豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白納米抗體的篩選及其對病毒復制的抑制效應

宋雯妍,張瀚文,吳澳迪,張麗燕,劉 照,葉桐桐,陳創夫,盛金良

(石河子大學動物科學院,石河子 832000)

豬繁殖與呼吸綜合征又稱豬藍耳病,是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)感染而導致妊娠母豬在懷孕晚期出現流產,育肥豬食欲不振,體重減輕,以及各日齡豬呼吸系統紊亂的疾病[1-4]。PRRSV是單股正鏈RNA病毒,屬于動脈炎病毒科動脈炎病毒屬,其結構為二十面體,具立體對稱性,病毒衣殼內含有不分節段的基因組 RNA,全長大小約為 15 kb,編碼至少8 種結構蛋白與14 種非結構蛋白[5-6]。GP5 蛋白又稱E蛋白,是由病毒 ORF5 開放閱讀框編碼的主要糖基化結構的跨膜蛋白,其特點是具有較好的免疫原性,并能夠誘導機體產生中和抗體,且該蛋白在體內及體外試驗中,均能誘導細胞發生凋亡[7-8]。此外GP5蛋白與 M 蛋白可形成 GP5/M 異源二聚體,于病毒的裝配起到重要作用,并介導PRRSV對靶細胞的吸附過程[9-10]。鑒于GP5蛋白于病毒的生命周期中發揮著重要生物學功能,因此該蛋白是研發抗豬藍耳病藥物的理想靶標蛋白。

納米抗體(Nb)是研究人員基于駱駝等駝科動物以及鯊魚等軟骨魚體內的重鏈抗體可變區片段上所研發的一種單域抗體,其僅由重鏈可變區構成,長4 nm,直徑2.5 nm,呈橢圓形,其大小僅是傳統抗體的1/10,是目前所知最小且具備活性的抗原結合蛋白[11-12]。納米抗體因具備體積小、親和力高、穩定性與組織穿透性強等優勢,近年來其于病毒感染治療領域的相關研究不斷深入。目前已有針對SARS-冠狀病毒-2、艾滋病病毒、甲型流感病毒等多種病毒的納米抗體報道,研究結果顯示,這些納米抗體對病毒復制的抑制效應較好,可作為治療病毒感染的理想工具。

本研究基于研發PRRSV GP5蛋白納米抗體,并探究其在細胞內對病毒復制的抑制效力,目前針對此蛋白納米抗體的相關研究尚未見報道。因此,將GP5蛋白經原核表達并純化后免疫羊駝,利用噬菌體展示技術最終篩選出PRRSV-GP5蛋白的高特異性納米抗體,并將其轉染入細胞內以驗證該納米抗體對PRRSV復制與轉錄產生的影響,為抗PRRSV新型藥物的研發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種、表達載體、試驗動物 大腸桿菌 DH5α、BL21(DE3)、TG1及pET-32a載體、pCANTAB-5E、pcDNA3.1(-)載體均由石河子大學獸醫病理學實驗室保存;健康成年母羊駝1只,飼養于石河子大學動物科技學院。

1.1.2 細胞與毒株 Marc-145細胞與PRRSV毒株均由石河子大學動物科技學院人獸共患病實驗室保存。

1.1.3 主要試劑 反轉錄試劑盒、PCR反應試劑、 DNA Marker、 Protein Marker、 Ni-NTA Resin、 Anti-His Mouse Monoclonal Antibody、 Goat Anti-Mouse IgG (H+L), HRP Conjugate均購自北京全式金生物技術有限公司;T-Vector pMD19(Simple)、 DNA Ligation Kit Ver.2.1、 限制性內切酶BamHⅠ、HindⅢ、PstⅠ、NotⅠ均購自于寶日醫生物技術(北京)有限公司;Anti-M13 Antibody (HRP)購自北京義翹神州科技股份有限公司;E-tag Antibody(HRP)購自金斯瑞生物科技股份有限公司;無內毒素質粒大提試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司;Lipofectamine3000購自美國英杰生命技術有限公司;Goat Anti-Llama IgG H&L(HRP)為進口試劑。

