香豆素通過調(diào)節(jié)Keap1/Nrf2/ARE信號通路減輕腦缺血-再灌注大鼠神經(jīng)損傷

李祥欣 劉義鋒 孫軍 汪寧 劉少哲 白方會 溫昌明 張保朝

(南陽市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科介入病區(qū),河南 南陽 473000)

腦卒中為臨床最常見的腦血管疾病,發(fā)病率逐年上升,且具有高致殘率和高致死率,可分為缺血性和出血性兩大類,以前者居多,約占腦卒中總發(fā)病率的80%〔1,2〕。采用機(jī)械取栓或靜脈溶栓以盡早恢復(fù)血供為治療缺血性腦卒中最有效的手段,但血供恢復(fù)后可在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)一步加重腦組織損傷,這種損傷稱之為腦缺血-再灌注損傷(CIRI),其發(fā)生機(jī)制主要?dú)w于大量自由基累積而超過自身抗氧化清除能力,繼而引發(fā)氧化應(yīng)激損傷〔3～7〕。因此,在恢復(fù)血供時(shí)輔以有效的抗氧化藥物以提高機(jī)體抗氧化能力,從而防治CIRI。香豆素是一類廣泛存在于植物界中的天然有機(jī)化合物,具有較強(qiáng)的抗氧化藥理活性,其可減輕因氧化應(yīng)激而導(dǎo)致的腦損傷〔8～10〕。Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白(Keap)1/核因子E2相關(guān)因子(Nrf)2/抗氧化反應(yīng)元件(ARE)信號通路是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化信號通路,可抵抗氧化應(yīng)激反應(yīng)造成的細(xì)胞損傷〔11,12〕。然而香豆素是否通過激活Keap1/Nrf2/ARE信號通路而發(fā)揮減輕腦缺血-再灌注損傷尚不清楚。本研究通過建立CIRI大鼠模型,觀察香豆素對大鼠神經(jīng)損傷的影響,并探究Keap1/Nrf2/ARE信號通路作為香豆素藥理機(jī)制的可能性。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～8周齡SPF級雄性SD大鼠,體質(zhì)量200～220 g,購自北京維通利華公司。

1.2試劑與器材 香豆素(貨號102249)購自江蘇永健醫(yī)藥公司;Keap1/Nrf2/ARE信號通路抑制劑(ML385,貨號:HY-100523)購自MCE公司;2%2,3,5氯化三苯基四氮唑(TTC)染色液(貨號R2620)購自北京康瑞納生物公司;蘇木素-伊紅(HE)染色液(貨號DH0006)購自北京雷根生物公司;RIPA蛋白裂解液(貨號BB-3201)購自貝博-Bestbio公司;核蛋白抽提試劑盒(貨號SOS-735)購自北京凱詩源生物公司;二喹啉甲酸(BCA)試劑盒(貨號PC0020)購自上海吉至生化公司;兔抗鼠一抗抗Keap1、抗Nrf2、抗血紅素氧合酶(HO)-1、抗醌氧化還原酶(NQO)1、抗GAPDH、抗組蛋白(Histone)H3購自Abcam公司(貨號分別為ab227828、ab62352、ab68477、ab80588、ab9485、ab1791);羊抗兔二抗(貨號SN134)購自南京生興生物公司;大腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)線栓(貨號M8508)購自長沙邁越生物公司;Axygen凝膠成像系統(tǒng)購自廣州科適特科學(xué)儀器公司;NIKON TS100倒置顯微鏡購自上海輔澤商貿(mào)公司。

1.3實(shí)驗(yàn)分組 將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)(Sham)組、CIRI模型(CIRI)組,低(2.5 mg/kg)、中(5 mg/kg)、高劑量(10 mg/kg)香豆素組〔13〕,ML385組(30 mg/kg)及ML385+高劑量香豆素組(30 mg/kg ML385+10 mg/kg香豆素),各15只。低、中、高劑量香豆素組,ML385組,ML385+高劑量香豆素組均于造模前連續(xù)7 d灌胃給藥,1次/d,Sham組、CIRI組灌胃等量的生理鹽水。

