可溶性環氧化物水解酶抑制劑TPPU改善阿爾茨海默病的作用和機制

陳慶狀 高峰 關燕菲 胡瑩瑩 陳春玲 樊鐵滸 肖曉丹

(1廣東醫科大學,廣東 東莞 523000;2廣州市中西醫結合醫院)

阿爾茨海默病(AD)是臨床上最常見的神經系統疾病之一,其發病機制是由衰老所引起的神經退行性疾病,主要的病理表現為大腦內老年斑塊的形成,其形成機制包括β淀粉樣蛋白(Aβ)在大腦中的大量沉積及Tau蛋白磷酸化失調引起神經纖維纏結,進而導致大量神經元細胞凋亡,并伴有神經炎癥和膠質細胞增生,并最終導致AD的發生及進展〔1〕,AD在中國乃至世界范圍內的發病率均呈快速增長的趨勢,給全社會造成沉重的家庭及經濟負擔〔2〕。

小膠質細胞介導的炎癥反應是AD的重要發病機制,但機制尚未明確。探尋減少由小膠質細胞炎癥帶來的神經損傷、促進中樞神經系統微環境結構和信號重塑的方法,被視為一個潛在的發展方向。可溶性環氧化物水解酶(sEH)在神經炎癥中發揮重要作用。sEH不僅是十二碳四烯酸(ARA)代謝產物環氧四烯酸(EETs)的關鍵水解酶,還能進一步水解EETs形成低活性的二羥基二十碳三烯酸(DHETs)。EETs具有4個異構體,即5,6-EET、8,9-EET、11,12-EET和14、15-EET。研究顯示,通過抑制sEH對EETs的水解可以減少AD模型中小膠質細胞的激活,降低炎癥因子的釋放,促進Aβ的清除,但其具體機制不明〔3〕。三氟甲氧基苯基-3-(1-丙酰基哌啶-4-基)脲(TPPU)作為一種新型的sEH抑制劑,具有良好的穩定性及生物學特性。TPPU能夠高效率的透過血腦屏障,并在中樞神經系統中抑制sEH的過度表達,從而增加中樞神經系統中的EETs水平,以持續有效的發揮生物學效應〔4〕,本研究利用5xFAD模型小鼠模擬臨床的AD癥狀,研究TPPU改善AD病理癥狀的病理生理機制。

1 材料與方法

1.1主要實驗材料 TPPU(美國GlpBio公司),兔抗Iba1單克隆抗體(日本Wako公司),鼠抗6E10單克隆抗體、兔抗Toll樣受體(TLR)2抗體、羊抗兔-IgG(美國COVANCE公司),鼠抗細胞外調節蛋白激酶(ERK)1/2抗體、羊抗兔-IgG(美國Cell Signaling公司)。二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒、Alexa Fluor 488-羊抗鼠/兔IgG、Alexa Fluor 596-羊抗鼠IgG(美國Thermo Scientific公司),蛋白酶抑制劑coccktail(瑞士Roche公司),兔抗磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體(美國Millipore公司)。冰凍切片機(CM1900型,德國,LEICA公司),激光共聚焦顯微鏡(Nikon A1R型,日本,Nikon),超高效液相色譜系統、質譜儀(UltiMate3000型、TSQ Quantive型,美國,Thermo Scientific),全自動化學發光系統(Tanon 5200型,中國)。

1.2動物模型及分組 AD模型小鼠是5xFAD(編號Tg6799)轉基因小鼠(C57/B6XSJL背景),WT小鼠(C57/B6XSJL背景)從江蘇華創信諾醫藥科技有限公司購買。將6月齡的雄性實驗小鼠隨機分為3組:5xFAD溶劑組(40%PEG-400),5xFAD-TPPU干預組(TPPU 1.5 mg/kg體質量)及WT溶劑組。每日同一時間點根據小鼠體質量進行腹腔內注射,連續給予8 w后,再處死取腦組織用于后續試驗。