1.2 方法

1.2.1 PRRSVORF5基因重組質粒的構建 根據GenBank中PRRSV XJzx1-2015分離株的GP5序列(AQV08435.1)進行生物信息學分析,去除該基因中的信號肽及跨膜區序列,并針對優化后的截短序列設計引物(表1),以實驗室保存的PRRSV陽性病料為模板,使用PCR技術擴增ORF5基因,并通過限制性內切酶BamHⅠ和HindⅢ將ORF5基因克隆至原核表達載體pET-32a中,得到重組質粒pET-32a-GP5,后轉化至DH5α感受態細胞。

表1 構建重組質粒pET-32a-GP5的引物序列Table 1 Primer sequence for constructing recombinant plasmid pET-32a-GP5

1.2.2 PRRSV GP5蛋白的誘導表達及純化 將經雙酶切及測序正確的重組質粒,轉化入大腸桿菌DE3(BL21)感受態細胞中,挑單克隆入含有氨芐抗性的LB培養基中擴大培養,37 ℃,200 r·min-1培養至菌液OD600 nm值達到0.6時停止,取1 mL菌液作為誘導前對照,后于剩余菌液中加入1 mmol·L-1的IPTG進行誘導,37 ℃,200 r·min-1培養6 h,同時設置空載體對照,SDS-PAGE鑒定重組蛋白的表達。取誘導后菌液進行超聲破碎(功率50 w,超聲5 s,間隔6 s,90 次·周期-1),收集上清與沉淀進行可溶性分析并使用鎳柱親和層析法對重組蛋白進行純化,后Western blot鑒定。

1.2.3 動物免疫 首次免疫前,對羊駝進行采血以作陰性對照,后將純化好的1 mL GP5重組蛋白與等量弗氏完全佐劑混合乳化,于羊駝背部體表進行多點皮下注射。此后每隔14 d使用0.5 mL重組蛋白與等量弗氏不完全佐劑乳化對羊駝進行加強免疫,直至三免結束,分別于免疫第0、14、28、42 天時采血,使用間接ELISA方法檢測羊駝體內抗體效價,隨后采集羊駝全血,分離淋巴細胞以備后續試驗。

1.2.4 VHH基因的擴增 提取淋巴細胞RNA,反轉錄后參考文獻[13]中的引物序列(表2)進行巢式PCR擴增出VHH片段。首先使用引物CALL001、CALL002進行第一輪PCR擴增,反應條件:98 ℃預變性30 s;98 ℃變性10 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸25 s,共28 個循環;最后72 ℃延伸 5 min,PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,并對位于700 bp的條帶進行膠回收以用于第二輪PCR的模板,使用引物VHH-F及VHH-R進行VHH片段的擴增。反應條件:98 ℃預變性 30 s;98 ℃變性10 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸15 s,共18個循環;最后72 ℃延伸 5 min,PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,對位于400 bp的目標條帶進行膠回收并于-20 ℃保存。

表2 擴增VHH片段所需引物Table 2 Primers required for VHH fragment amplification

1.2.5 VHH噬菌體展示文庫的構建及鑒定 將VHH片段與pCANTAB 5E載體分別用限制性內切酶PstⅠ和NotⅠ于37 ℃雙酶切1 h后使用T4連接酶于16 ℃連接16 h。取10 μL連接產物轉化入100 μL大腸桿菌TG1感受態細胞中,次日用細胞刮刀收集培養皿中的所有菌落并充分混勻,即可得到VHH噬菌體展示文庫。使用2×YT液體培養基進行10倍梯度稀釋,加入等體積處于對數生長期的TG1溶液,混勻,37 ℃靜置感染30 min,涂布于LB/AMP固體培養基中進行過夜培養,統計轉化子的數量以計算庫容。隨機挑取培養皿中的陽性克隆進行菌液PCR鑒定并計算文庫插入率。

