牛諾瓦病毒和牛輪狀病毒雙重RAA-LFD快速檢測方法的建立及應用

李惠惠,董可兒,劉馨博,張春曉,馬 超,陳利蘋,鐘 旗,姚 剛*, 馬雪連*

(1.新疆農業大學動物醫學學院,烏魯木齊 830052;2.動物保健與畜產品質量安全研究實驗室,烏魯木齊 830052; 3.烏魯木齊市動物園,烏魯木齊 830001;4.深圳市真瑞生物有限公司,深圳 518000; 5.新疆畜牧科學院獸醫研究所,烏魯木齊 830000)

犢牛腹瀉是全球養牛業中一種常見的消化道疾病,以消化不良、腹瀉、痢疾等為主要癥狀,極易造成犢牛生長發育不良、生長周期延長、繼發感染甚至死亡,給牧場主造成巨大的經濟損失[1-2]。病毒所致犢牛腹瀉是最常見的因素之一[3]。牛諾瓦病毒(bovine norovirus, BNoV)是嵌杯病毒科、諾瓦病毒屬的無囊膜單股正鏈RNA病毒[4]。1978年,首次在英國腹瀉犢牛的糞便中被發現[5],2018年,首次在我國犢牛腹瀉糞便中檢測到[6],BNoV作為一種新發病原,尚未見關于重組酶介導等溫擴增檢測方法的報道。牛輪狀病毒(bovine rotavirus, BRV)屬于呼腸孤病毒科,輪狀病毒屬,是引起犢牛腹瀉的主要病原之一,感染犢牛后引起的疾病具有發病率高、流行性廣、危害性大等特點,嚴重影響我國養牛業的發展[7-8]。兩者在臨床中單憑癥狀很難區別,給臨床診斷帶來了極大的困難,且常有混合感染而加重腹瀉嚴重度,造成死亡率增加[7,9]。

重組酶介導等溫擴增(recombinase aided amplification, RAA)技術,利用重組酶、單鏈結合蛋白、聚合酶進行反應,是一種具有反應速度快、特異性強、靈敏度高的恒溫擴增技術[10-11]。本研究基于RAA技術,結合側流層析試紙條(lateral flow dipstick, LFD)對擴增產物進行可視化觀察,同時檢測BNoV和BRV,為有效防控BNoV和BRV提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和儀器 病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司),感受態細胞pEASY-T1(北京全式金生物技術有限公司),恒溫快速擴增試劑盒(安普未來生物科技有限公司),天隆Gentier 48E實時熒光定量PCR儀(西安天隆科技有限公司),電熱恒溫水浴鍋(上海尚普儀器設備有限公司)。

1.1.2 樣品來源 BNoV、BRV、牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus, BVDV)、牛冠狀病毒(bovine coronavirus, BCoV)、牛傳染性鼻氣管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus, IBRV)陽性樣品采集自喀什、塔城等地區經本實驗室收集、鑒定和保存。2022年從新疆博樂、喀什等地采集犢牛腹瀉臨床樣本共計168份,樣品放于-80 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1 標準質粒的構建 選用NCBI中BNoV(登錄號:OM991740)的RdRp和BRV(登錄號:MN928486)的VP7基因序列,利用 DNAMAN 軟件進行分析比對,選擇高同源性的保守區域,利用NCBI Primer-BLAST數據庫各設計1條引物,BNoV-F:5′-CCCAGATGGCCCTCTCAGTTCCA-AAGATCTCA-3′,BNoV-R:5′-TGTTCTCAATCCGGTCGCAA-3′;目的片段長度為1 254 bp,BRV-F:5′-GGCTTTAAAAGCGAGAATTTCC-3′,BRV-R:5′-GGTCACATCATACAACTCTAAT-3′,目的片段長度1 062 bp,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應體系:上下游引物各0.5 μL,2×Easytaq PCR SuperMix 12.5 μL,Nuclease-free Water 9.5 μL,cDNA 2 μL。反應程序為94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s,64 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,30個循環;72 ℃ 5 min;瓊脂糖凝膠電泳鑒定目的片段,純化后連接到pEASY-T1載體,并計算出pEASY-BNoV和pEASY-BRV的拷貝數分別為5.27×1010和1.12×1010copies·μL-1。