1.3免疫熒光染色 參考已有文獻方法〔5〕。首先,給小鼠腹腔注射10%水合氯醛進行深度麻醉,之后經過0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)灌流。灌流結束后對小鼠進行解剖,并小心將小鼠腦組織取出,然后將腦組織放置于4%多聚甲醛中固定,時間為4～6 h。隨后使用PBS進行沖洗,最后將沖洗后的腦組織放置于30%蔗糖溶液中進行浸泡以達到脫水的目的。脫水結束后進行冰凍切片,分別切取含運動皮層和海馬冠狀腦片,厚度約為40 μm。切除完成后,首先將切片使用超純水漂洗30 min,后用0.1 mol/L PBS進行漂洗,后用含0.3% triton X-100的山羊血清在室溫狀態下進行封閉2 h,然后用一抗孵育過夜(4 ℃),接著用0.1 mol/L PBS漂洗35 min,再用二抗避光常溫孵育2 h。最后,腦片采用含4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的封固劑進行封片。免疫熒光成像采用共聚焦顯微鏡,Aβ斑塊數量統計采用ImageJ分析軟件(US National Institues of Health)。細胞胞體大小采用軟件Imaris分析,陽性細胞數量統計采用ImageJ分析軟件。

1.4Western印跡檢測 同樣在小鼠麻醉后使用PBS溶液灌流。灌流完成后通過解剖分離出鼠腦組織并對腦組織稱重后,放置于勻漿器中,加入含1%苯甲基磺氟(PMSF)和cocktail 的RIPA裂解液進行碾磨,待充分勻漿后置于4 ℃環境進行裂解。隨后使用BCA試劑盒進行蛋白定量,根據蛋白濃度加入RIPA并將蛋白濃度調整為20 μg/μl。后續按每孔40 μg總蛋白進行電泳。使用全自動化學發光系統對Western印跡條帶進行顯色并使用ImageJ軟件統計灰度值。以目的蛋白灰度值/內參蛋白灰度值作為所測蛋白的相對表達量。目的蛋白使用抗體如下:TLR2(1∶1 000),ERK1/2(1∶1 000),GAPDH(1∶5 000)。

1.5EETs測定 參考已有文獻方法〔6〕。取腦組織稱重,按10 μl/mg比例加入PBS(pH7.4),用勻質儀充分勻漿(Bertin Precellys 24-Dual,6 500 r/min,1 min),取均漿液到1.5 ml進口離心管中,加入sEH抑制劑(4 μl/100 μl),待前處理。取腦組織樣品勻漿液,加入等量終濃度為20 ng/ml的內標液(甲醇∶乙腈∶乙酸=50∶50∶0.02%,V/V/V),渦旋震蕩10 min,4 ℃ 5 000 r/min離心1 min,置于-20 ℃冰箱1.5 h沉淀蛋白,再于4 ℃ 14 000 r/min離心10 min,取上清200 μl放入進樣小瓶中待測。腦組織樣本EETs含量的測定采用超高效液相色譜-串聯質譜法(UPLC-MS/MS)的方法進行分析。UPLC-MS/MS系統包括含線上處理的超高效液相色譜系統和質譜儀。色譜條件:流動相包含(A)0.02%乙酸水,(B)乙腈,(C)乙腈:異丙醇(50/50,V/V),每次進樣量為20 μl,自動進樣盤溫度設為4 ℃,色譜柱溫度設定為40 ℃。每個樣品的總體分析時長為10 min。

1.6Y-迷宮實驗 參考已有文獻方法〔3〕。檢測前打掃盒子并用酒精擦拭,待酒精氣味散去后,將小鼠放置在Y迷宮的中立區,記錄5 min內小鼠進入長臂的次序,計算交替行為,交替行為被定義為連續進入所有3只長臂而沒有重復,并且用占進入總次數的百分比表示,5 min后將小鼠拿出,打掃干凈盒子,并用酒精擦拭,待酒精味散去后,繼續檢測。

1.7逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR) 使用Trizol(美國Invitrogen公司)從鼠腦的中腦、海馬組織勻漿中提取RNA。用分光光度法定量總RNA,并使用PrimeScriptTMⅡ(日本TaKaRa公司)試劑盒逆轉錄成互補DNA。隨后使用PrimeSTAR HS DNA聚合酶(日本TaKaRa公司)對等量的cDNA進行PCR分析:50 μl的EP管中加入1 μl逆轉錄產物(含100 ng總RNA),14.5 μl Master Mix,擴張條件如下:95 ℃加熱10 min;98 ℃加熱10 s,30個循環;55 ℃加熱5 s;72 ℃加熱10 s。

1.8統計學處理 應用SPSS20.0軟件進行單因素方差分析及SNK兩兩檢驗。

2 結 果

2.1TPPU改善AD模型小鼠的病理癥狀 免疫熒光結果顯示,與5xFAD溶劑組相比,5xFAD-TPPU干預組腦組織內海馬和皮層斑塊面積及數量顯著減少(均P<0.001)。通過Y迷宮實驗檢測3組連續5 d的交替行為,結果顯示,與5xFAD溶劑組相比,5xFAD-TPPU干預組正確率明顯提高(P<0.01),3組進入長臂的總次數無顯著性差異(均P>0.05),見表1、表2和圖1。