1.2.6 VHH噬菌體展示文庫的救援 取1 mL上一步制備的VHH噬菌體展示文庫溶于100 mL 2×YT/AMP液體培養基中,37 ℃,200 r·min-1培養至菌液OD600 nm值達到0.6時停止,加入200 μL M13K07輔助噬菌體(6.14×1012PFU·mL-1)進行救援,混勻,37 ℃靜置30 min后于37 ℃,200 r·min-1,振蕩培養40 min。離心后棄上清,菌體沉淀用500 mL 2×YT/AMP 液體培養基重懸,37 ℃,200 r·min-1,振蕩培養14 h。14 000 r·min-1,離心后收集上清,加入1/5體積提前預冷的PEG/NaCl溶液,混勻后于冰上靜置6 h。離心后收集沉淀,用1 mL的無菌PBS(1×)重懸沉淀后于4 ℃搖床過夜孵育,完全溶解噬菌體顆粒。

1.2.7 PRRSV-GP5特異性納米抗體的淘選 取純化后GP5蛋白用碳酸鹽包被液稀釋至10 μg·mL-1,每孔100 μL加入至96孔酶標板中,同時設置PBS(1×)作為陰性對照,4 ℃包被過夜。棄去包被液,5%脫脂乳于37 ℃封閉2 h,PBST洗板。加入稀釋至6.1×1010的重組噬菌體(“1.2.6”方法),100 μL·孔-1,37 ℃孵育2 h,洗板后加入新鮮配制的0.1 mol·L-1三乙胺溶液,100 μL·孔-1,37 ℃靜置10 min后吸出洗脫液,并迅速加入等體積的1 mol·L-1Tris-HCl(pH=7.4)進行中和,對洗脫液中的重組噬菌體滴度進行測定,并計算回收率。取4 mL 培養至對數生長期的TG1溶液,加入400 μL洗脫的重組噬菌體溶液,混勻后于37 ℃靜置30 min,加入16 mL的2×YT/AMP 液體培養基,37 ℃,200 r·min-1培養至菌液OD600 nm值達到0.6時停止,加入100 μL M13K07輔助噬菌體救援,按照“1.2.6”的方法對噬菌體粒子進行濃縮純化,重復上述操作三次,完成對重組噬菌體的三輪淘選。

1.2.8 重組納米抗體的誘導表達與粗提物獲取 取重組噬菌體第三輪淘選的洗脫液,測定滴度后從LB-AMP固體培養基中隨機挑取96個單克隆,過夜培養。次日各菌液取10 μL培養物轉接至1 mL TB培養基,37 ℃,200 r·min-1培養至菌液OD600 nm值達到0.6時加入終濃度為1 mmol·L-1的IPTG誘導12 h。離心后吸棄上清液,菌體反復凍融三次后使用無菌PBS(1×)重懸,離心后收集上清即獲得可溶性納米抗體粗提物。

1.2.9 重組納米抗體的間接ELISA檢測 將純化后的GP5蛋白稀釋至10 μg·mL-1,100 μL·孔-1加入至96孔酶標板中,共包被同時設置PBS(1×)作為陰性對照,4 ℃包被過夜。次日棄包被液,用5%脫脂乳于室溫封閉2 h,PBST洗板。將可溶性納米抗體粗提物用5%脫脂乳1∶1稀釋后,每孔加入100 μL,37 ℃孵育1 h。PBST洗板,分別加入Anti-M13抗體和Anti-E-tag抗體以作二抗,100 μL·孔-1,37 ℃孵育1 h后進行顯色,加入ELISA終止液終止反應后于酶標儀測取OD450 nm并分析數據。

1.2.10 PRRSV-GP5 特異性納米抗體序列分析 將與Anti-M13抗體和Anti-E-tag抗體反應均為陽性的單克隆擴大培養,進行菌液PCR鑒定后陽性者送去測序,用DNAMAN軟件比對測序結果,并根據納米抗體的高變區序列歸類。

1.2.11 PRRSV-GP5 特異性納米抗體對PRRSV增殖的影響 以所篩PRRSV-GP5特異性納米抗體所對應的菌液為模板,使用表3所示的引物進行PCR擴增,并通過限制性內切酶SacⅠ和Hind Ⅲ將擴增出的納米抗體基因克隆至真核表達載體pcDNA3.1(-)中,得到重組質粒pcDNA3.1(-)-Nb1與pcDNA3.1(-)-Nb2,后轉化至DH5α感受態細胞。次日,隨機挑取轉化成功的單克隆進行菌液PCR驗證及雙酶切鑒定,二者均正確者送去測序。