1.2.2 引物探針的設計及篩選 利用NCBI Primer-BLAST數據庫針對RdRp和BRV的VP7基因設計多條特異性引物,反應完成后,用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RAA產物,經多次試驗篩選,最后選擇了2組引物和探針用于后續試驗。引物序列BNoV-F1:5′-CCCAGATGGCCCTCTCAGTTCCAAAGATCTCAG-3′,BNoV-R1:[5′-TAM]GTGAAATTCTGGGACTGCCCTATTCCAGGGTTG-3′,BNoV-P:[5′FAM]GGGCGA-GAGGTGGCCGTACGCCTCAATGACT[THF]GTAACTGCTACACTTTC[3′C3spacer],片段長度為272 bp;BRV-F1:5′-GTTCCTCTTGCACAGTCAAAGTGTGTCCATTAAA-3′,BRV-R1:[5′-biotin]CAGCTGTGATGTCTAAAACGTTCGCACCAC-CTAC-3′,BRV-P:[5′FAM]CGTT-TGAAACAGTTGCAACGACGGAGAAACT[THF]GTGATTACAGATGTTGT[3′C3spacer],片段長度為258 bp。

1.2.3 核酸提取 使用天根生化科技(北京)有限公司的病毒基因組RNA試劑盒提取BNoV陽性樣本和BRV陽性樣本。將20 μL Proteinase K加入1.5 mL離心管中,并加入200 μL平衡至室溫的肛拭子樣品。加入200 μL Carrier RNA工作液,渦旋混勻15 s。56 ℃孵育15 min。加入250 μL的無水乙醇,渦旋振蕩15 s,室溫靜置5 min。將離心管中的溶液全部轉移至過濾柱,8 000 r·min-1離心1 min,棄廢液。加500 μL緩沖液GD,8 000 r·min-1離心1 min,棄廢液。加600 μL漂洗液PW,靜置2 min,8 000 r·min-1離心1 min,棄廢液。重復上一步驟進行二次漂洗。加500 μL無水乙醇,8 000 r·min-1離心1 min,棄廢液。12 000 r·min-1將空的過濾柱離心3 min。將過濾柱放入1.5 mL的離心管中,室溫放置3 min后,加入50 μL的RNase-Free ddH2O,室溫靜置5 min后,12 000 r·min-1離心1 min。保存于-80 ℃備用。

1.2.4 雙重RAA-LFD反應體系的建立及優化 預試驗反應體系為50 μL,其中C buffer 20 μL,L buffer 5 μL,P-core 12 μL,dNTPs(25 mmol·L-1)0.6 μL,上、下游引物和探針稀釋至10 μmol·L-1,按照不同的配比進行引物探針濃度的篩選,N-core 0.6 μL,DNA 模板3.8 μL,ddH2O 0.9 μL最后加B buffer 2.5 μL。混合后離心,放入恒溫設備中39 ℃孵育30 min。將10 μL RAA混合物加90 μL ddH2O混勻,吸取50 μL溶液直接滴加在樣品墊上,10 min后觀察質控線與檢測線判讀結果。當T1檢測線出現時表示樣品中含有BRV,當T2檢測線出現時表示樣品中含有BNoV。確定引物探針濃度后,以標準品為模板,選擇不同的溫度條件(37～42 ℃)和不同時間條件(5、10、15、20、25、30 min)進行反應,以確定最佳反應條件。

1.2.5 特異性試驗 以質粒pEASY-BNoV(5.27×107copies·μL-1)、pEASY-BRV(1.12×107copies·μL-1),以及BCoV(4.13×107copies·μL-1)、BVDV(2.21×107copies·μL-1)、IBRV(3.20×107copies·μL-1)為模板進行RAA擴增,上樣量均3.8 μL,LFD檢測擴增結果,并用ddH2O為模板作為陰性對照,以確定本方法的特異性。

1.2.6 靈敏度和重復性分析 以構建的pEASY-BNoV和pEASY-BRV進行10倍比稀釋,稀釋度選擇107、105、103、102、101copies·μL-1為模板進行雙重RAA-LFD試驗,使用pEASY-BNoV和pEASY-BRV(稀釋度為107和105copies·μL-1)作為模板進行3次雙重RAA-LFD試驗,以ddH2O為模板作為陰性對照。

