TRPV6、CCK-B、β-catenin在結腸息肉/癌組織中表達及相關性

鄧成念 謝臣武 謝斌 周文玉 王軍軍 侯穎 劉模榮

(遵義醫科大學附屬醫院,貴州 遵義 564100)

結腸癌在我國臨床上被認為是消化道高度惡性的腫瘤,在全球各胃腸道腫瘤發病率中居第3位、死亡率僅次第4位〔1〕。2013年全球每年有超過一百萬新診斷的結腸癌病例,每年約有700 000人死于結腸癌〔2〕。絕大多數結腸癌遵循腺瘤-腺癌模式發生,然后進一步發展,其中大腸息肉會增加結直腸腫瘤(CRC)的風險,大約有10%的息肉會發展為CRC〔3〕。許多文獻表明,在結腸癌發生發展眾多信號通路中,Wnt/β-catenin信號通路是研究較成熟的一關鍵信號通路,胃泌素(Gastrin)在通過結合胃泌素受體(CCK)-B增加結腸癌細胞中β-catenin含量來增加腫瘤細胞的侵襲和轉移過程中伴隨胞內鈣信號的改變,而細胞內Ca2+水平主要通過瞬時性受體電位通道香草酸受體(TRPV)6來調控。本實驗擬通過測定正常結腸黏膜組織、結腸增生性息肉組織、結腸腺瘤性息肉組織及早期結腸癌組織中Gastrin/CCK-B、TRPV6表達及β-catenin磷酸化水平,觀察其與正常結腸黏膜組織-息肉-癌演變之間有無相關性。

1 材料與方法

1.1結腸組織標本 2018年12月至2020年8月于遵義醫科大學附屬醫院病理科收集的10例結腸增生性息肉(增生組)、10例結腸腺瘤性息肉(腺瘤組)、10例早期結腸癌蠟塊標本(腸癌組),正常結腸黏膜組織取材于外科腸外傷后切除腸管蠟塊標本10例作為正常組。用于聚合酶鏈反應(PCR)及Western印跡檢測的標本取材于免疫組化標本的患者,于內鏡中心收集5例增生性息肉、5例腺瘤性息肉標本,胃腸外科手術室收集5例早期結腸癌組織及5例腸外傷后切除腸管的正常結腸組織。以上病例的病理結果由病理專家確診,均保存完整。且以上取材均首先獲得倫理學委員會的審批與患者家屬的同意。

1.2主要實驗試劑 抗Gastrin、抗CCK2-R購于Abcam公司;抗TRPV6購于上海玉博生物科技有限公司;抗β-catenin購于賽信通(上海)生物試劑有限公司。

1.3免疫組化(SP)法檢測β-catenin、Gastrin、TRPV6蛋白在正常結腸黏膜組織、結腸增生性息肉組織、結腸腺瘤性息肉組織、早期結腸癌組織中的表達。制作組織切片、組織脫蠟、脫水、封閉過氧化物酶、進行抗原修復、一抗孵育、二抗孵育、二氨基聯苯胺(DAB)組織顯色、復染、分化、脫水、干燥,滴加中性樹膠后蓋玻片封片。于電子顯微鏡下觀察組織陽性反應著色結果,主要呈棕黃色至褐色。β-catenin陽性表達為細胞膜、細胞質、細胞核中;TRPV6和Gastrin陽性表達部位主要位于細胞胞質。首先在低倍鏡下觀察整個視野,再于高倍鏡下隨機在每張切片中選擇5個視野觀察拍照,利用Image J軟件進行光密度測定和統計。

1.4Real-time PCR法檢測β-catenin、TRPV6、CCK-B mRNA的表達 首先進行RNA的提取;然后嚴格按照逆轉錄試劑盒說明書配制逆轉錄體系,按照設置的特定條件逆轉錄為cDNA。參考擴增試劑盒說明書配制擴增體系,同時對目的基因和內參基因進行擴增。CCK-B上游5′-CTGCTGTCCGGACTACTCAT-3′,下游5′-ACACCCGGGATGAAGAACAA-3′;β-catenin上游5′-TCCCACTAATGTCCAGCGT-3′,下游5′-ATGGACCATAACTGCAGCCT-3′;TRPV6上游5′-AAACCTTTGCCTGCCAGATG-3′,下游5′-GTCAG TGGTCCATACGTCCA-3′。β-actin上游5′-TGTCACCAACTGGGACGATA-3′,下游5′-AGGGGTGTTGAAG GTCTCAAA-3′;β-catenin、TRPV6、CCK-B的mRNA表達量采用相對定量法(2-ΔΔCt法)計算。

