Kindlin2在卵巢癌中表達及其對化療耐藥、臨床預(yù)后的影響

趙瑞麗 班春妹 趙玲 李金霞 楊洪喜

(邢臺市人民醫(yī)院 1血液科,河北 邢臺 054001;2婦產(chǎn)科;3邢臺醫(yī)學高等?？茖W校生理教研室)

上皮性卵巢癌是臨床上常見的惡性婦科腫瘤之一,其發(fā)病率僅次于宮頸癌及宮體癌〔1〕,由于其發(fā)病隱匿及缺乏早期診斷指征,多數(shù)患者確診時已處于晚期,不具有手術(shù)根治機會,具有較差預(yù)后〔2〕。目前上皮性卵巢癌標準治療方案為手術(shù)聯(lián)合化療,且80%的該類患者對化療藥以鉑類為基礎(chǔ)的化療敏感,但多數(shù)會發(fā)生化療耐藥或復(fù)發(fā),90%以上患者死于原發(fā)性或繼發(fā)性化療耐藥〔3〕,因此探索有效的卵巢癌預(yù)防和早期診斷及化療耐藥預(yù)測特異性指標,對于化療效果及預(yù)后尤為重要。近年來很多研究表明腫瘤的發(fā)生是多基因參與、多因素引起的惡性細胞性增殖,因此從基因水平探索腫瘤的發(fā)生發(fā)展機制對腫瘤的早期診斷及輔助化療等方面具有至關(guān)重要的作用〔4〕。Kindlins屬于包含F(xiàn)ERM結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)家族,所有后生動物具有至少一個Kindlin基因。其中Kindlin2保留了Kindlins家族的祖先特征,屬于黏附蛋白,在中胚層來源的組織中高表達,在細胞連接、調(diào)控細胞核功能及維持質(zhì)膜形態(tài)等方面具有重要作用〔5〕。目前已有研究表明Kindlin2與前列腺癌〔6〕、乳腺癌〔7〕、膽囊癌〔8〕和急性髓系白血病〔9〕等的侵襲性、耐藥性有關(guān),但Kindlin2與卵巢癌的關(guān)系及對卵巢癌化療耐藥的影響鮮有研究報道。本研究重點探索了Kindlin2在上皮卵巢癌患者中的表達及對卵巢癌化療耐藥和臨床預(yù)后的影響及作用機制,以期為臨床診斷和治療提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取邢臺市人民醫(yī)院2013年1月至2015年6月經(jīng)婦科手術(shù)術(shù)后病理檢查明確診斷為上皮性卵巢癌的組織石蠟標本100例(由本院兩位以上有經(jīng)驗病理科醫(yī)師經(jīng)過病理組織切片觀察證實為上皮性卵巢癌患者的標本),年齡24～81歲,平均49.8歲,中位年齡50歲。納入標準:(1)均為原發(fā)性上皮性卵巢癌;(2)術(shù)前均未接受放療、化療等治療;(3)術(shù)后有意愿接受化療,并能堅持以鉑類和紫杉醇聯(lián)合化療者;(4)有完整的臨床病理資料;(5)患者及家屬知情同意此項研究并通過醫(yī)院倫理審批同意。排除有其他惡性腫瘤病史者。按國際婦科聯(lián)盟(FIGO 2016)標準進行臨床病例分期;腫瘤組織學分級:G1+G2級41例,G3級59例。另選取行手術(shù)切除的良性卵巢漿液囊腫組織20例為良性卵巢病變組,正常卵巢組織取自因子宮肌瘤或子宮脫垂附件切除的患者20例為正常卵巢組。各組一般情況差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.2主要試劑 RNA提取試劑盒、動物組織蛋白提取、免疫組化、化學發(fā)光顯色試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司;人抗Kindlin2單克隆抗體、人抗β-actin單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記抗體購自Abcam〔艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司〕;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.3免疫組化 采用免疫組化SP法對受試者卵巢組織中Kindlin2蛋白表達水平進行測定。將符合條件的受試者卵巢組織用石蠟包埋后用石蠟切片機切成厚度為4 μm的薄片,將石蠟切片用甲苯脫蠟后再用梯度酒精水化,用3%過氧化氫(H2O2)室溫孵育5～10 min,以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性;用磷酸鹽緩沖液(PBS)水洗3次,每次3 min,再用蒸餾水沖洗緩沖液;用一抗稀釋液(兔抗人Kindlin2單克隆抗體美國abcam,1∶100)封閉,室溫孵育10 min,去血清后,滴加一抗工作液,4 ℃過夜孵育;PBS沖洗3次,每次3 min,滴加適量用生物素標記的二抗工作液,室溫下孵育30 min,PBS 沖洗3次,每次3 min;用配制的二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑顯色,自來水沖洗終止顯色反應(yīng),蘇木素復(fù)染2 min,用梯度酒精脫水、二甲苯透明后,再中性樹膠封片,顯微鏡下觀察顯色結(jié)果。