1.2.7 臨床樣品檢測 采用建立的雙重RAA-LFD方法與PCR、qPCR方法檢測168份腹瀉樣本,并用ddH2O為模板作為陰性對照,以質粒標準品作陽性對照,比較3種檢測方法的符合性。

2 結 果

2.1 反應體系和條件的優化

通過引物和探針的優化,確定BNoV上、下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL,BRV上、下游引物(10 μmol·L-1)各2 μL,BNoV探針(10 μmol·L-1)0.3 μL,BRV探針(10 μmol·L-1)0.6 μL。結果顯示,試驗的最佳反應溫度為39 ℃(圖1A)。在最佳反應溫度39 ℃的條件下,分別在5、10、15、20、25、30 min的不同反應時間進行擴增,結果顯示,試驗的最佳反應時間為15 min(圖1B)。

AB A. 反應溫度的優化(1. 陰性對照;2. 37 ℃;3. 38 ℃;4. 39 ℃;5. 40 ℃;6. 41 ℃;7. 42 ℃);B. 反應時間的優化(1. 5 min;2. 10 min;3. 15 min;4. 20 min;5. 25 min;6. 30 min;7. 陰性對照) A. Optimization of reaction temperature (1. Negative control; 2. 37 ℃; 3. 38 ℃; 4. 39 ℃; 5. 40 ℃; 6. 41 ℃; 7. 42 ℃); B. Optimization of reaction time (1. 5 min; 2. 10 min; 3. 15 min; 4. 20 min; 5. 25 min; 6. 30 min; 7. Negative control)圖1 RAA-LFD反應條件的優化Fig.1 Optimization of reaction conditions of RAA-LFD

2.2 特異性試驗

雙重RAA-LFD特異性試驗結果使用側流層析試紙條進行分析。結果顯示(圖2),只有加入了相應的病毒模板,試紙條檢測線才會出現紅色條帶,未出現非特異性擴增,不存在交叉反應。

1. BNoV和BRV;2. BRV;3. BNoV;4. BCoV;5. BVDV;6. IBRV;7. 陰性對照 1. BNoV and BRV; 2. BRV; 3. BNoV; 4. BCoV; 5. BVDV; 6. IBRV; 7. Negative control圖2 RAA-LFD的特異性試驗Fig.2 Specificity test of RAA-LFD

2.3 敏感性及重復性試驗

雙重RAA-LFD敏感性及重復性試驗結果使用側流層析試紙條進行分析。結果表明(圖3),BNoV和BRV的雙重RAA-LFD的敏感性均為103copies·μL-1。BNoV和BRV標準品分別使用107、105copies·μL-1兩個稀釋度的陽性標準品為模板,結果表明(圖4),該方法重復性良好。

1. 陰性對照;2. 107 copies·μL-1;3. 105 copies·μL-1;4. 103 copies·μL-1;5. 102 copies·μL-1;6. 101 copies·μL-1 1. Negative control; 2. 107 copies·μL-1; 3. 105 copies·μL-1; 4. 103 copies·μL-1; 5. 102 copies·μL-1; 6. 101 copies·μL-1圖3 RAA-LFD的敏感性試驗Fig.3 Sensitivity test of RAA-LFD

AB A. 質粒拷貝數為107 copies·μL-1 (1～3. 質粒樣品;4. 陰性對照);B. 質粒拷貝數為105 copies·μL-1 (1～3. 質粒樣品;4. 陰性對照) A. The copy number of plasmids was 107 copies·μL-1 (1-3. Plasmids samples; 4. Negative control); B. The copy number of plasmids was 105 copies·μL-1 (1-3. Plasmids samples; 4. Negative control)圖4 RAA-LFD的重復性試驗Fig.4 Repeatability test of RAA-LFD

