繁殖性能的影響

NEB期間,奶牛的免疫力下降,繁殖性能也會被削弱,例如,發情天數、發情次數、發情周期、發情率、受胎率等均會下降。NEB通過多方面因素影響到奶牛的繁殖性能,主要包括激素代謝、能量代謝、體況等。奶牛繁殖過程中,激素代謝起關鍵的調節作用,奶牛NEB階段的機體代謝、激素分泌會發生異常。據Radcliff等[17]報道,血清中由膽固醇合成的性類固醇激素(如雌激素和孕酮)水平在圍產期期間發生了很大變化。NEB過程中營養不充足,也影響到了與生殖有關的激素合成與分泌,如卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone, FSH)[18],激素代謝紊亂會對奶牛發情周期和繁殖力造成影響。

奶牛NEB狀態下需要動員機體脂肪組織來產生能量,這時奶牛血清中的BHBA、NEFA濃度升高,血漿中葡萄糖濃度降低[19-20],高濃度NEFA和低濃度葡萄糖對奶牛繁殖性能造成不良影響。在生產中通常以奶牛產后第1周血清中BHBA含量≥1.2 mmol·L-1和第2周BHBA含量≥5.1 mmol·L-1為閾值來預測臨床酮癥風險[21],據報道,在奶牛產后第2周,血清BHBA濃度超過亞臨床酮癥(SCK)閾值的奶牛在首次人工授精后懷孕率降低了50%[22]。SCK同樣增加了人工授精次數,SCK奶牛每次懷孕的平均授精次數為2.8次,非SCK奶牛為2.0次[23],以上表明NEB階段時能量代謝異常,同樣降低了奶牛的繁殖性能。

NEB影響奶牛BCS,BCS通常作為奶牛管理中的有效指標,其過度增加或減少是影響繁殖性能的一個因素[24],評估BCS是了解營養狀況與繁殖性能之間關系的簡便方法。奶牛NEB狀態下體內脂肪損失較大,它們通常在產犢后的最初幾周內減少掉60%或更多的體脂[25],BCS明顯降低。Carvalho等[26]證實,產后早期BCS損失最大的奶牛在人工授精后的第1周表現出更多的胚胎發育障礙,與健康群體相比,BCS過度損失的奶牛繁殖性能和存活率降低[24]。另外,Stevenson等[27]報告稱,產犢后BCS損失較大的奶牛患牛奶熱、酮癥、脂肪肝、子宮炎和乳腺炎的風險增加,這些疾病會導致奶牛生育能力下降、產奶量下降、屠宰風險升高[10,28]。BCS較差還與產后發情延遲、首次產犢和受孕間隔較長以及首次人工授精受孕間隔縮短有關,是造成奶牛繁殖性能下降的重要原因[24]。

3 能量負平衡影響奶牛卵泡發育的機制

3.1 能量負平衡通過影響激素合成抑制卵巢中的卵泡發育

動物合成和分泌激素需要大量營養物質,尤其對蛋白質和能量需求較高。奶牛在NEB狀態時,缺乏營養,導致生殖激素的合成能力下降,血漿和卵泡液中的激素水平低下,包括促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone,GnRH)、FSH、促黃體生成素(luteinizing hormone,LH)、瘦素(leptin)等均會受到影響[29]。這些激素通常在下丘腦、垂體和卵巢水平發揮作用,涉及到許多代謝調節與正常卵巢活動相關的復雜內分泌機制的相互作用[30],NEB對卵巢功能的影響主要是通過降低LH脈沖、降低體內IGF-1、機體發生胰島素抵抗等所實現的[31]。一些研究表明,奶牛產后NEB會延遲卵巢功能的恢復,延長第一個卵泡波,并降低排卵率[32],干擾了奶牛正常排卵,最終導致奶牛繁殖性能下降。

圖1 能量負平衡影響奶牛卵泡發育的機制[30]Fig.1 Mechanism of negative energy balance affecting follicle development in dairy cows[30]

3.1.1 GnRH GnRH是一種調節哺乳動物生殖功能關鍵作用的激素,是由位于弓狀核和下丘腦視前區的特定下丘腦神經元合成的十肽[33]。生殖內分泌系統由下丘腦-垂體-性腺(HPG)軸組成,精確調節哺乳動物的生殖過程[34],下丘腦分泌的促GnRH調節腺垂體中促性腺激素的合成和分泌,從而調節性腺功能。GnRH促進FSH的合成和分泌,調節動物生長繁殖,在卵泡發育中起重要作用[35],目前,GnRH被廣泛用于調節動物繁殖[36]。產后恢復排卵的關鍵驅動因素是LH脈沖頻率的增加,LH脈沖頻率又受到GnRH高頻脈沖的控制[37],奶牛NEB時 GnRH水平低下,影響了FSH、LH的脈沖頻率,卵泡的選擇及發育受到干擾。