將含有構建成功質粒的菌液進行擴大培養并使用無內毒素質粒大提試劑盒進行質粒提取,后使用Lipofectamine3000將重組質粒轉染至Marc-145細胞中,經Western blot及熒光定量PCR(引物見表4)檢測Nb mRNA的相對表達量來鑒定重組質粒于細胞中的表達情況。

將pcDNA3.1(-)-Nb1、pcDNA3.1(-)-Nb2分別轉染至Marc-145細胞中,取1 MOI PRRSV 接種各組細胞,同時設置空細胞接毒組作為陰性對照,37 ℃,5% CO2培養箱中共孵育1 h(期間每30 min輕柔晃動細胞培養板),棄去毒液,1×PBS洗兩遍,于各組0 h細胞樣品中加入TRIZOL裂解后置于-80 ℃保存備用,剩余各組加入含3% FBS的DMEM培養基,繼續置于37 ℃,5% CO2培養箱中進行培養,后分別于24、36、48、60、72 h收集各組細胞樣本,進行RNA提取后反轉錄,并使用表4所示的引物檢測PRRSVORF7基因mRNA相對表達量的變化以判定各組納米抗體在不同時間段對病毒復制所產生的影響。

表3 構建重組質粒pcDNA3.1(-)-Nbs的引物序列Table 3 Primer sequence for constructing recombinant plasmid pcDNA3.1(-)-Nbs

表4 熒光定量PCR引物序列Table 4 Fluorescence quantitative PCR primer sequences

2 結 果

2.1 pET-32a-GP5重組質粒的構建

取實驗室保存的PRRSV陽性病料,該病料據文獻 [14]記載,內含毒株為野毒株,且通過對其進行遺傳變異分析可知,該毒株與香港PRRSV毒株的遺傳進化關系較為接近,推測其與經典毒株相比,毒性有所增強,另外,將該毒株的ORF5基因序列與19株PRRSV美洲型毒株進行序列比對,發現該基因針對不同毒株的廣譜性較好。因此,本試驗使用PCR技術對PRRSVORF5基因進行擴增,得到一條片段大小為216 bp的目的條帶(圖1A),與預期目的基因片段大小一致。回收目的條帶后與原核表達載體pET-32a分別通過限制性內切酶BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切后進行連接,構建出重組質粒pET-32a-GP5,隨后進行菌液PCR驗證(圖1B)與雙酶切鑒定(圖1C),并送去測序。結果表明,成功構建重組質粒pET-32a-GP5。

A. PRRSV ORF5基因的PCR擴增;B. 重組質粒pET-32a-GP5的PCR鑒定;C. 重組質粒pET-32a-GP5的雙酶切鑒定;M1. DL700 DNA相對分子質量標準;1. 陰性對照;2. ORF5基因PCR擴增產物;M2. DL700 DNA相對分子質量標準;3～8. 菌液PCR擴增產物;M3. DL5000 DNA相對分子質量標準;9～11. pET-32a-GP5重組質粒 A. PCR amplificaiton of PRRSV ORF5 gene; B. Identification of pET-32a-GP5 by PCR; C. Identification of pET-32a-GP5 by double enzyme digestion; M1. DNA marker DL700; 1. Negative control; 2. PCR amplification product of ORF5 gene; M2. DNA marker DL700; 3-8. PCR amplification products of bacterial fluid; M3. DNA marker DL5000; 9-11. Recombinant pET-32a-GP5圖1 pET-32a-GP5重組質粒的構建Fig.1 Construction of pET-32a-GP5 recombinant plasmid

