蒙藥蘇格木勒-3湯對大鼠酒精性心肌病的保護作用及機制

付丹妮 甄東 軒天麒 張瑄 于麗君 劉明潔 王敏,2

(內(nèi)蒙古民族大學 1醫(yī)學院,內(nèi)蒙古 通遼 028000;2附屬醫(yī)院)

長期大量飲用酒精飲料會嚴重損害人體各個器官和系統(tǒng),包括肝臟、胰腺、心臟、大腦、骨骼、免疫系統(tǒng)和骨骼肌等〔1〕。長期慢性攝入酒精會造成多種心肌損傷,包括心肌重塑、心肌肥厚、心肌細胞線粒體結構和功能改變,蛋白質(zhì)合成減少,纖維性結構受損,心肌收縮功能紊亂,肌漿網(wǎng)擴張,氧化應激,運輸和脂肪酸代謝紊亂,在晚期最終導致心肌細胞的凋亡應激〔2,3〕。蘇格木勒-3湯(SD-3)又名豆蔻三味湯,是內(nèi)蒙古民族大學附屬醫(yī)院自制的蒙藥制劑,由白豆蔻、白苣勝、蓽茇組成,為赫依病之專方(赫依相當于中醫(yī)理論中的“氣”),尤對心赫依病效果更佳。前期研究結果表明,SD-3對異丙腎上腺素誘導的心肌肥厚及心肌細胞鈣超載具有一定的保護作用〔4～7〕。臨床應用時發(fā)現(xiàn),SD-3與常規(guī)溶栓的西藥聯(lián)合應用能夠有效保護患者的心肌損傷〔8,9〕。本研究探索SD-3對酒精性心肌病(ACM)保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1藥物與試劑 SD-3經(jīng)蒸餾水沸水浸泡密封過夜后,4層紗布過濾除去沉渣得上清液,每毫升上清液中含0.2 g生藥,將其保存在4 ℃冰箱。戊巴比妥鈉購自德國Merck公司。

1.2動物模型建立與分組 SD健康SPF級雄性大鼠60只,體質(zhì)量200～220 g,由長春億斯公司提供,全部大鼠以普通飼料喂養(yǎng),飼養(yǎng)在標準溫度為20～22 ℃及相對濕度為50%～60%的清潔、通風較好的動物室中,分籠飼養(yǎng),8只/籠,籠子足夠大鼠自由活動,同樣可自由飲水進食,平均12 h的自然晝夜條件。大鼠適應性喂養(yǎng)1 w后,稱重后隨機分為6組(n=10),分別為正常(CON)組、模型(ACM)組、SD-3低劑量(ACM+SL)組、SD-3中劑量(ACM+SM)組、SD-3高劑量(ACM+SH)組、陽性藥物曲美他嗪(ACM+TI)組。除了CON組以普通水飲用及灌胃,其余5組第1周以10 %酒精隨意飲用,60%酒精每周灌胃1次,第2周以10%酒精隨意飲用,60%酒精每周灌胃2次,第3～16周,20%酒精隨意飲用,60%酒精每周灌胃2次,第17周至第6個月以30%酒精隨意飲用,60%酒精每周灌胃2次。在進行酒精灌胃的同時,ACM+SL、ACM+SM、ACM+SH組分別用50、100和200 mg/(kg·d)劑量灌胃。

1.3心臟指標檢測 SD-3末次給藥后,大鼠禁食不禁水,稱取體質(zhì)量,按45 mg/kg劑量腹腔注射2%戊巴比妥鈉。麻醉后,采用彩色多普勒超聲心動圖檢測心臟指標,觀察記錄各組左心室射血分數(shù)(EF)、左心室舒張末內(nèi)徑(LVEDD)、左心室收縮末內(nèi)徑(LVESD)、短軸縮短率(FS)等指標。

1.4病理觀察 大鼠麻醉前操作同1.3。麻醉后取心臟,用0.9 %氯化鈉溶液清洗心臟組織及血跡,觀察心臟形態(tài)變化。稱取各組心臟重量,心臟肥厚程度以心臟重量指數(shù)(HW/BW)表示。截取心尖部分,置于4%多聚甲醛中固定,石蠟包埋,進行蘇木素-伊紅(HE)染色和Masson染色,并在顯微鏡下觀察大鼠心肌組織的病理學改變。

1.5血流動力學檢測 取大鼠新鮮血液,常溫下,3 000 r/min離心15 min,取上清得各組血清。采用相應的南京建成肌酸激酶(CK-MB)、肌鈣蛋白(CTn)T、三酰甘油(TG)和總膽固醇(TC)試劑盒,檢測各組血清中以上指標含量,具體步驟操作參照試劑盒說明書進行。

1.6Western印跡實驗 取新鮮大鼠心臟組織,剪成小塊后超聲粉碎器制備心臟組織勻漿,用一定體積的放射免疫沉淀(RIPA)裂解30 min,4 ℃,12 000 r/min離心10 min取上清,用碧云天定量試劑盒進行含量測定。依次進行配膠、加樣并跑膠、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵一抗、孵二抗、電化學發(fā)光(ECL)顯色。采用ImageJ 軟件(V1.8.0 版)進行蛋白條帶定量分析,GAPDH為內(nèi)參。實驗重復3次,取平均值。