1.4實時熒光定量PCR 用組織RNA提取試劑盒提取總RNA,超微量分光光度計測量RNA的濃度和純度(純度要求:A260/A280比值在2.0～2.2符合要求),用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,以cDNA為模板進行PCR擴增。引物序列:Kindlin2上游5′-ATTCAGGCAGATGCTAAG-3′,下游5′-CCAGGAGTGATAAGAGGC-3′,磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參基因〔各引物于生工生物工程(上海)股份有限公司合成〕,PCR條件為:95 ℃ 30 s,預(yù)變性;95 ℃ 2 s、60 ℃ 20 s,40個循環(huán);60 ℃ 60 s。相對表達水平用2-ΔΔCt計算。

1.5Western印跡檢測蛋白表達 卵巢組織用組織蛋白提取試劑盒提取全蛋白后,采用二喹啉甲酸(BCA)法檢測提取蛋白的濃度,利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離等量蛋白(約30 μg)后將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后一抗(用5%脫脂奶粉1∶500稀釋)4 ℃孵育過夜后PBS 15 min/3次洗膜后再用二抗室溫下孵育2 h,加入顯色劑曝光后,分析蛋白條帶灰度值,GAPDH作為內(nèi)參蛋白。

1.6療效評價及隨訪 每6 w化療完成后根據(jù)WHO腫瘤療效評價標準〔10〕評定化療療效,分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、穩(wěn)定(SD)、 進展(PD)?？偩徑饴?=(CR例數(shù)+PR例數(shù))/總例數(shù)×100%。隨訪時間至2021年12月31日,觀察EOC患者總生存期(OS,指手術(shù)開始至死亡或最終隨訪的時長)、無病生存期(DFS,指手術(shù)結(jié)束時到患者再次出現(xiàn)癥狀或有轉(zhuǎn)移現(xiàn)象的時長)。

1.7構(gòu)建穩(wěn)定敲低Kindlin2細胞系 人卵巢癌細胞系SK0V3(購自美國ATCC公司),于10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基進行培養(yǎng),培養(yǎng)箱為95%飽和濕度、5%CO2。呈對數(shù)增長期的細胞被取用于實驗。后利用shRNA干擾技術(shù)構(gòu)建穩(wěn)定敲低Kindlin2基因的SKOV3/shKindlin2細胞株及對照細胞株SKOV3/shCon。具體為接種適量SKOV3細胞于24孔板中,待細胞生長至60%～80%時將1 ml的shKindlin2慢病毒液和陰性對照的shCon分別加入24孔板SKOV3細胞中,分別標記為shKindlin2組和shCon組。于培養(yǎng)箱內(nèi)進行48 h感染,后細胞被轉(zhuǎn)至6孔板,進行細胞株穩(wěn)定處理。

1.8卵巢癌細胞藥物敏感性檢測 取3×103個細胞接種于96孔板中,24 h后依次加入梯度濃度(0、3、6、9、12、15 μmol/L)的含化療藥物順鉑(cDDP)的RPMI1640培養(yǎng)基?；熥饔?8 h后,每孔加入20 μl甲硫基磺酸鹽(MTS)試劑,37 ℃繼續(xù)孵育2.5 h,酶標儀測定吸光度(OD)值。計算各組細胞存活率,繪制細胞生長曲線圖。

1.9統(tǒng)計學分析 采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析和χ2檢驗。多因素分析采用Logistic回歸分析,采用Kaplan-Meier進行生存期分析。

2 結(jié) 果

2.1Kindlin2在卵巢組織中的表達 Kindlin2主要表達于細胞質(zhì)中,呈黃色至棕黃色顆粒狀。Ⅰ～Ⅱ期上皮性卵巢癌組Kindlin2表達率與Ⅲ～Ⅳ期上皮性卵巢癌組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);在良性卵巢病變組、正常卵巢組中Kindlin2呈低表達或不表達,上皮性卵巢癌各組與其他兩組Kindlin2表達率差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05,P<0.01)。見表1、圖1。