2.2 PRRSV GP5蛋白的誘導表達及純化

對含有pET-32a-GP5的重組質粒的菌液于1 mmol·L-1的IPTG誘導表達6 h后,將空載體對照、誘導前對照以及誘導后的重組蛋白均進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,結果顯示空載體及誘導前對照無重組蛋白表達,誘導后重組蛋白于28 ku處有明顯的蛋白條帶產生(圖2A),與預期大小一致。經可溶性分析,重組蛋白于包涵體沉淀中表達(圖2B),使用鎳柱親和層析法過柱純化GP5重組蛋白,最終收集到純度較好的2.16 mg·mL-1的純化后蛋白(圖2C)。

2.3 羊駝免疫

采用間接ELISA法對GP5蛋白免疫羊駝血清抗體進行檢測,結果顯示三免14 d后,羊駝體內IgG抗體效價高達1∶819 200,對比陰性血清對照組,抗體水平顯著增加(圖3)。

2.4 VHH基因片段的擴增

提取羊駝全血淋巴細胞RNA,反轉錄后首先使用引物CALL001、CALL002進行第一輪PCR擴增,分別得到一條片段大小為900 bp的條帶與另一條大小為700 bp的目的條帶(圖4A),膠回收位于700 bp的條帶以用于第二輪PCR的模板,使用引物VHH-F及VHH-R對VHH片段進行擴增,最終位于400 bp處出現目的條帶(圖4B)。

2.5 VHH噬菌體展示文庫的構建及鑒定

將VHH片段克隆至pCANTAB 5E載體并轉化至大腸桿菌TG1感受態細胞中,得到庫容量為2.93×107CFU·mL-1的VHH噬菌體展示文庫,插入率為98%。

A.重組蛋白的SDS-PAGE鑒定;B. 重組蛋白的可溶性分析;C. 重組蛋白的Western blot鑒定;M1. 蛋白質相對分子質量標準;1. pET-32a空載體; 2. pET-32a-GP5誘導前;3. pET-32a-GP5誘導后;M2. 蛋白質相對分子質量標準;4. pET-32a空載體; 5. pET-32a-GP5誘導前; 6. pET-32a-GP5誘導后;7. 超聲后上清;8. 超聲后沉淀;M3. 蛋白質相對分子質量標準;9. pET-32a-GP5純化 A. SDS-PAGE identification of recombinant protein; B. Solubility analysis of recombinant protein; C. Western blot identification of recombinant protein; M1. Protein molecular weight standard;1. pET-32a empty plasmid control; 2. pET-32a-GP5 before induction; 3. pET-32a-GP5 after induction; M2. Protein molecular weight standard; 4. pET-32a empty plasmid control; 5. pET-32a-GP5 before induction; 6. pET-32a-GP5 after induction; 7. Supernatant after ultrasound; 8. Precipitation after ultrasound; M3. Protein molecular weight standard;9. Purification of pET-32a-GP5圖2 PRRSV GP5蛋白的誘導表達及純化Fig.2 Inducible expression and purification of PRRSV GP5 protein

圖3 羊駝血清中PRRSV GP5特異性抗體效價檢測Fig.3 Detection of PRRSV GP5 specific antibody titer in alpaca serum

2.6 PRRSV-GP5特異性納米抗體的淘選

將PRRSV-GP5蛋白作為包被抗原以篩出高親和力與特異性納米抗體。進行“吸附-洗脫-富集”共三輪淘選,通過測定每輪篩選過程中重組噬菌體的投入量與洗脫液里重組噬菌體的洗脫量,來計算回收率以評估PRRSV-GP5蛋白篩選過程中特異性噬菌體的富集情況。結果如表5所示,經三輪淘選后,重組噬菌體得到了有效富集,洗脫量與回收率均逐漸升高,其中,特異性噬菌體的洗脫量達2.48×108CFU·mL-1。

2.7 重組納米抗體的間接ELISA檢測

于重組噬菌體第三輪淘選滴度測定的固體培養基中隨機挑取96個單克隆,經擴大培養與誘導表達后,制得可溶性納米抗體粗提物,用于間接ELISA檢測納米抗體與PRRSV-GP5蛋白的反應原性。其中分別選取Anti-M13抗體和Anti-E-tag抗體作為不同的二抗進行試驗檢測,將OD值大于陰性對照三倍以上即判定為陽性,結果如圖5所示。

