miR-182調控線粒體凋亡通路對冠心病模型大鼠心肌組織細胞凋亡的影響

陶曉芳 王雅潔 王文斌 費年華

(咸寧市中心醫院 1老年病科,湖北 咸寧 437000;2甲狀腺乳腺外科)

冠心病(CHD)是冠狀動脈管腔狹窄或閉塞所導致的心臟病〔1,2〕。CHD患者的臨床表現主要有心絞痛、心肌梗死、心悸,嚴重者引發猝死〔3〕。線粒體和死亡受體是CHD發病過程中細胞凋亡的兩條主要途徑。線粒體是一種由兩層膜包被的細胞器,也是細胞中制造能量的場所〔4〕。微小RNA(miR)-182可通過調節不同的靶mRNA對機體的生長、發育、分化發揮重要的調控作用〔5,6〕。相關研究表明miR-182高表達會造成心肌細胞損傷,可能參與CHD的發生發展,但具體的生物學功能和機制尚不清楚。基于此,本文旨在探究miR-182調控線粒體凋亡通路對CHD模型大鼠心肌組織細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1材料 選取健康SD成年大鼠30只,鼠齡8～10 w,體質量(200±20)g,由中國醫科大學實驗動物中心提供,動物倫理委員會批準文號:WYZLL〔2016〕1601。適應性喂養1～2 w。其中15為構建CHD大鼠模型:于術前給予大鼠禁食處理6 h,麻醉后置于無菌操作臺固定,先進行心電圖監測,等氣管插管后,帶上動物呼吸機。打開胸腔后剪開心包,暴露心臟,在心臟左心室下方結扎冠狀動脈左前降支,在結扎線、冠狀動脈之間放置一根直徑2 mm的塑料管,形成急性心肌缺血模型。剩余15只為假手術組僅切皮。觀察心電圖,以ST段弓背向上抬高為模型制備成功。建模成功后等待6 h后再處理。

1.2組織樣本收集 大鼠麻醉后,固定于操作臺,剪開胸壁,暴露心臟,模型組沿左心室長軸剪下左心室梗死區,對照組取相同位置的心臟組織,用預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2次,4%多聚甲醛中固定,待檢。

1.3心肌組織細胞獲取和培養方法 模型組大鼠心臟組織應用Ⅱ型膠原酶和0.08%的中性蛋白酶進行消化后,置于1%青鏈霉素和10%胎牛血清(FBS)的培養液中,在37 ℃、5%CO2細胞培養箱中進行培養2 h,更換培養液,吸取未貼壁細胞接種到6孔板中,按上述條件繼續培養。每天觀察細胞生長情況,每3 d更換1次培養液。待細胞增殖至80%時按上述操作進行傳代。應用3代細胞進行實驗。

1.4細胞增殖 將1.3中培養好的細胞按5×105個每孔接種于6孔板中,生長至75%融合開始脫氧。每孔加入100 μl新培養基,再分別加入10 μl四唑氮化合物(MTS),混勻后37 ℃培養箱中孵育3 h,鏡下觀察細胞生長形態并記錄。誘導1、3、6 h,進行相應檢測。將培養好的細胞分成3組,每組8孔,對照組不作處理,其余兩組轉染細胞,分別用miR-182抑制劑和miR-182-Apmimic進行轉染作為下調miR-182組和上調miR-182組。轉染步驟按照說明書嚴格進行操作。

1.5引物序列 采用RT-PCR技術檢測3組細胞miR-182、B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bax)表達,采用Trizol法提取各組細胞總RNA,20 μl反應體系下將RNA逆轉錄為cDNA。引物序列(5′-3′):miR-182正向:ACTTTTGGCAATGGTAGAACTCAC,反向:AATCCATGAGAGA TCCCTAGCG;Bcl-2正向:GTGGAGGAGCTCTTCA GGGA,反向:AGGCACCCAGGGTGATGCAA;Bax正向:GGCC-CACCAGCTCTGAGCAGA,反向:GCCACG TGGGGGTCCCAAAGT;GAPDH正向:CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA,反向:TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCAC。95 ℃預反應10 min后,95 ℃變性7 s,60 ℃退火20 s,72 ℃延伸38 s,40個循環后,檢測各指標相對表達。

1.6細胞凋亡 于4%多聚甲醛溶液中固定心肌組織,石蠟包埋,切成5 μm厚的切片,應用一站式生物素檢測原位缺口末端標記法(TUNEL)試劑盒〔二氨基聯苯胺(DAB)法〕檢測心肌細胞凋亡情況,試劑盒由上海聯邁生物工程有限公司提供。于光鏡下觀察,并使用圖像分析系統進行分析,計算細胞凋亡率。

1.7心肌組織miR-182、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平檢測 采用免疫組化法檢測心肌組織miR-182、GSH-PX、SOD、MDA水平。將心肌組織切片脫蠟后用梯度乙醇水化,修復抗原,加入5%山羊血清封閉靜置30 min,滴加一抗,4 ℃孵育過夜,PBS洗滌3次后滴加稀釋的二抗,37 ℃孵育30 min,DAB顯色,脫水,透明,中性樹膠封片。分析檢測結果。