3.1.2 FSH FSH是由垂體前葉產生的一種由α和β亞基組成的二聚體糖蛋白,是一種促性腺激素,在配子發生和成熟的調節中起著至關重要的作用[38]。FSH在卵泡生長和顆粒細胞功能中起關鍵作用[39],卵泡發育過程中需要依靠 FSH、LH等激素的調節,FSH、LH協同促進發育成熟的卵泡分泌雌激素和排卵[40]。FSH的每一次增加都會導致卵泡波的出現,在卵泡發育后期,其生長明顯依賴于垂體促性腺激素FSH和LH,這些激素通過下丘腦-垂體的負抑制反饋回路保障了控制卵泡招募、選擇和優勢的主要機制[41]。

奶牛排卵是正常發情的保障,無排卵乏情是由于優勢卵泡(dominant follicle, DF)無法正常排卵導致的乏情[42]。處于NEB狀態的奶牛,FSH合成能力下降[17],導致對DF的選擇出現差錯:顆粒細胞在FSH刺激下將雄激素芳香化生成雌二醇[43-44],此時由于FSH水平較低,奶牛DF中的顆粒細胞無法受到足夠的刺激產生一定濃度的雌二醇來誘導排卵,導致DF閉鎖[45],奶牛不發情。

3.1.3 LH LH是由垂體前葉合成和分泌的一種促性腺激素,負責誘導排卵、準備受精卵母細胞植入子宮,以及通過刺激膜細胞和黃體化顆粒細胞來產生卵巢黃體酮[37]。LH在卵泡發育過程中發揮重要作用,它刺激關鍵類固醇激素雌激素的合成和分泌,從而促進卵巢中卵泡的生長和發育[46]。產后恢復排卵的關鍵因素是LH脈沖頻率的增加,LH脈沖頻率是影響所選DF最終命運的主要決定因素[47],在招募階段之后,由于雌二醇和抑制素的負反饋,FSH從被招募的卵泡下降到卵泡進一步選擇的閾值以下,此時DF可以使用LH來支持其繼續生長[48]。當奶牛發生NEB時,體況不佳加上營養水平低,生殖激素LH分泌水平降低,生長發育到更大尺寸的卵泡數量就會減少[49],因此排卵率下降,發情率降低。

3.1.4 瘦素 瘦素是一種主要由脂肪細胞產生和分泌的激素[50],其他非脂肪組織也可以產生瘦素,例如下丘腦、腺垂體和乳腺對生殖功能至關重要的組織[51-52]。瘦素是向中樞神經系統發送動物營養狀況信號的主要因素,因此參與能量代謝和生殖功能相關的調節[53]。瘦素控制著女性生殖系統的正常生理機能,它通過一種將能量穩態與生殖聯系起來的復雜機制與下丘腦-垂體-性腺(HPG)軸相互作用,并調節瘦素受體(LEP-R)的豐度[54],這些受體的激活可能導致各種功能和途徑的調節,例如:GnRH、FSH和 LH濃度的調節[55-56]。在母牛發情周期的卵泡期,血清瘦素濃度與DF的卵泡液中孕酮濃度呈正相關[57]。有證據表明,卵母細胞成熟過程中使用瘦素處理可改善牛的胚胎發育[58],瘦素還可以用作抗凋亡和抗氧化促進劑,以支持體外胚胎發育,特別是在胚胎冷凍保存出現的氧化應激狀態下[59]。奶牛分娩前后出現NEB影響血漿中瘦素濃度,妊娠晚期血漿中瘦素水平很高,并在分娩時下降到最低點[60],正常的卵巢周期受到干擾,導致奶牛生育能力下降。

3.2 INS/IGF系統對卵泡的影響

胰島素(insulin,INS)被認為是類固醇生成、卵泡生長、卵母細胞成熟和之后胚胎發育的關鍵媒介,因為它與促性腺激素分泌相關[45]。胰島素樣生長因子-1(insulin -like growth factor-1, IGF-1)是一種結構上與INS相關的70個氨基酸肽,在體外胚胎發育過程中影響細胞生長和分化并具有抗凋亡作用[61]。在許多物種中,IGF-1的受體和IGF結合蛋白在準備子宮內膜植入胚胎以及胚胎生長發育方面起著重要作用[62]。INS可刺激顆粒細胞的增殖,血液中INS的平均濃度降低會導致奶牛發情周期不規律[63]。

IGF-1 是NBE奶牛恢復周期性能力的良好預測指標。IGF-1通過增強促性腺激素在卵巢中的作用,也刺激卵泡生長和雌二醇合成,血漿中IGF-1濃度降低和營養不足會導致卵泡生長速度降低甚至不排卵[64]。據報道,IGF-1敲除的小鼠卵泡無法到達竇期,因排卵不足而導致不孕[65]。INS、IGF-1與LH的聯合作用能促進優勢卵泡的形成[66],NEB嚴重的奶牛血漿中INS、IGF-1和葡萄糖的濃度較低,從而降低LH脈沖頻率,減少了卵泡合成雌二醇的水平[67]。NEB奶牛體內葡萄糖濃度處于較低水平,導致胰高血糖素濃度上升,胰島素濃度下降[68]。有研究比較了NEB奶牛組血漿與正常奶牛組血漿后發現,INS、IGF-1濃度在NEB奶牛組更低,NEB奶牛組卵泡的生長速度顯著低于正常奶牛組[69],奶牛發情率處于較低水平。

