金銀花香豆酸3-羥化酶基因LjC3H2 的生物信息學分析

馮唐鍇 雷 群 羅麗萍 藍 玉

（1景德鎮學院生物與環境工程學院，江西景德鎮 333499；2景德鎮市第十二小學，江西景德鎮 333000）

金銀花在抗菌消炎和對抗病毒性疾病方面有一定作用，常用于中藥方劑中。綠原酸（Chlorogenic acid，CGA）是金銀花重要的藥用成分之一，具有多種藥用功效[1]。植物綠原酸合成途徑有3 條：一是咖啡酰輔酶A 和奎寧酸由羥基化肉桂酸輔酶A或奎寧酸肉桂酸羥基化轉移酶催化生成綠原酸；二是在羥基肉桂酰基轉移酶等作用下生成p-香豆酰奎寧酸，再由p-香豆酸3-羥化酶（p-coumarate3-hydroxylase，C3H）羥基化生成綠原酸；三是咖啡酰葡萄糖苷作為中間產物，和奎寧酸在羥基化肉桂酰D-葡萄糖、奎寧酸羥基化肉桂酰轉移酶催化作用下生成綠原酸。C3H 是綠原酸合成代謝過程中的關鍵酶，該酶催化咖啡酸的生物合成，這個過程是合成綠原酸的重要步驟。C3H 屬于細胞色素P450家族，與各類植物的CYP450 98A 亞家族蛋白具有高度同源性。在植物苯丙素代謝中能催化苯環C3位置的羥基化反應，是綠原酸生物合成的關鍵酶之一。金銀花基因組中有兩個C3H拷貝，2013年第一個C3H 基因拷貝（LjC3H）被克隆，亓希武等[2]對另外一個C3H 基因拷貝（LjC3H2）進行了研究。其他植物C3H 也有相關研究，王漫青等[3]的研究表明，當歸C3H 基因開放閱讀框長1 530 bp，編碼509 個氨基酸。周美娟等[4]克隆了慈竹C3H 基因并進行了分析。李高等[5]的研究表明檸條錦雞兒C3H 與擬南芥C3H 具有部分相同的功能。本文從各類數據庫收集了37 種植物40 個C3H 蛋白序列，利用多種生物信息學分析工具，以LjC3H2為研究對象，對該基因表達酶的結構、功能和分類等特點進行了進一步的分析研究。

1 材料與方法

1.1 數據材料

LjC3HL2酶蛋白在NCBI 蛋白質數據庫中的序號為ART33341.1。以該蛋白氨基酸序列為樣本進行Blast 比對，在NCBI 蛋白質數據庫找到37 種植物40個C3H蛋白氨基酸序列，用來對LjC3H2進行分子進化分析。相關植物蛋白序列號如下：金銀花（ART33341.1、AGQ48118）、桔梗（AEM63674.1）、夏威夷金合歡（AOX49220.1）、西樺（QGX89943.1）、擰條錦雞兒（AEV93473.1）、薊（QQH14908.1）、矮牽牛（AVA30528.1）、毛白楊（AFZ78540.1、APR63682.1）、中粒咖啡（ABB83677.1）、苦蕎麥（AHA14499.1）、芝麻（AAL47545.1）、黃水仙（AUG71937.1）、藍星睡蓮（XP_031473498.1）、鮑氏文殊蘭（WGU11329.1）、粗壯女貞（WEX29781.1）、紅花釣鐘柳（WEX29779.1）、沙蓬（WBR79877.1）、茄子（UXQ89629.1）、蓖麻（XP_002511566.3）、圓葉黃山藥（XP_039114632.1）、龍葵（QIC52992.1）、缸豆（QCD97092.1）、桃兒七（AIA24412.1） 、水 仙（AGI97941.1） 、 慈 竹（AFD29885.1）、杉木（AFX98060.1）、火炬松（AAL47685.1）、歐洲云杉（CAK22403.1）、地黃（QJS39421.1）、箭葉淫羊藿（AIS92508.1）、陸地棉（ALH21661.1）、南非醉茄（ADM47799.1）、大麻槿（AGA60530.1）、藥蜀葵（UOI87846.1）、巨芒草（ANB43566.1、ANB43567.1）、黃芩（BAJ09387.1）和辣椒（ACF17644.1）。這40 個植物C3H 蛋白中，除了沙蓬和歐洲云杉的酶蛋白序列不夠完整以外，其他植物的酶蛋白氨基酸數都在510 左右，最少的為503（杉木），最多的為517（西樺、矮牽牛和茄子）。