1.8Western印跡檢測 采用Western印跡法測定蛋白Bcl-2、Bax表達水平,蛋白定量后進行凝膠電泳,轉膜,和封閉。滴加一抗,4 ℃孵育過夜,三乙醇胺緩沖鹽水溶液(TBST)清洗3次,滴加二抗,室溫孵育1 h,試劑盒均由博輝生物科技(廣州)有限公司提供。掃描膠片,應用凝膠成像系統掃描,以Bcl-2、Bax蛋白灰度值與β-actin灰度值之比計算。

1.9統計學處理 采用SPSS19.0軟件進行重讀測量方差分析、獨立樣本t檢驗、χ2檢驗。

2 結 果

2.13組miR-182表達比較 如表1所示,誘導1、3、6 h與對照組相比,下調miR-182組miR-182表達水平較低,上調miR-182組miR-182表達水平較高,差異有統計學意義(P<0.05);與下調miR-182組相比,上調miR-182組miR-182表達水平較高,差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 3組誘導不同時間miR-182表達、心肌細胞增殖密度值、足細胞凋亡率比較

2.23組心肌細胞增殖密度值比較 如表1所示,誘導1、3、6 h與對照組相比,下調miR-182組細胞吸光密度值較低,上調miR-182組細胞吸光密度值較高,差異有統計學意義(P<0.05);與下調miR-182組相比,上調miR-182組細胞吸光密度值較高,差異有統計學意義(P<0.05)。

2.33組心肌細胞凋亡率比較 如表1所示,誘導1、3、6 h與對照組相比,下調miR-182組細胞凋亡率較低,上調miR-182組細胞凋亡率較高,差異有統計學意義(P<0.05);與下調miR-182組相比,上調miR-182組細胞凋亡率較高,差異有統計學意義(P<0.05)。

2.4miR-182對3組線粒體GSH-PX、SOD、MDA的影響 如表2所示,誘導1、3、6 h與對照組相比,下調miR-182組GSH-PX、SOD表達水平較高,MDA表達水平較低,上調miR-182組GSH-PX、SOD表達水平較低,MDA表達水平較高,差異有統計學意義(P<0.05);與下調miR-182組相比,上調miR-182組GSH-PX、SOD表達水平較低,MDA表達水平較高,差異有統計學意義(P<0.05)。

表2 誘導不同時間miR-182對3組線粒體GSH-PX、SOD、MDA的影響

2.53組細胞WT1信號通路蛋白相對表達量比較 如表3所示,誘導1、3、6 h與對照組相比,下調miR-182組Bcl-2表達水平均較高,Bax表達水平較低,上調miR-182組Bcl-2表達水平均較低,Bax表達水平較高,差異有統計學意義(P<0.05);與下調miR-182組相比,上調miR-182組Bcl-2表達水平較低,Bax表達水平較高,差異有統計學意義(P<0.05)。

表3 3組誘導不同時間細胞線粒體凋亡信號通路蛋白相對表達量比較

3 討 論

心肌細胞又稱心肌纖維是有橫紋的短柱狀細胞〔7〕。心肌細胞是心肌組織的主體部分,心臟的動力功能主要依靠心肌細胞完成〔8〕。缺血缺氧時,心肌組織灌注不足,在心肌缺血或梗死時,將出現心肌細胞凋亡的情況〔9〕。

心臟是一種動力器官,其功能受線粒體提供的能量調控,心肌細胞內線粒體含量豐富,可為心肌提供絕大部分的能量〔10〕。線粒體也是能量代謝、活性氧生成和細胞凋亡等關鍵細胞通路的交叉點,起著至關重要的作用〔11〕。相關研究表明,CHD后某些微小RNA(miRNA)表達失調,可能會有助于減少心肌組織損傷、抑制細胞凋亡,有助于改善CHD患者預后〔12〕。miR-182定位于人的7號染色體,與miR-96、miR-183形成了一個基因簇〔13,14〕。有相關研究證實,在大鼠缺血再灌注模型中miR-182表達下調,并通過下調Bcl2/E1B-19kDa相互作用蛋白(BNIP)3來抑制心肌細胞凋亡〔15〕。本研究結果說明,miR-182能引起心肌細胞損傷和功能惡化,可能參與CHD的發生發展。

GSH-PX是體內重要的催化酶,可以催化過氧化氫分解,從而使細胞膜結構和功能得到完整保護〔16〕。SOD是體內重要的抗氧化酶,反映氧自由基損傷的敏感指標〔17〕。MDA是一種有機化合物,會對線粒體呼吸鏈及各種酶造成不同程度的損傷,是反映膜脂過氧化的敏感性指標〔18〕。Bcl-2通過調控凋亡的線粒體通路,改變線粒體膜的通透性,阻止線粒體內的凋亡分子細胞色素的釋放,抑制凋亡效應caspase的活性〔19〕。Bax在發揮自身促凋亡作用的同時使線粒體膜通透性改變,釋放能進入胞質的細胞色素,進而激活線粒體通路。Bax還能下調Bcl-2表達,降低其抑制作用〔20〕。本研究結果說明,miR-182低表達影響著Bcl-2、Bax表達水平,三者水平升高是心肌細胞凋亡的重要原因之一。

綜上所述,miR-182過表達靶向作用于線粒體凋亡通路Bcl-2、Bax,使CHD模型大鼠心肌組織細胞凋亡。