桑通顆粒對肺炎大鼠免疫調節、NF-κB表達水平的影響及肺組織的保護作用

汪海波 王廣偉 朱彥澤 李葉 陳星光

(1石家莊市中醫院,河北 石家莊 050031;2河北省醫用藥品器械集中采購中心)

肺炎是臨床呼吸科治療中常見的肺部疾病之一。目前西醫對于肺炎的治療主要以糖皮質激素及免疫抑制劑等進行干預治療〔1〕。研究發現,肺炎的發生是與自身免疫系統遭到破壞有關,在肺炎治療中進行免疫機制的調節和改善從而控制疾病和減少肺炎的發病次數,成為現階段疾病治療的重點,同時也是提高患者機體抵抗力和肺炎治療的根本環節〔2,3〕。核轉錄因子(NF)-κB信號通路是一種多向性轉錄因子,存在于血管內皮細胞、平滑肌細胞及心肌細胞等多類型細胞核中,在參與調控多種細胞核基因的轉錄中發揮調節細胞活性的作用〔4〕。近年來,中醫藥在肺炎的防治中同樣優勢明顯且療效顯著。桑通顆粒是根據中醫理論和多年臨床觀察,經現代技術工藝研制而成的中藥制劑。該方以桑白皮、炒杏仁、川貝、炙麻黃、葶藶子、炒蘇子、清半夏、黃芩、桃仁、前胡等成分組成,具有清肺化痰、止咳平喘、活血行滯等功效,臨床上可用于治療慢性支氣管炎、慢性阻塞性疾病等〔5〕。本文主要通過探究桑通顆粒對肺炎大鼠免疫調節、NF-κB表達水平的影響及肺組織的保護作用,為臨床桑通顆粒治療相關疾病提供理論基礎與實驗依據。

1 材料與方法

1.1實驗大鼠 雄性SPF級SD大鼠60只,體質量150～220 g,購于南方醫科大學動物學部,許可證號:SCXK(湘)2020-0024。所有大鼠在南方醫院肺病中心實驗室飼養,飼養溫度20～25 ℃,相對濕度40%～60%,該實驗經過動物倫理委員會批準同意。

1.2藥物、試劑與儀器 桑通顆粒(石家莊市中醫院),鹽酸左氧氟沙星注射液(揚子江藥業有限公司),肺炎鏈球菌(天津臨床檢驗中心),無水乙醇(上海羅輔醫藥科技有限公司),NF-κB、磷酸化NF-κB抑制因子蛋白(p-IKBα)、p65抗體(美國Santa Cruz公司),山羊抗鼠IgG二抗(上海雅酶生物醫藥科技有限公司),RIPA裂解液(美國Sigma公司),電泳儀、電泳槽(美國Sigma公司),Western印跡轉膜儀(美國BioRad公司),流式細胞儀(杭州艾森生物有限公司),離心機(上海金鵬分析儀器有限公司),顯微鏡、切片機(上海儀景通光學科技有限公司),一次性無菌注射器(北京賽多斯儀器系統有限公司),戊巴比妥鈉(北京化學試劑公司),高速冷凍離心機(江蘇正大天晴公司)。

1.3模型建立 大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉(2 ml/kg)麻醉,麻醉后固定,進行頸部備皮消毒,切開頸部皮膚,暴露上段氣管,用24G的Y型靜脈留置針經氣管插管,拔出針芯,使導管完全進入氣管,由留置針白色帽端處注入,注入含菌量為400個麥氏濁度單位的細菌混懸液0.35 ml,將固定大鼠的手術臺豎立起來后緩慢注射,每注射0.1 ml后豎立大鼠,左右旋轉大鼠固定臺1 min后再繼續,接種完成后繼續豎立大鼠于固定臺上,使大鼠先后分別保持直立位和倒立位各約2 min,盡量使菌液均勻分布于雙肺各個肺葉,縫合傷口,局部消毒,所有操作在無菌操作下進行。建模后大鼠表現為呼吸急促、乏力氣短、咳嗽等癥狀為建模成功。

1.4分組與給藥 將大鼠分正常(A)組、模型(B)組、桑通顆粒低濃度(C)組、桑通顆粒中濃度(D)組、桑通顆粒高濃度(E)組、西藥(F)組,10只/組。建模后,A、B組采用每日0.2 ml/10 g生理鹽水灌胃,C、D、E組每日分別灌胃5、10、20 g/kg桑通顆粒,F組給予20 mg/kg每日1次左氧氟沙星灌胃,均連續干預30 d。

1.5酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測白細胞介素(IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α 抽取大鼠尾部靜脈血3 ml,3 000 r/min離心10 min,留取上清液,實驗步驟嚴格參考試劑盒說明書。