1.4CIRI模型制備 采用線栓法栓塞右側(cè)大腦中動(dòng)脈制備CIRI模型,術(shù)前禁食、水8 h,腹腔注射10%水合氯醛麻醉后進(jìn)行手術(shù)。于頸部正中偏右位置剪開皮膚,暴露分離右側(cè)頸總、頸外、頸內(nèi)動(dòng)脈,用手術(shù)線結(jié)扎頸總、頸外動(dòng)脈的近心端,動(dòng)脈夾夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈。于距頸總動(dòng)脈分叉處約4 mm處剪一切口,從切口處緩慢插入線栓進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈,感到稍微抵觸時(shí)提示線栓前端已阻斷大腦中動(dòng)脈(插入長度18～20 mm),于缺血2 h后緩慢抽出線栓,完成腦缺血2 h、再灌注24 h的CIRI模型。假手術(shù)組不需要插入線栓,其余操作同模型組。于再灌注24 h后檢測相關(guān)指標(biāo)。

1.5Longa5分制法評估大鼠神經(jīng)行為評分 正常爬行為0分;左側(cè)前爪不能完全伸展為1分;向左側(cè)旋轉(zhuǎn)為2分;向左側(cè)傾倒為3分;失去意識、不能行走為4分,評分越高表示神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。重復(fù)評定3次取平均值。

1.6TTC染色測量大鼠腦梗死體積 麻醉后行心臟灌流,斷頭取腦,去除小腦、腦干,于-20 ℃冷凍30 min,連續(xù)切取6片厚度為2 mm的冠狀位切片,加入2%TTC染色液,于37 ℃避光染色15～20 min,磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后拍照、記錄,借助ImageJ軟件對腦梗死體積進(jìn)行分析。每組各5個(gè)樣本。腦梗死體積(%)=(正常側(cè)半腦體積-梗死側(cè)非梗死體積)/正常側(cè)半腦體積×100%〔14〕。

1.7大鼠腦皮質(zhì)取材 剩余大鼠麻醉后行心臟灌流,斷頭取腦,去除小腦、腦干,自額葉前端向后取2～4 mm腦組織,進(jìn)行后續(xù)檢測。每組5個(gè)樣本用于HE染色,5個(gè)樣本用于Western印跡檢測。

1.8HE染色觀察大鼠腦皮質(zhì)組織病理學(xué)變化 4%多聚甲醛固定,石蠟包埋、切片,然后經(jīng)脫蠟、乙醇梯度脫水、HE染色、封片,于顯微鏡下觀察、拍照。

1.9Western印跡檢測大鼠腦皮質(zhì)組織中Keap1/Nrf2/ARE信號通路相關(guān)因子蛋白水平 采用RIPA蛋白裂解液提取總蛋白或采用核蛋白抽提試劑盒提取核蛋白,BCA法檢測蛋白濃度。經(jīng)凝膠電泳分離蛋白、轉(zhuǎn)印、5%脫脂奶粉封閉后,分別加入兔抗鼠一抗抗Keap1、抗Nrf2、抗HO-1、抗NQO1、抗GAPDH、抗Histone H3,4 ℃過夜,加入羊抗兔二抗,室溫孵育1 h,凝膠成像系統(tǒng)檢測蛋白條帶,借助ImageJ軟件對條帶進(jìn)行灰度分析。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS24.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1香豆素對大鼠CIRI 24 h后神經(jīng)行為評分的影響 與Sham組比較,CIRI組神經(jīng)行為評分增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與CIRI組比較,低、中、高劑量香豆素組神經(jīng)行為評分減少,呈劑量依賴性(P<0.05);ML385組神經(jīng)行為評分增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與高劑量香豆素組比較,ML385+高劑量香豆素組神經(jīng)行為評分增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組CIRI 24 h后腦皮質(zhì)組織中Keap1/Nrf2/ARE信號通路相關(guān)因子蛋白水平、神經(jīng)行為評分及腦梗死體積