A. 巢式PCR第一輪擴增;B. 巢式PCR第二輪擴增;M1. DL1500 DNA相對分子質量標準;1、2. 陰性對照;3、4. 巢式PCR第一輪擴增產物;M2. DL700 DNA相對分子質量標準;5. 陰性對照;6、7,巢式PCR第二輪擴增產物 A. The first amplification round of nested PCR; B, The second amplification round of nested PCR; M1. DNA marker DL1500; 1, 2. Negative control; 3-4. The first round amplification products of nested PCR; M2. DNA marker DL700; 5. Negative control; 6-7. The second round amplification products of nested PCR圖4 VHH基因片段的擴增Fig.4 Amplification of VHH gene fragment

表5 GP5蛋白篩選過程中特異性噬菌體的富集情況Table 5 Enrichment of specific phages during GP5 protein screening

2.8 PRRSV-GP5 特異性納米抗體序列分析

將與Anti-M13抗體和Anti-E-tag抗體反應均為陽性的克隆擴大培養,進行菌液PCR,陽性者送去測序,測得序列經分析后共得到2條與駝源的VHH具有較高同源性并與GP5蛋白具有良好反應原性的序列,分別命名為Nb1、Nb2(圖6)。分析可知,兩株納米抗體的FR2區均存在典型的親水氨基酸。

2.9 重組質粒pcDNA3.1(-)-Nbs的構建

以所篩Nb1、Nb2所對應的菌液為模板,使用引物VHH-ZH(F)、VHH-ZH(R)對納米抗體基因進行PCR擴增,分別得到片段大小約為340 bp的目的條帶(圖7A),將擴增出的納米抗體基因克隆至真核表達載體pcDNA3.1(-)中,分別構建出重組質粒pcDNA3.1(-)-Nb1與pcDNA3.1(-)-Nb2,隨后對重組質粒進行菌液PCR驗證(圖7B)與雙酶切驗證(圖7C),并送去測序,結果顯示,重組質粒pcDNA3.1(-)-Nbs構建成功。

2.10 重組質粒轉染至Marc-145細胞

將構建好的重組質粒利用Lipofectamine3000瞬時轉染至Marc-145細胞中,36 h后,收集細胞,分別檢測細胞中Nb1與Nb2蛋白的表達情況。如圖8A所示,轉染后可于細胞中檢測到Nb1與Nb2蛋白的表達。使用熒光定量PCR檢測重組質粒轉染細胞前后Nb1與Nb2 mRNA表達量的變化,如圖8B與8C所示,兩株納米抗體的表達量于細胞轉染后均顯著增加,進一步驗證了重組質粒pcDNA3.1(-)-Nbs轉染成功。

2.11 細胞內表達的Nb1與Nb2對PRRSV復制的影響

A. Anti-E-tag抗體(OD450 nm值為0～1.8;1～96. 試驗組);B. Anti-M13抗體(OD450 nm值為0～0.35;1～96. 試驗組) A. Anti-E-tag antibody (OD450 nm value is 0-1.8; 1-96. Test group); B. Anti-M13 antibody (OD450 nm value is 0-0.35; 1-96. Test group)圖5 重組納米抗體的間接ELISA檢測Fig.5 Indirect ELISA detection of recombinant nanobodies