1.5Western印跡法檢測β-catenin、TRPV6、CCK-B蛋白的表達 首先進行蛋白提取,然后使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)快速配膠,電泳、電轉(將電壓調至100 V、時間調為1.5 h)、脫脂奶粉封閉1 h;一抗孵育〔將聚偏氟乙烯(PVDF)膜放置于β-catenin、TRPV6、CCK-B-抗稀釋液(稀釋比例分別為1∶1 000、1∶200、1∶2 000)中〕,4 ℃冰箱中孵育過夜。二抗孵育、曝光。

1.6統計學方法 采用SPSS23.0軟件進行t檢驗,Spearman相關分析。

2 結 果

2.1免疫組化結果 β-catenin在正常組主要表達于細胞膜,隨著增生組、腺瘤組、腸癌組的演變,其陽性表達部位由胞膜逐漸轉為細胞質、細胞核中出現棕黃色至棕褐色顆粒;TRPV6和Gastrin陽性表達部位主要位于細胞胞質。β-catenin、Gastrin、TRPV6在正常組、增生組、腺瘤組、腸癌組中的表達強度均有逐漸上升的趨勢,且差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1、表1。

表1 各組β-catenin、Gastrin、TRPV6陽性表達比較

圖1 各組β-catenin、Gastrin、TRPV6蛋白表達(SP染色,×400)

2.2各組β-catenin、TRPV6、CCK-8 mRNA及蛋白比較 與正常組比較,增生組、腺瘤組、腸癌組β-catenin、TRPV6、CCK-B mRNA及蛋白表達明顯升高(P<0.05);與增生組比較,腺瘤組、腸癌組β-catenin、TRPV6、CCK-8 mRNA及蛋白表達明顯升高(P<0.05),腸癌組上述指標mRNA及蛋白表達明顯高于腺瘤組(P<0.05)。見表2、圖2。

表2 各組β-catenin、TRPV6和CCK-B mRNA和蛋白表達比較

1,5:正常組;2,6:增生組;3,7:腺瘤組;4,8:腸癌組圖2 Western印跡檢測各組結腸組織中β-catenin、TRPV6和CCK-B蛋白表達

2.3所有組指標間的相關性 β-catenin表達水平與CCK-B、TRPV6表達呈正相關(r=0.998、0.988,P=0.002、0.012)。

3 討 論

正常生理情況下,Gastrin通過激活CCK-B,可增加壁細胞內Ca2+濃度,并刺激胃酸分泌〔4〕。而許多研究結果表明在CCK-B參與促進胃腸道腫瘤發生發展過程中涉及腫瘤細胞胞內鈣信號變化,CCK-B通過激活β-catenin信號通路與結腸癌等腫瘤的遷移、侵襲密切相關。TRPV6作為一種鈣離子通道能夠介導胞內Ca2+流動。大量研究證明,Gastrin水平升高與CRC風險之間存在正相關關系,高Gastrin血癥已被證明對正常或結腸腫瘤細胞有直接促有絲分裂作用〔5〕。眾多研究表明,Gastrin通過激活CCK-B從而參與了胃腸道癌及其他惡性腫瘤的發生。在胰腺癌中,當Gastrin激活CCK-B時,該受體進一步發生構象變化與下游信號傳導效應子相互作用,導致各種第二信使分子發生活化,進而直接促進細胞增殖分化、遷移侵襲、血管生成〔6〕。已有報道使用CCK-B拮抗劑netazepide(YF476)用于治療1型胃類癌患者療效可〔7〕,但在結腸癌中使用這些拮抗劑需要進一步研究。有學者證實,在胃腸腫瘤、肝癌、肺癌和乳腺癌等多種癌細胞中可能存在Gastrin/CCK-B環,阻斷此環能抑制癌細胞生長、促進凋亡〔8〕。本研究結果說明,在結腸癌發生發展中Gastrin及CCK-B均逐漸上調,Gastrin通過結合CCK-B可能促進正常結腸黏膜組織-息肉-癌的演變,符合上述研究結腸癌中存在的Gastrin/CCK-B環,但將其拮抗劑引入到臨床結腸腫瘤的治療仍需進一步的臨床試驗研究。