圖1 不同類型卵巢組織中Kindlin2表達(HE染色,×200)

表1 各組組織類型、Kindlin2 mRNA、蛋白表達比較

2.2卵巢組織Kindlin2 mRNA的表達 熒光定量PCR結(jié)果顯示,Ⅲ～Ⅳ期上皮性卵巢癌組Kindlin2 mRNA相對表達量顯著高于其余3組(均P<0.05),良性卵巢病變組和正常卵巢組Kindlin2 mRNA相對表達量無顯著性差異(P>0.05),這與免疫組化結(jié)果具有一致性。見表1。

2.3Western印跡檢測卵巢組織中Kindlin2蛋白表達 上皮性卵巢癌Kindlin2蛋白表達顯著高于良性卵巢病變和正常卵巢(P<0.05),良性卵巢病變組和正常卵巢組Kindlin2變化無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見表1,圖2。卵巢癌高(1.04±0.22,n=59)、中(2.51±0.25,n=16)、低(3.73±0.34,n=25)分化程度和臨床分期Ⅰ(0.75±0.11,n=17)、Ⅱ(1.36±0.24,n=20)、Ⅲ(2.73±0.26,n=25)、Ⅳ(4.03±0.38,n=38)各組Kindlin2蛋白表達變化依次升高,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。卵巢癌臨床分期越高,其分化程度越低,Kindlin2表達水平越高,這與免疫組化和PCR檢測檢測結(jié)果具有一致性。見圖2。

圖2 Kindlin2在不同卵巢組織、不同分期及不同分化卵巢癌組織中表達

2.4Kindlin2蛋白表達與化療效果及化療耐藥關(guān)系 Kindlin2陰性表達患者化療有效率顯著高于Kindlin2陽性患者,化療耐藥率顯著低于Kindlin2陽性患者(P<0.001)。見表2。

2.5敲低Kindlin2增強卵巢癌細胞SKOV3化療敏感性 相較于shCon組(1.08±0.24),shKindlin2組Kindlin2蛋白表達量(0.23±0.15)明顯降低(P<0.05)。見圖3。MTS法進行化療敏感性檢測,不同梯度濃度化療藥物處理的shKindlin2組細胞存活率顯著低于shCon組(均P<0.05),表明敲低Kindlin2可有效增強卵巢癌細胞化療敏感性。見表3。

表3 不同濃度化療藥物下卵巢癌細胞化療敏感度(%)

2.6Kindlin2蛋白表達與卵巢癌臨床病理特征的相關(guān)性 Kindlin2陽性表達患者在不同腫瘤最大直徑、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)性、病理學分級差異顯著(P<0.001)。化療耐藥性在不同腫瘤最大直徑、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)性及病理學分級差異顯著(P<0.05)。見表4。

表4 Kindlin2蛋白陽性表達與卵巢癌臨床病理特征及化療耐藥性單因素分析〔n(%)〕

2.7卵巢癌患者是否發(fā)生化療耐藥多因素分析 以卵巢癌患者是否發(fā)生化療耐藥為因變量,以單因素分析差異具有統(tǒng)計學意義的因素為自變量進行多因素Logistic回歸分析,結(jié)果顯示腫瘤最大直徑、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、是否復(fù)發(fā)、Kindlin2陽性表達是患者是否發(fā)生化療耐藥的危險因素,病理學分級是保護因素(P<0.05)。見表5。

表5 卵巢癌患者是否發(fā)生化療耐藥多因素分析

2.8Kindlin2表達與卵巢癌患者術(shù)后生存率之間的關(guān)系 病例隨訪回顧性分析發(fā)現(xiàn)100 例上皮性卵巢癌患者的總術(shù)后 5 年生存率為 37%,平均生存時間(30.77±16.95)個月。Kindlin2陰性表達率為37%,Kindlin2陰性表達的卵巢癌患者術(shù)后5年存活率(45.9% vs 20.6%)及平均生存時間〔(36.25±17.48) vs (21.43±16.72)個月〕均明顯高于陽性表達者(χ2=7.111、t=9.204,均P<0.01)。見圖4。