1.6流式細胞儀檢測外周血CD4+、CD8+表達 取培養后全血50 μl,分別加入10 μl CD4+、CD8+抗體,于4 ℃避光孵育30 min,加氯化銨(NH4Cl)溶血劑2 ml,1 000 r/min離心15 min,棄上清,按試劑盒說明書方法采用膜聯蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素(Annexin Ⅴ-FITC)結合液及 AnnexinV-FIRC處理細胞,室溫下避光孵育15 min,再加入碘化丙啶染色液,避光冰浴10 min,流式儀上機 CD4+、CD8+表達。

1.7蘇木素-伊紅(HE)染色 將大鼠麻醉后經斷頭法處死,后切開大鼠腹部,在肺部最大葉距邊緣5 mm處取直徑5 mm、厚1 mm肺組織,多聚甲醛固定,石蠟包埋,4 μm切片,染色并觀察。

1.8Western印跡檢測NF-κB、p-IKBα、p65蛋白表達 取肺組織RIPA裂解液提取總蛋白二喹啉甲酸(BCA)法測蛋白濃度、凝膠電泳后轉移聚偏氟乙烯(PVDF)膜、封閉過夜,加兔多克隆抗體NF-κB(1∶500)、p-IKBα(1∶500)、p65(1∶1 000)、β-actin(1∶2 000)孵育后,洗滌,室溫孵育,洗滌后浸入電化學發光(ECL)工作液,X線片曝光、顯影后獲取圖像。

1.9聚合酶鏈反應(PCR)檢測NF-κB、p-IKBα、p65 mRNA表達 取肺組織0.2 g勻漿研磨后提取總RNA,依據試劑盒說明逆轉錄PCR,反應體系20 μl,反應條件:80 ℃變性5 min,60 ℃退火5 min,70 ℃延伸15 min,共35個循環,根據2-ΔΔCt值計算相對表達。引物序列:NF-κB正向:5′-GCAGAGGATTACGAGCAGAT-3′,反向:5′-CCTGGTAGGTTACTC TGTTG-3′;p-IKBα正向:5′-TCCAGGATGTTTCGAGCAATC-3′,反向:5′-TCCAATGGAAGCAGCGGCATC-3′;p65正向:5′-AGGATGCAGTACAGATGAGC-3′,反向:5′-AGGTTACCTGGTCTTGTCTG-3′;β-actin正向:5′-AAACCTCTTAACGATCCATG-3′,反向:5′-CACAA TGCTTGAAGGAGATGG-3′。

1.10統計學方法 采用GraphPad Prism8.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1各組血清中IL-1β、IL-6、TNF-α表達 與A組比較,B組血清中IL-1β、IL-6、TNF-α顯著升高(P<0.05);與B組比較,D組以上血清指標顯著降低(P<0.05);與D組比較,E組以上血清指標顯著降低(P<0.05);與E組比較,F組以上血清指標顯著升高(P<0.05);B組與C組、D組與F組以上血清指標均無統計學差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組血清中IL-1β、IL-6、TNF-α及外周血中CD4+、CD8+表達

2.2各組外周血中CD4+、CD8+表達 與A組比較,B組外周血中CD4+表達顯著降低、CD8+表達顯著升高(P<0.05);與B組比較,D組外周血中CD4+表達顯著升高、CD8+表達顯著降低(P<0.05);與D組比較,E組外周血中CD4+表達顯著升高、CD8+表達顯著降低(P<0.05);與E組比較,F組外周血中CD4+表達顯著降低、CD8+表達顯著升高(P<0.05),其中B組與C組,D組與F組以上指標比較無顯著差異(P>0.05)。見表1、圖1。

圖1 各組CD4+、CD8+表達

2.3HE 染色 A組肺組織結構完好且無損傷現象;B組及C組間質水腫、充血,炎癥細胞浸潤和成纖維細胞間質嚴重;D組及F組肺腔內伴隨少量炎性分泌物,支氣管壁平滑肌與上皮細胞伴隨增生現象;E組腔內分泌物明顯減少,水腫現象改善,管壁平滑肌及上皮細胞增生改善,管周及肺泡壁有極少炎性細胞浸潤。見圖2。

圖2 各組肺組織(HE 染色,×200)

2.4各組肺組織中NF-κB、p-IKBα、p65 mRNA及蛋白表達比較 與A組比較,B組NF-κB、p-IKBα、p65 mRNA及蛋白表達顯著升高(P<0.05);與B組比較,D組以上指標顯著降低(P<0.05);與D組比較,E組以上指標顯著降低(P<0.05);與E組比較,F組以上指標顯著升高(P<0.05);B組與C組,D組與F組以上指標無統計學差異(P>0.05)。見表2、圖3。