圖1 TPPU治療后兩組不同腦區Aβ(免疫熒光染色,×40)

表1 各組TPPU治療后不同腦區淀粉樣斑塊面積百分比及IL-6、IL-β和TNF-α mRNA比較

表2 各組Y迷宮實驗結果、小膠質細胞數量、胞體大小及TLR2、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白水平比較

2.2TPPU提高AD模型小鼠體內EETs含量 通過UPLC-MS/MS技術檢測發現,與5xFAD溶劑組比較,5xFAD-TPPU干預組皮層、血漿和海馬中的EETs 水平顯著增加(均P<0.05),而皮層中5,6-EET和8,9-EET有增加趨勢,但無顯著性差異(P>0.05)。見表3。

表3 兩組血漿、海馬和皮層EETs含量比較

2.3TPPU抑制AD模型小鼠小膠質細胞的活化和炎癥因子的釋放 免疫熒光結果顯示,6月齡AD模型小鼠腦組織皮層區域的Iba1(小膠質細胞的特異性標志物)陽性細胞增多,表明小膠質細胞活化增多,胞體肥厚,細胞數目增多。與5xFAD溶劑組比較,給予TPPU干預治療后,Iba1陽性細胞數明顯減少(P<0.001),而胞體體積無明顯變化(P>0.05)。與5xFAD溶劑組相比,5xFAD-TPPU干預組IL-6、IL-1β及TNF-α mRNA水平有不同程度的降低,差異有統計學意義(均P<0.05),見表1、表2、圖2。

圖2 TPPU治療后3組小膠質細胞形態和數量(免疫熒光染色,×400)

2.4TPPU通過TLR2信號通路抑制小膠質細胞的過度激活 與WT溶劑組相比,5xFAD溶劑組TLR2水平及ERK1/2磷酸化水平明顯增高(P<0.001,P<0.01),但兩組總體ERK1/2水平無顯著變化(P>0.05)。與5xFAD溶劑組比較,5xFAD-TPPU干預組TLR2及磷酸化ERK1/2水平均顯著降低(P<0.001,P<0.05)。表明使用TPPU治療可能通過減少ERK1/2磷酸化來降低TLR2表達,從而發揮抑制小膠質細胞過度激活的作用,見表2、圖3。

圖3 Westen印跡檢測3組TLR2、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白水平

3 討 論

AD發病率呈逐年上升的趨勢,但其機制尚不明確,臨床上亦缺乏早期的診斷和治療。在臨床治療中,美國食品藥品監督管理局(FDA)共批準了包括卡巴拉汀、加蘭他敏、多奈哌齊、美金剛、美金剛聯合多奈哌齊和他克林在內的6種治療藥物來治療AD,然而這些已批準的藥物均只暫時增加大腦中樞神經遞質來改善癥狀,不能減輕AD的病理變化,也不能逆轉或減緩疾病進程〔7,8〕。因此,深入研究AD發病的病理生理學及信號分子傳導機制,并挖掘新的致病或干預靶點,對AD的早期診斷和針對性干預有重要的臨床意義。

EETs可通過自分泌或者旁分泌的形式,在體內發揮抗炎及抑制細胞增殖等多種生物學效應〔9～11〕。然而,生物體內EET的穩定性較差,容易被sEH迅速水解為DHETs,一定程度上限制了外源性EET的應用。sEH是EETs水解的關鍵酶,使用sEH抑制劑TPPU可以有效增加體內EET水平,從而增強EETs的功能。本研究發現,TPPU干預后可抑制小膠質細胞的活化和炎癥因子的釋放,減少炎癥帶來的神經損傷,最終改善空間學習和認知功能。EETs能抑制中樞神經系統的一系列神經炎癥反應,然而,該過程涉及的信號通路和發生發展機制尚在研究中。既往研究表明EETs信號系統與TLR2信號通路息息相關〔12〕。此外還有研究指出TLR2信號通路涉及的ERK1/2參與了巨噬細胞的激活〔13〕。本研究也得到相似結論,但是對于ERK1/2和TLR2信號通路之間的相互作用機制,還需要更深入的研究,為AD治療提供新思路。