1.2 生物信息學工具和分析方法

使用的生物信息學工具包括各類在線數據庫、在線數據分析網站以及離線分析軟件，具體名稱、網址及功能如表1所示。

表1 使用的生物信息學分析軟件和在線程序

美國國家生物信息中心（NCBI）可用于獲得、提交和分析各類生物信息數據。BLAST是其中的一個分析工具，可對不同氨基酸或核酸序列進行同源比較。DNAMAN 是一款高度集成化的序列分析軟件，本文利用該軟件進行金銀花C3H蛋白的輔助序列處理和分析。MEGA 是對物種和種群DNA 和蛋白質序列進行分子進化遺傳分析的軟件套裝，本文利用該軟件對不同植物C3H蛋白氨基酸序列進行比較和進化樹的構建。ProtParam 是對蛋白質進行理化性質分析的軟件，可計算蛋白質的各種物化參數，包括分子量、理論pI 和氨基酸組成等。ProtScale 是對蛋白質進行親疏水性分析的在線軟件。SignalP 6.0能夠預測信號肽的存在及其在蛋白質中的切割位點的位置[6]。TMHMM 是對蛋白質進行跨膜螺旋區分析的服務器，用隱馬爾可夫模型預測跨膜蛋白拓撲結構[7]。Euk-mPLOC是真核蛋白質亞細胞定位分析工具，包括具有多個亞細胞位點的真核蛋白質也能預測[8]。SOPMA 是一種蛋白質二級結構預測方法，分析蛋白質中α-螺旋、β-折疊和無規卷曲等主要二級結構的存在情況[9]。SWISS-MODEL 得到了Alpha-Fold 蛋白質結構數據庫等資源工具的支撐，能高效精準的自動對蛋白質結構進行同源性建模[10]。Prot-Param、ProtScale、SignalP6.0、TMHMM、Euk-mPLOC、SOPMA和SWISS-MODEL這些在線程序都有功能強大，簡單易用的特點。對該基因的生物信息學進行分析，將下載好的LjC3H2氨基酸序列導入其輸入界面中，再點擊提交即可得到相關蛋白信號肽、跨膜結構域、亞細胞定位以及蛋白質二級和三級空間結構的預測分析結果。

2 結果與分析

2.1 LjC3H2編碼蛋白的理化性質

通過程序EXPASY 的ProtParam 分析金銀花LjC3H2編碼蛋白的理化性質。結果顯示，LjC3H2編碼蛋白質原子總數8 133，分子式為C2601H4083N715O715S19；分子量57 419.53；等電點pI 為8.92；序列的N 末端是M（Met）時估計半衰期為30 h（哺乳動物網織紅細胞）＞20 h（酵母）＞10 h（大腸桿菌）。不穩定性指數計算為38.41，即該蛋白質應歸類為穩定蛋白質。脂肪指數92.33，親水性總平均值（重力）-0.231，偏親水性蛋白。LjC3H2蛋白共含氨基酸殘基506 個，包括蛋白質中常見的20 種氨基酸，其中亮氨酸（Leu，11.7%），丙氨酸（Ala，8.3%），精氨酸（Arg，6.9%），纈氨酸（Val，6.9%），脯胺酸（Pro，6.9%），谷氨酸（Glu，6.3%），甘氨酸（Gly，6.1%），賴氨酸（Lys，5.7%），天冬氨酸（Asp，5.1%）含量相對較多，半胱氨酸（Cys，0.8%）最少，帶負電荷的殘基總數（天冬氨酸+谷氨酸）為58，帶正電的殘基總數（精氨酸+賴氨酸）為64（表2）。

表2 LjC3H2蛋白質的氨基酸組成

預測LjC3H2在水中280 nm處的消光系數，若假設所有的半胱氨酸殘基都形成胱氨酸，則消光系數為80 120，吸光度值（0.1%濃度）為1.395。假設所有的半胱氨酸殘基都不形成胱氨酸，則消光系數為79 870，吸光度值（0.1%濃度）為1.391。用DNAMAN軟件對LjC3H2做胰蛋白酶的酶切分析，結果表明胰蛋白酶對LjC3H2做酶切分析可得39 個片段。用DNAMNA 軟件預測LjC3H2抗原位點的結果表明，在LjC3H2中存在的抗原位點有8個（表3）。

表3 LjC3H2抗原位點預測

用ProtScale 軟件對LjC3H2做親水性和疏水性預測分析，得到的結果如圖1 所示。其中以LjC3H2中的氨基酸（aa）序列號作橫坐標，親水性分值作為縱坐標，負值越高表示親水性越強，正值越高表示疏水性越強。結果表明，除了起始的少數幾個氨基酸疏水性較高以外，整個蛋白質沒有特別明顯的“峰頂”和“谷底”，親/疏水性相對均勻，整體來看親水性略高。