圖6 Gp5特異性納米抗體氨基酸序列Fig.6 Amino acid sequence of Gp5 specific nanobody

A. Nb1與Nb2基因的PCR擴增;B. 重組質粒pcDNA3.1(-)-Nb1與pcDNA3.1(-)-Nb2的PCR鑒定;C. 重組質粒pcDNA3.1(-)-Nb1與pcDNA3.1(-)-Nb2的雙酶切鑒定;M1. DL700 DNA相對分子質量標準;1. 陰性對照;2. Nb1基因PCR擴增產物;3. Nb2基因PCR擴增產物;M2. DL700 DNA相對分子質量標準;4. 陰性對照;5～8. 菌液PCR擴增產物;M3. DL5000 DNA相對分子質量標準;9. pcDNA3.1(-)-Nb1重組質粒;10. pcDNA3.1(-)-Nb2重組質粒 A. PCR amplification of Nb1 and Nb2 gene; B. Identification of pcDNA3.1(-)-Nb1 and pcDNA3.1(-)-Nb2 by PCR; C. Identification of pcDNA3.1(-)-Nb1 and pcDNA3.1(-)-Nb2 by double enzyme digestion; M1. DNA marker DL700; 1. Negative control; 2. PCR amplification product of Nb1 gene; 3. PCR amplification product of Nb2 gene; M2. DNA marker DL700; 4. Negative control; 5-8. PCR amplification products of bacterial fluid; M3. DNA marker DL5000; 9. Recombinant pcDNA3.1(-)-Nb1; 10. Recombinant pcDNA3.1(-)-Nb2圖7 重組質粒pcDNA3.1(-)-Nbs的構建Fig.7 Construction of pcDNA3.1(-)-Nbs recombinant plasmid

A. 重組質粒pcDNA3.1(-)-Nbs轉染至Marc-145細胞的Western blot鑒定;B. 重組質粒pcDNA3.1(-)-Nb1轉染至Marc-145細胞的熒光定量PCR鑒定;C. 重組質粒pcDNA3.1(-)-Nb2轉染至Marc-145細胞的熒光定量PCR鑒定。與空白對照組相比,****.P<0.000 1 A. Westernblot identification of recombinant plasmid pcDNA3.1 (-)-Nbs transfected into Marc-145 cells; B. Fluorescence quantitative PCR identification of recombinant plasmid pcDNA3.1 (-)-Nb1 transfected into Marc-145 cells; C. Fluorescence quantitative PCR identification of recombinant plasmid pcDNA3.1 (-)-Nb2 transfected into Marc-145 cells. Compared with the Control group, ****. P<0.000 1圖8 重組質粒pcDNA3.1(-)-Nbs轉染至Marc-145細胞Fig.8 Recombinant plasmid pcDNA3.1 (-)-Nbs transfected into Marc-145 cells

將pcDNA3.1(-)-Nb1、pcDNA3.1(-)-Nb2分別轉染至Marc-145細胞中,用1 MOI PRRSV感染各組細胞與空細胞對照組,分別收集0、24、36、48、60、72 h的細胞樣品進行RT-qPCR檢測PRRSVORF7基因 mRNA表達水平的變化。如圖9A所示,病毒與細胞共孵育24 h內,Marc-145-Nb1細胞內的病毒載量與對照組無顯著差異,而在36～72 h內,Marc-145-Nb1細胞內所含病毒量顯著低于對照組,說明Nb1可以在細胞內抑制PRRSV的復制與轉錄。如圖9B所示,在病毒與細胞孵育48 h內,Marc-145-Nb2細胞內所含病毒量與對照組無顯著差異,而于60～72 h內,Marc-145-Nb2細胞內的病毒載量顯著低于對照組,這說明Nb2亦具備抑制PRRSV復制的能力,但較于Nb1對病毒復制的抑制效力,Nb2抑制病毒復制的時間出現較晚,且隨時間的推移其阻礙病毒復制的能力呈下降趨勢,這些因素均說明Nb1較Nb2具備更強的阻礙病毒復制的能力。

A. Marc-145-Nb1對PRRSV復制的影響;B. Marc-145-Nb2對PRRSV復制的影響。與PRRSV對照組相比,ns表示無顯著性差異,***.P<0.001,****.P<0.000 1 A. The effect of Marc-145-Nb1 on PRRSV replication; B. The effect of Marc-145-Nb2 on PRRSV replication. Compared with the PRRSV control group, ns represents no significant difference, ***. P<0.001, ****. P<0.0001圖9 細胞內表達的Nb1與Nb2對PRRSV復制的影響Fig.9 The effect of intracellular expression of Nb1 and Nb2 on PRRSV replication