圖3 Western印跡檢測各組NF-κB、p-IκBα、p65 蛋白表達

表2 各組肺組織中NF-κB、p-IKBα、p65 mRNA及蛋白表達

3 討 論

近年來隨著工業化速度加快、環境污染顯著,致使全球肺炎的發病率呈逐年上升的趨勢,現階段對于肺炎的控制已成為全世界廣泛關注的問題〔6〕。因此,研究肺炎的流行病學特征及相關治療因素對提高肺炎的預防與治療具有重要意義。免疫學研究表示,肺炎患者的白細胞、血小板等免疫細胞均會出現不同程度的降低,且免疫缺陷與炎性細胞的發展及治療存在密切聯系〔7〕。而具有清熱祛痰、鎮咳平喘功效的桑通顆粒可廣泛應用于急、慢性肺內感染等疾病中〔8〕。有研究發現,桑通顆粒對肺損傷疾病的治療具有一定療效〔9〕。

肺疾病發生時由于免疫機制遭到破壞,體內炎性因子的表達也相繼產生異常,其中,IL-1β、IL-6、TNF-α等作為炎癥細胞因子可有效參與細胞免疫過程,在肺炎的免疫病理過程中具有重要作用〔10〕。本研究結果表明,桑通顆粒可能對降低肺炎大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α表達具有一定效果。相關研究表示,肺炎發生時,機體內相關炎性因子的表達升高可促進炎性細胞發生活化,炎性因子可加快炎癥細胞募集,使炎癥細胞的吞噬作用增強,導致黏膜血管通透性增加,滲出、水腫產生,進而加重肺組織炎癥反應〔11〕。藥理學研究發現,桑通顆粒中桑白皮、黃芩等成分可發揮消炎、解毒、抑菌及降解細菌內毒素等作用〔12〕。桑通顆粒可通過抑制炎癥在肺組織的遞呈功能,直接殺傷病原體或被感染的細胞,通過分泌γ-干擾素(IFN-γ)調節機體細胞,降低IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性因子的合成和分泌,有效改善大鼠肺部微環境和肺部病理。

肺組織是機體合成免疫效應分子的主要部位之一,且免疫合成的過程與外周血CD4+、CD8+密切相關〔13〕。本研究結果表明,桑通顆粒可通過改善肺炎大鼠外周血CD4+、CD8+表達而提高免疫功能。相關研究表示,肺炎發生時可使外周血CD4+被抑制和CD8+被激活,活化的CD8+發生核易位,可直接激活目的基因表達進而發揮促炎作用〔14〕。王靖〔15〕在益氣解表方治療小兒乙型流感的療效觀察及預后分析中表示,方中前胡對于收縮的支氣管平滑肌有舒張作用,而杏仁成分具有鎮咳及抗菌、抗病毒等功效。由此本文推測,桑通顆粒可能通過前胡、杏仁等多種中藥成分識別不同特異性抗原受體表位而使B淋巴細胞激活,參與機體的非特異性免疫,使其誘導的壞死因子形成功能下降,并通過刺激免疫造血功能,進而發揮抑制機體特異性免疫和增強機體固有免疫、體液抗菌的作用。

NF-κB在肺炎中對細胞核轉移及炎癥基因啟動具有重要意義〔16〕。本研究結果表明,桑通顆粒可能對抑制肺炎大鼠肺組織中NF-κB、p-IKBα、p65表達具有積極作用。相關研究表示,肺炎發生時NF-κB通過促進趨化因子使凋亡執行蛋白激活并抑制抗炎癥免疫,使其無法發揮抗炎作用,進而引起肺組織細胞內損傷并加速肺炎疾病的進程〔17〕。桑通顆粒中的桃仁具有抗炎、解熱、平喘祛瘀等功效,而半夏則具有降低呼吸中樞興奮、抑制咳嗽反射等作用〔18,19〕。本文推測,肺炎中桑通顆粒可能通過多種成分相互作用起到抑制細胞分泌炎性因子,阻斷肺部特異位點上的酪氨酸,并通過抑制下游激酶的活化效應,降低NF-κB、p-IKBα、p65在肺中的遞呈功能,抑制炎性因子的合成和分泌,進而起到降低肺部炎性反應和降低肺炎造成的肺損傷的作用。

綜上所述,桑通顆粒對降低肺炎大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α,增加CD8+、降低CD4+及抑制NF-κB、p-IKBα、p65表達等方面具有一定作用,但現階段對于桑通顆粒是通過何種方式影響調控肺炎疾病進展及在肺炎治療中的具體機制仍需探究。