圖1 LjC3H2親水性分析

2.2 LjC3H2蛋白的信號肽情況

用DNAMAN 軟件對LjC3H2進行信號肽預測分析，結果表明該蛋白自然分裂位點CS 的峰值為0.134 778，在第22 位；OTHER 的峰值為0.999 885，在第70 位；而信號肽峰值為0.262，無明顯峰值，即LjC3H2無信號肽。

2.3 LjC3H2蛋白的跨膜結構情況

運用程序工具TMHMM 對LjC3H2蛋白質進行跨膜區分析。結果表明，該蛋白質氨基酸序列長度506，預測出的跨膜螺旋數量為0，跨膜螺旋氨基酸殘基數量的期望值為4.674 93，蛋白前60 個氨基酸中，跨膜螺旋的氨基酸量的期望值為4.430 10，位于膜細胞質側的總概率為0.221 44，預測結果表明LjC3H2沒有跨膜結構域。通常蛋白質跨膜螺旋中的氨基酸殘基多為疏水性氨基酸殘基，親/疏水性分析結果表明該蛋白偏親水，這與該蛋白缺乏跨膜螺旋結果是吻合的。

2.4 LjC3H2的基因亞細胞定位

利用Euk-mPLOC對LjC3H2蛋白進行亞細胞定位分析，結果顯示LjC3H2蛋白可能在內質網上發揮作用。

2.5 LjC3H2蛋白的二、三級結構

采用SOPMA 對LjC3H2的二級結構進行分析，結果表明，α-螺旋（Alpha helix）占比50.20%；無規則卷曲（Random coil）占比33.00%；β-折疊也稱延伸鏈結構（Extended strand）占比11.66%；β 轉角（Beta turn）占比5.14%。表明LjC3H2的二級結構是以α-螺旋為主要類型，無規則卷曲較多，β-折疊即延伸鏈結構數量較少。在SWISS-MODEL對LjC3H2進行三級結構的比較建模分析，結果表明，LjC3H2與細胞色素P450的三級結構較相似（圖2）。

圖2 LjC3H2和細胞色素P450建模預測的三級結構比較

2.6 LjC3H2與不同植物間的進化關系

以LjC3H2氨基酸序列為樣本進行Blast 比對，獲得了37 種植物40 個C3H 蛋白氨基酸序列樣本，對這些樣本進行同源比較和分子進化分析。結果表明，LjC3H2基因編碼蛋白的氨基酸序列與薊、桔梗的C3H 親緣關系較近，而金銀花另一個C3H 蛋白則與龍葵、粗壯女貞、黃芩、芝麻、紅花釣鐘柳、地黃以及桃兒七等植物的進化關系較近（圖3），這表明金銀花中兩個C3H 拷貝的分子進化路線可能略有不同。此外，這兩個蛋白質在數據庫中的命名和作用對象也略有不同，其中LjC3H可能更多作用于香豆酰基酯類，LjC3H2則多作用于香豆酸。

圖3 37種植物中的40個C3H蛋白的系統進化情況

3 結論與討論

LjC3H2作為細胞色素P450 CYP98A 亞家族成員，具有該亞家族蛋白高度相似的空間結構，該蛋白分子偏親水，沒有跨膜結構域，沒有信號肽，二級結構以α-螺旋為主，無規則卷曲較多，定位于內質網。分子進化方面，與薊、桔梗的C3H 親緣關系較近，與同屬于金銀花的LjC3H親緣關系較遠。

金銀花中有2 個C3H 蛋白的基因拷貝[11-12]，對LjC3H2的研究相對成熟，因此本文選擇以LjC3H2作為研究對象，進行深入分析。結果表明，該酶沒有跨膜結構域、沒有信號肽，位于內質網上，關于該酶的各類分析表明，該酶主要在細胞內起作用。

對多種植物的C3H 進行系統進化分析，結果表明金銀花已知的2 種C3H 蛋白在進化上的親緣關系并不接近，表明這2 個拷貝的基因在進化上可能分屬兩條不同的路線，有一定的區別。即這2 個基因拷貝表達的酶蛋白在功能上可能存在細微的差異。后續研究可進一步對這2個基因表達的酶蛋白結構進行精細分析和比較，并通過試驗方法研究兩者的差異。

本文從數據庫收集了37 種植物40 個C3H 蛋白序列，利用生物信息學分析工具，以LjC3H2為研究對象，對該基因表達酶的結構、功能和分類等特點進行了分析研究，為今后繼續研究金銀花C3H 蛋白酶提供參考。