1.7統(tǒng)計學分析 采用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1各組心臟外觀及HW/BW指數(shù) 與CON組相比,ACM組HW/BW顯著升高(P<0.05);與ACM組相比,ACM+SL、ACM+SM和ACM+SH組呈濃度依賴性降低酒精誘導的HW/BW增加。但ACM與ACM+TI組HW/BW差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。以上結果提示SD-3可以改善酒精誘導的心肌肥厚。見圖1、表1。

表1 各組心功能、HW/BW及膠原含量

圖1 各組心臟大體

2.2各組心臟指標 與CON組相比,ACM組LVEDD顯著上升,LVESD、EF和FS顯著下降(P<0.05,P<0.01)。說明長期過量的酒精攝入能夠?qū)е滦募》屎?使左室收縮功能下降,但經(jīng)不同劑量SD-3處理后上述現(xiàn)象得到改善。與ACM組比較,ACM+TI組LVEDD、LVESD顯著改善(P<0.05),表明TI處理能緩解酒精誘導的大鼠心功能異常。見表1、圖2。

圖2 超聲心動圖檢測各組心功能

2.3各組心肌組織病理 CON組心肌組織細胞完整,結構正常,界限清晰。ACM組心肌組織細胞崩解壞死,細胞排列紊亂,界限不清,細胞核散在,呈彌漫性壞死,胞質(zhì)混濁,細胞核散在于細胞之間;而經(jīng)不同劑量SD-3處理后有所緩解。Masson染色結果及膠原容積分數(shù)(CVF)定量分析結果顯示,與CON組相比,ACM組心肌間質(zhì)纖維化明顯增加(P<0.05),而經(jīng)不同劑量SD-3給藥后,心肌間質(zhì)纖維化有不同程度改善,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。ACM+TI組膠原含量較ACM組改善,但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1、圖3。

圖3 各組心肌組織(×200)

2.4各組血清中CTnT、CK-MB、TG和TC含量 與CON組相比,ACM組CTnT、CK-MB、TG和TC含量顯著增加(P<0.01);而與ACM組相比,ACM+SL、ACM+SM、ACM+SH組CTnT、CK-MB、TG和TC含量則呈濃度依賴性降低,ACM+TI組cTnT、CK-MB含量顯著降低(P<0.01)。見表2。

表2 各組血清CTnT、CK-MB、TG、TC及Bax、Caspase3、Caspase7和Bcl-2表達

2.5各組心肌組織中凋亡相關蛋白 與CON組比較,ACM組B細胞淋巴瘤(Bcl)-2相關X蛋白(Bax)、胱天蛋白酶(Caspase)3、Caspase7活性顯著升高,Bcl-2活性顯著降低(P<0.05,P<0.01);與ACM組比較,ACM+SM、ACM+SH和ACM+TI組Bax、Caspase3、Caspase7活性顯著降低,Bcl-2活性顯著升高(P<0.05,P<0.01)。見表2、圖4。

1～6:CON組、ACM組、ACM+SL組、ACM+SM組、ACM+SH組、ACM+TI組圖4 Western印跡檢測各組Bax、Caspase3、Caspase7和Bcl-2蛋白表達

3 討 論

研究表明,長期過量飲酒導致的ACM主要以心臟重量增加,左室擴張,心功能不全等表現(xiàn)為主〔10〕。過量的酒精會引發(fā)多種臟器疾病,尤其是肝臟和心臟。研究表明,體內(nèi)長期蓄積過量的酒精及其代謝物乙醛會引發(fā)心肌毒性,從而造成ACM〔11〕。ACM的發(fā)展和進程伴隨著許多病理和分子變化,在此過程中心肌細胞及組織會產(chǎn)生一系列不良的結構變化,涉及多種機制,包括氧化應激的產(chǎn)生、凋亡性細胞死亡、線粒體生應激受損、脂肪酸及蛋白質(zhì)代謝和運輸紊亂等〔12〕。細胞凋亡是存在于機體整個生命進程的基本生理機制,在心肌細胞中,Bcl-2和Bax相互作用,共同調(diào)控細胞凋亡〔13,14〕。有證據(jù)表明,在ACM動物模型中,長期大量酒精導致心肌細胞壞死和凋亡,引起細胞凋亡Bcl-2相關蛋白和Caspase3活性增加,且促使脂質(zhì)及過氧化物蓄積,造成心肌肥厚〔15〕。在傳統(tǒng)蒙醫(yī)理論中,將心血管疾病臨床癥狀歸納為心赫依病,心為赫依主串行之道,蒙醫(yī)經(jīng)典著作《四部醫(yī)典》記載“治心、主脈、大腸之病,應以抑赫依為主”。本文前期的研究發(fā)現(xiàn),SD-3作為抑赫依之專方,能夠改善異丙腎上腺素誘導大鼠的心肌肥厚。本研究結果表明,SD-3通過抑制細胞凋亡相關蛋白Bax、Caspase3、Caspase7等表達,增強Bcl-2蛋白表達,保護心肌細胞免受酒精的損傷,維持心肌細胞數(shù)目的穩(wěn)定,從而治療ACM。