3 討 論

目前,豬繁殖與呼吸綜合征(俗稱藍耳病)在全球仍呈不斷傳播與流行的趨勢。在我國,該病已流行二十多年,PRRSV特別是高致病性PRRSV的變異株始終是嚴重威脅我國養豬業的最重要病原之一。其中PRRSV GP5蛋白氨基酸序列的高突變性可能給豬群的疫苗保護帶來威脅,為藍耳病的防控帶來了不利影響[15],因此,對藍耳病的診斷與治療具有重大意義。GP5蛋白作為PRRSV中的重要結構蛋白,可以刺激機體發生T細胞的增殖反應,誘導細胞免疫產生[16]。Wang等[17]使用GP5蛋白作為抗原進行酶聯免疫吸附試驗,發現該蛋白具有較高特異性,是一種優異的診斷抗原。Du等[18]使用ORF5基因制備的疫苗免疫仔豬與小鼠,發現疫苗可以使宿主細胞的黏膜免疫有所增強,且能夠顯著提高仔豬與小鼠血清中IgG水平以及腸道內IgA水平。因此,GP5蛋白憑借其具備良好的免疫原性以及較強的中和活性,已成為藍耳病相關抗體制備及疫苗研發的優秀候選蛋白。

納米抗體作為一種較為新穎且親和力強的抗原識別工具,可能因其凸起的對角以及靈活的CDR3環形成loop環,可與蛋白質空間結構上的裂隙與空腔進行結合,從而能識別隱蔽的病毒表位與酶的活性位點,這意味著納米抗體有助于潛在生物靶標的預測以及新的藥理靶點的發現[19]。與傳統抗體相比,納米抗體具備體積小、易于表達與改造等優勢,其可以直接靶向作用于抗原表位,亦可以構建成納米抗體融合蛋白或是多價納米抗體以發揮治療作用[20-21]。近年來,納米抗體在醫學領域抗體研究方面發揮著不可或缺的作用,且在疾病的診斷與治療方面的研究持續推進[22]。劉紅亮[13]針對PRRSV Nsp9蛋白篩選出的Nb6納米抗體可以抑制多種PRRSV毒株在細胞中的增殖與復制。宋歡等[23]制備出PRRSV Nsp2蛋白納米抗體,結果顯示所篩納米抗體具有高度特異性,可滿足其作為診斷與治療抗體的要求。

本研究首先利用原核表達系統對PRRSV-GP5蛋白進行表達,經鎳柱親和層析法純化后免疫羊駝,三免14 d后羊駝體內抗體效價高達1∶819 200,后通過噬菌體展示技術構建GP5-VHH噬菌體抗體展示文庫。噬菌體展示技術源自于將外源多肽于單鏈噬菌體表面上展示的相關研究[24],其原理為將編碼外源蛋白的基因序列或外源多肽插入至編碼噬菌體衣殼蛋白的基因中,從而使得外源蛋白或多肽在噬菌體的表面得以展示[25]。經鑒定,所獲噬菌體文庫的庫容量達2.93×107CFU·mL-1,插入率達98%。后進行連續三輪“吸附-洗脫-富集”的特異性噬菌體淘選,結果顯示,重組噬菌體得到了有效富集,且每輪的洗脫量與回收率均逐漸升高,最終獲得2株不同氨基酸序列的納米抗體,間接ELISA顯示,所篩納米抗體均與PRRSV-GP5蛋白具有良好的親和力。隨后將所獲的2個Nb基因克隆至真核表達載體pcDNA3.1(-)中,利用脂質體瞬時轉染入Marc-145細胞內,與PRRSV共孵育以探究兩株納米抗體于胞內對病毒復制與轉錄的影響,結果顯示所篩的Nb1與Nb2均可在細胞內抑制PRRSV的復制,且Nb1對病毒復制的抑制效力要優于Nb2,這意味著Nb1可成為新型抗PRRSV藥物的候選者。

4 結 論

成功表達與純化PRRSV-GP5蛋白,免疫羊駝后,利用噬菌體展示技術構建出GP5-VHH噬菌體抗體展示文庫,首次篩選出針對PRRSV-GP5蛋白的特異性納米抗體,且該納米抗體于細胞內展現出較好的抑制病毒復制的能力。研究結果為抗PRRSV新型藥物的研發提供了新的思路與試驗依據。