2.2香豆素對大鼠CIRI 24 h后腦梗死體積的影響 與Sham組比較,CIRI組腦梗死體積增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與CIRI組比較,低、中、高劑量香豆素組腦梗死體積顯著減小,呈劑量依賴性(P<0.05);ML385組腦梗死體積顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與高劑量香豆素組比較,ML385+高劑量香豆素組腦梗死體積增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1、圖1。

1～7:Sham組、CIRI組、低、中、高劑量香豆素組、ML385組、ML385+高劑量香豆素組;圖3同圖1 各組腦組織TTC染色

2.3香豆素對大鼠CIRI 24 h后腦皮質(zhì)組織病理學(xué)的影響 Sham組腦皮質(zhì)組織未見明顯病理學(xué)改變,神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)與結(jié)構(gòu)正常,排列緊密整齊;CIRI組腦皮質(zhì)組織可見明顯病理學(xué)改變,神經(jīng)細(xì)胞排列稀疏紊亂、組織間隙水腫、核皺縮、壞死等,給予不同劑量香豆素預(yù)處理后,神經(jīng)細(xì)胞損傷程度減輕,而給予ML385預(yù)處理后,神經(jīng)細(xì)胞損傷程度加重,見圖2。

圖2 各組腦組織(HE染色,×400)

2.4香豆素對大鼠CIRI 24 h后腦皮質(zhì)組織中Keap1/Nrf2/ARE信號通路相關(guān)因子蛋白水平的影響 與Sham組比較,CIRI組腦皮質(zhì)組織中Keap1蛋白減少,胞核Nrf2/Nrf2及HO-1、NQO1蛋白增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與CIRI組比較,低、中、高劑量香豆素組腦皮質(zhì)組織中Keap1蛋白顯著減少,胞核Nrf2/Nrf2及HO-1、NQO1蛋白顯著增加,呈劑量依賴性(P<0.05);ML385組胞核Nrf2/Nrf2及HO-1、NQO1蛋白減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與高劑量香豆素組比較,ML385+高劑量香豆素組胞核Nrf2/Nrf2及HO-1、NQO1蛋白減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1、圖3。

圖3 Western印跡檢測各組Keap1/Nrf2/ARE信號通路相關(guān)因子蛋白表達(dá)

3 討 論

香豆素是一類具有強(qiáng)抗氧化應(yīng)激活性的天然有機(jī)化合物,廣泛存在于傘形科、菊科、豆科、菌科等多種植物中〔15〕。香豆素可減少CIRI大鼠腦梗死體積,改善其神經(jīng)行為評分,發(fā)揮對CIRI大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用〔16,17〕。本研究結(jié)果表明,CIRI模型造膜成功;香豆素可減輕腦缺血/再灌注引發(fā)的神經(jīng)損傷。

Keap1/Nrf2/ARE是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化信號通路,其中Nrf2是發(fā)揮抗氧化作用的關(guān)鍵因子,在生理?xiàng)l件下,Keap1與Nrf2結(jié)合而使Nrf2活性受到抑制,而在應(yīng)激狀態(tài)下,Keap1與Nrf2結(jié)合能力下降且同時(shí)釋放Nrf2,繼而Nrf2發(fā)生核移位與ARE結(jié)合,激活下游抗氧化調(diào)節(jié)酶HO-1、NQO1,以對抗氧化應(yīng)激,減輕神經(jīng)損傷〔18～20〕。本研究結(jié)果表明,機(jī)體可自發(fā)地激活Keap1/Nrf2/ARE信號通路以誘發(fā)CIRI;香豆素可進(jìn)一步激活Keap1/Nrf2/ARE信號通路以對抗CIRI。

綜上所述,香豆素可減輕腦缺血-再灌注大鼠神經(jīng)損傷,可能通過激活Keap1/Nrf2/ARE信號通路而實(shí)現(xiàn)。