圖4 卵巢癌組織中Kindlin2表達與患者生存率的關(guān)系

3 討 論

目前,卵巢癌的發(fā)生率一直居高不下,而其治療多采用一種化療或聯(lián)合化療(結(jié)合鉑類和紫杉烷類治療)的方式〔11〕,但在長期化療過程中患者常有腸,膀胱、輸尿管和血管受傷的風險,其中許多患者遭受化學療法引起嚴重不良反應(yīng),此外在臨床治療中化療耐藥頻繁發(fā)生,最終導(dǎo)致化療失敗,引起患者腫瘤復(fù)發(fā)或直接死亡〔12〕。因此,尋找預(yù)測卵巢癌發(fā)生、化療耐藥、臨床預(yù)后的生物學標志物,對卵巢癌的診斷及降低化療耐藥發(fā)生率和延長患者生存周期具有重要價值。

有報道表明在多種形式的癌癥和組織纖維化中有Kindlin2異常表達〔13〕,而且Kindlin2的整聯(lián)蛋白獨立功能在某些疾病方面的發(fā)病機制中起著重要作用〔14〕。有研究發(fā)現(xiàn)Kindlin2可促進胰腺癌細胞的增殖和遷移〔15〕,此外也有研究表明Kindlin2通過刺激轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β誘導(dǎo)的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化激活了癌癥相關(guān)的成纖維細胞,促進了膀胱癌細胞的侵襲性〔16〕。Kindlins在各種細胞類型中被檢測到,在細胞增殖、遷移、分化和細胞死亡中發(fā)揮廣泛的生物學功能〔17〕,其機制可能是Kindlin2通過TGF-β、Wnt/β-catenin、Hedgehog、p53等途徑參與癌癥腫瘤的侵襲-轉(zhuǎn)移級聯(lián)過程〔18〕。這些結(jié)果提示,卵巢癌中Kindlin2呈高表達,可能參與了卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展,其表達水平可能與組織分化程度和臨床分期有關(guān)。

卵巢癌患者的治療選擇非常有限,化療作為一線治療標準,但患者最終會產(chǎn)生對化療藥物的耐藥性〔19〕,因此,尋找使腫瘤對化療敏感并限制化療耐藥性的方法是延長卵巢癌患者生存期的可行策略。本研究結(jié)果預(yù)示著Kindlin2的高水平表達可能降低卵巢癌患者對化療藥物的敏感性。也有其他研究表明Kindlin2表達水平?jīng)Q定了轉(zhuǎn)移性前列腺癌細胞對多西紫杉醇誘導(dǎo)的凋亡和細胞死亡的敏感性,Kindlin2的敲除增強了PC3細胞對多西紫杉醇的敏感性,Kindlin2的過度表達增強了這些細胞對多西紫杉醇的抵抗力〔20〕。而本研究通過細胞實驗證實,敲低Kindlin2可有效增強卵巢癌細胞化療敏感性。這與以上結(jié)果具有一致性。Kindlin2表達與不同腫瘤類型的預(yù)后有不同的相關(guān)性〔21〕,研究表明Kindlin2的表達水平與乳腺癌、膀胱癌等不同癌癥的侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和生存率降低顯著相關(guān)〔22〕。也有研究證實,Kindlin2在肺腺癌中的表達水平均顯著升高,在肺腺癌中阻斷Kindlin2表達可顯著降低吡咯啉-5-羧酸還原酶(PYCR)1和脯氨酸水平,減少體內(nèi)纖維化,從而顯著抑制腫瘤生長和降低死亡率〔23,24〕。本研究結(jié)果提示,Kindlin2可能促進了卵巢癌的形成。另外本研究隨訪結(jié)果表明,Kindlin2表達的增強可能是上皮性卵巢癌患者預(yù)后不良的指標之一。

綜上,Kindlin2在上皮性卵巢癌患者中呈現(xiàn)高表達狀態(tài),其高表達降低了患者對化療藥物的敏感性并引起化療耐藥,此外Kindlin2的高表達可能預(yù)示著卵巢癌患者的不良預(yù)后,其可能成為實體瘤的一個有希望的治療靶點。但本研究也有一定不足,病例數(shù)較少,另外本研究生存率高,可能和患者優(yōu)質(zhì)護理方案有關(guān),本研究將在后期擴大樣本量,結(jié)合基礎(chǔ)研究探究其具體機制,來驗證實驗結(jié)果。