3.3 能量負平衡對卵泡能量代謝的影響

卵母細胞是哺乳動物體內最大的細胞,相對其他體細胞,其發育消耗更多的能量。另一方面,胚胎發育初始所需的能量和底物由卵母細胞提供,因此正常的能量代謝在卵母細胞生長和胚胎發育方面顯得尤為重要。葡萄糖代謝和脂肪酸氧化是哺乳動物細胞攝取能量的兩種常規方式,在細胞質中,葡萄糖和脂肪酸先轉化為乙酰輔酶A,最后被氧化為三磷酸腺苷提供能量,雖然兩種物質提供的底物最終的氧化方式不同,但是氧化過程都在細胞的線粒體中進行,而脂肪酸氧化可以產生更多的能量[70]。

3.3.1 葡萄糖 葡萄糖是所有哺乳動物細胞能量需求的重要代謝底物,它是一種親水性分子,不能透過質膜,其攝取是由許多葡萄糖轉運蛋白介導的[71]。葡萄糖是牛卵母細胞成熟所必需的能量底物,在培養液中添加葡萄糖可以促進卵母細胞的糖酵解,在體外成熟的卵母細胞中,較高的糖酵解率反映了較高的發育能力[72]。卵丘和卵母細胞復合體通過糖酵解和磷酸戊糖途徑代謝葡萄糖,葡萄糖的代謝物與調節卵母細胞減數分裂有關[72],這表明,卵母細胞在成熟期獲得發育能力需要足夠的葡萄糖,維持最佳的葡萄糖生理濃度直到囊胚期,對于卵母細胞成熟和隨后的發育至關重要[73]。NEB與血液中低濃度的葡萄糖密切相關,由低葡萄糖水平而引起促性腺激素分泌的變化會降低FSH和LH濃度,從而導致LH峰缺失進而無排卵[74]。奶牛NEB期間血漿葡萄糖濃度很低,通常不高于3.0 mmol·L-1[75],不利于卵母細胞發育,進而影響到奶牛排卵,奶牛繁殖率下降。

3.3.2 脂肪酸 Bertevello等[76]利用脂質組學技術發現,脂肪酸在卵泡環境中廣泛存在,在卵母細胞、卵丘細胞、其他卵泡細胞以及卵泡液中均可觀察到脂肪酸。在卵母細胞中,甘油三酯主要以脂滴的形式存在,脂滴是一種重要的能量儲存形式,盡管各個物種在不同發育階段的脂滴含量差異很大,但哺乳動物卵母細胞通常富含脂質,以確保減數分裂有足夠的能量供應[77]。NEFA也存在于細胞質中,可以直接從脂滴轉運到線粒體,通過β-氧化,快速簡便地獲取能量。用于產生能量的脂肪酸通過脂肪酸轉運蛋白從循環系統或通過脂質雙層直接擴散進入細胞,卵泡液中的NEFA也可能通過類似的機制進入卵丘細胞和卵母細胞[78]。奶牛NEB狀態下,體內脂肪動員,血漿和卵泡液中的NEFA處于較高水平,高濃度的飽和NEFA會影響顆粒細胞的增殖,降低顆粒細胞活力,對濾泡細胞、卵母細胞減數分裂和胚胎發育也產生不利影響[79-80]。長期暴露在高濃度NEFA帶來的有害影響統稱為脂毒性,脂毒性損害細胞結構和功能,導致奶牛器官和機體損傷,奶牛的生殖性能受到極大影響[81]。有研究表明,給奶牛口服丙二醇可有效增加其血漿中的葡萄糖濃度,降低BHBA和NEFA水平,緩解奶牛NEB,預防酮癥[12]。此外,由于血漿中葡萄糖水平升高,奶牛的繁殖性能和免疫功能也會適當提高。

4 展 望

奶牛NEB通過影響奶牛的下丘腦-垂體-卵巢軸的激素分泌以及卵泡的能量代謝而影響卵泡發育,奶牛的發情周期受到干擾,影響到正常生產,給畜牧業造成了極大損失。改善奶牛NEB問題,有助于奶制品行業的發展,更有利于我國畜牧業振興。近年來,得益于組學技術的快速發展,人們對于奶牛NEB的認識越來越清晰,為解決奶牛NEB提供了寶貴的理論依據。然而現有的研究無法完全解決奶牛NEB問題,在未來,隨著奶牛生產管理經驗的逐漸豐富、組學分析技術的進一步發展,奶牛NEB的分子機制將逐步揭示,為提高奶牛繁殖力、生產效率提供重要實踐積累和理論依據,奶牛NEB問題有望得到妥善解決。