細胞內Ca2+的改變影響基因轉錄、細胞增殖和凋亡, Ca2+依賴的腫瘤微環境重塑影響血管生成、腫瘤進展和巨噬細胞募集〔9〕。生理情況下當細胞受到各種刺激時,Ca2+通過細胞膜上的各種鈣通道直接進入細胞內并維持其在胞質內的鈣動態平衡,通過調控相關的信號傳導通路進而影響細胞的增殖、遷移、侵襲等。TRPV6能通過構象變化成開放或關閉狀態控制 Ca2+跨膜流動。TRPV6 mRNA在晚期結腸腫瘤(Ⅲ和Ⅳ期)中處于非常低的水平,而66%的Ⅰ期腫瘤和17%的Ⅱ期腫瘤顯示過表達〔10〕。張慧等〔11〕研究發現,TRPV6表達量在從潰瘍性結腸炎患者到結腸腺癌患者中逐漸上調,且通過建模給予TRPV6激動劑1-25(OH)2D3及抑制劑CuCl2干預實驗后能夠促進/抑制TRPV6表達,從而促進/抑制結腸癌SW480細胞增殖和遷移。不僅在結腸癌中,TRPV6 mRNA和蛋白在許多惡性腫瘤中顯示過表達〔12〕。而在食管鱗狀細胞癌患者的TRPV6 mRNA和蛋白表達下調,但這些變化與疾病特異性生存率(DSS)之間無相關性〔13〕。本研究結果可能與實驗結腸組織數量較少有關,也可能是因為隨著正常結腸黏膜組織-息肉-癌的轉變過程中其表達逐漸下調,需要進一步增加樣本量來研究證明。上述研究表明,TRPV6表達與正常結腸黏膜組織-早期結腸癌的發生發展密切相關,且可能與其介導的細胞內Ca2+水平變化有關,但具體機制仍有待研究。

Wnt信號的異常激活破壞了結腸隱窩干細胞的正常生長和分化,通過上調諸如原癌基因(c-Myc)和細胞周期蛋白D等靶基因的表達而導致了CRC干細胞表型。因此,Wnt信號通路是腸上皮穩態的關鍵調節器,并且在大多數結腸癌中被改變〔14〕。其中Wnt/β-catenin信號傳導途徑的失調可以導致多種惡性腫瘤,尤其是結腸和頭頸部惡性腫瘤〔15〕。Wnt/β-catenin信號通路的異常激活突變導致β-catenin降解異常,在細胞質中積累過載后發生細胞核內轉運,從而在胞核內與TCF/LEF形成轉錄激活復合物,然后上調下游靶基因如c-Myc,G1/S-特異性周期蛋白(cyclin)D1和周期素依賴性激酶抑制因子(CDKN)1A過表達,從而驅動腫瘤的形成與發展〔16〕。Wnt/β-catenin信號通路不僅在結腸腫瘤的形成和發展中起著重要作用,與其侵襲、轉移也息息相關。例如,最常見的臨床結腸癌特征之一包括高水平的血管生成,這是癌細胞擴散和遠處轉移的關鍵事件。而Wnt/β-catenin下游信號調節最重要的促血管生成分子包括血管內皮生長因子(VEGF)家族成員、基質金屬蛋白酶(MMP)和趨化因子。此外,在結腸癌中主要檢測到與核定位相關的β-catenin基因突變,這會增加許多與腫瘤血管生成有關的基因的表達〔17〕。在正常結腸黏膜組織-息肉-癌演變過程中,β-catenin逐漸上調促進了結腸腫瘤的發生發展,而這可能與其在結腸癌細胞胞質中磷酸化降解異常、進而發生核轉移促進相關靶基因轉錄有關。

CRC確診時約30%已經發生轉移〔18〕,因此早期診斷對其預后極其重要。有研究顯示,Gastrin-17可與CCK-B 結合,激活結腸癌細胞株 Colo320 Wnt/β-catenin信號從而導致c-Myc和cyclinD1過度表達,促進結腸癌的發生、侵襲和轉移〔19〕。同樣的,在轉移性CRC患者中,血前Gastrin水平升高通過上調β-catenin/TCF4靶基因從而促進結腸腫瘤干細胞(CSC)的自我更新〔19〕。總之,Gastrin結合CCK-B通過Wnt/β-catenin信號通路促進結腸腫瘤細胞生長和遷移中具有關鍵作用,而在這一過程中,可能伴隨著胞內Ca2+穩態的變化。不僅在結腸癌中,在肺癌中也有報道,激活的CCK-B最終導致胞質Ca2+增加并且蛋白激酶(PK)C被激活,導致非受體酪氨酸激酶(Src)磷酸化及許多蛋白質〔如黏著斑激酶(FAK),paxillin和丙酮酸激酶(PYK)-2〕磷酸化,從而改變癌細胞的運動性和遷移能力〔20〕。而眾所周知TRPV6作為一種鈣離子通道能夠介導胞內Ca2+流動。

綜上,CCK-B、TRPV6、β-catenin在結腸腫瘤發生發展中具有一定的作用,且三者可能相互促進、交叉影響。因本實驗僅檢測了Gastrin/CCK-B、TRPV6、β-catenin在結腸組織中的表達,未進行CCK-B、TRPV6指標的增強或抑制來檢測在Wnt/β-catenin信號通路中的表達情況,尚不能證明在Gastrin結合CCK-B參與的促結腸癌Wnt/β-catenin信號通路中,TRPV6介導Ca2+跨膜流動參與其中。若要進一步闡明TRPV6在CCK-B促結腸癌相關的Wnt/β-catenin信號通路中的具體機制,需進一步行干預實驗予以研究。