2.4 雙重RAA-LFD臨床樣本檢測

用建立的雙重RAA-LFD方法檢測從牛場采集的腹瀉樣品168份,使用PCR和qPCR法分別檢出BNoV陽性樣本70、85份,檢出BRV陽性樣本40、71份,使用雙重RAA-LFD法檢出BNoV陽性樣本82份,檢出BRV陽性樣本41份,利用PCR方法和雙重RAA-LFD法檢測BNoV的陽性符合率為98.57%,陰性符合率為87.86%,總符合率為92.26%;檢測BRV陽性符合率為85.00%,陰性符合率為94.53%,總符合率為92.26%;利用qPCR方法和雙重RAA-LFD法檢測BNoV的陽性符合率為91.76%,陰性符合率為96.39%,總符合率為94.05%;檢測BRV陽性符合率為52.11%,陰性符合率為95.88%,總符合率為77.38%;表明本研究建立的雙重RAA-LFD方法可用于臨床樣品檢測。

3 討 論

BNoV和BRV在一些國家和地區的牛群中廣泛存在,感染會引起犢牛腹瀉導致嚴重脫水,并可能繼發感染加重疾病的嚴重程度[12],病毒性病原感染導致腹瀉較為嚴重。孫吉等[13]對川西北草原的220份犢牛腹瀉樣進行檢測,BNoV的檢出率為5.9%,BRV的檢出率高達40.5%,吳靜等[14]調查新疆喀什地區犢牛腹瀉情況,BNoV檢出率為25.07%,BRV檢出率9.37%,其混合感染率為24%。在新疆地區,牛群養殖規模不斷擴大,病毒混合感染情況較為嚴重,單一病原診斷多耗時耗力,故需尋找針對多病原診斷且快速簡便的方法。常用的病毒鑒定方法如PCR、qPCR和ELISA等在病毒檢測中準確、可靠,但由于過程耗時,操作繁瑣,無法實現基層腹瀉樣本的快速檢測,因此本試驗建立了一種可視化雙重RAA-LFD快速檢測方法。

RAA是具有我國自主知識產權的等溫核酸擴增技術,可在恒溫下快速高效地擴增DNA序列,結合LFD可肉眼觀察擴增結果,不需要熱循環器,只需要一個水浴鍋就可以進行RAA反應[15-16],與PCR、qPCR、ELISA、常規病毒分離和LAMP等方法相比,RAA技術最大的優勢在于檢測時間短[17],后來旺等[18]根據金黃色葡萄球菌的保守基因(nuc)建立RAA-LFD法,20 min即可檢測。王姝等[19]建立了現場快速檢測鯉皰疹病毒II型的RAA-LFD法,比RT-PCR法靈敏度高出10倍,該方法可在10 min看到目的片段的有效擴增,由此可見,RAA-LFD方法在細菌和病毒方面的快速檢測已經全面發展。且RAA技術因其擴增效率高、對設備要求低以及操作簡便等特點,在病原檢測方面極具優勢。近年來,越來越多的研究者開始關注雙重熒光RAA檢測方法的建立,吳江等[20]根據豬圓環病毒2型和3型的Cap基因建立了雙重熒光RAA檢測方法,周冬根等[21]建立了檢測漢坦病毒的雙重熒光RT-RAA技術。但關于同時檢測兩種病毒的RAA-LFD方法報道較少,且針對BNoV和BRV同時檢測尚未見報道。

本試驗在重組質粒標準品的基礎上建立了同時檢測BNoV和BRV的雙重RAA-LFD方法。最佳檢測時間為20 min,后來旺等[18]檢測金黃色葡萄球菌最短時間為20 min,說明了其快速檢測的特點;最佳的檢測溫度為39 ℃,與鄧春冉等[22]建立的鴨星狀病毒RT-RAA方法優化溫度結果一致;且與BCoV、BVDV和IBRV無交叉反應,最低檢測限均為103copies·μL-1,可以看出此方法特異性較好;在臨床樣本檢測中,陽性樣本符合率較高,且檢出陽性樣本數與PCR的檢測結果基本一致。臨床樣品檢測結果也提示,BNoV在新疆犢牛腹瀉中感染率較高,需要持續關注BNoV的流行及其帶來的危害。

4 結 論

本研究應用RAA-LFD技術構建了對BNoV和BRV兩種病毒的快速診斷方法,經過靈敏性、特異性及重復性試驗,驗證其在39 ℃恒溫條件下20 min內可以檢出,為基層地區快速檢測提供了可能性,為犢牛腹瀉流行的地區快速篩查、診斷和監測提供了便利工具,有利于病毒感染早期診斷,及時治療,具有良好的應用前景。