LncRNA SNHG3通過miR-330-5p/PAK1信號軸調節前列腺癌細胞的增殖、凋亡和上皮間質轉化

程耿 周艦 楊軍 張朝陽 萬莉

(武漢市第三醫院暨武漢大學同仁醫院 1泌尿外科,湖北 武漢 430000;2皮膚科)

前列腺癌是常見的男性生殖系統惡性腫瘤之一,具有易遠端轉移和侵襲的特性,不僅累及患者膀胱和精囊,還會侵襲骨組織,導致血尿、血精、骨痛、骨折等癥狀,是造成男性死亡的主要癌癥類型〔1,2〕。很多研究證實長鏈非編碼RNA小核仁RNA宿主基因(LncRNA SNHG)3具有致癌作用,在胃癌、卵巢癌、前列腺癌等腫瘤中過表達,參與其病情進展,與腫瘤臨床分期和患者生存率降低密切相關,下調SNHG3表達可降低胃癌和卵巢癌細胞增殖、遷移活性〔3,4〕,并抑制前列腺癌細胞增殖、遷移和侵襲,延緩其腫瘤生長和骨轉移〔5〕。miR-330-5p是具有抑癌活性的微小RNA分子,在大腸癌、前列腺癌中表達降低,促使miR-330-5p分泌可抑制大腸癌細胞生長并促進其凋亡〔6〕,過表達miR-330-5p可通過抑制癌細胞增殖、凋亡和上皮-間充質轉化而延緩前列腺癌進展〔7〕。P21活化激酶(PAK)1是miR-330-5p的下游靶基因,miR-330-5p可直接靶向下調胰腺癌細胞中PAK1上調,從而抑制其增殖、侵襲和上皮-間充質轉化過程〔8〕。另外PAK1在前列腺癌中表達明顯升高,下調PAK1可抑制前列腺癌細胞的生長和轉移〔9,10〕。因此mir-330-5p/PAK1可作為前列腺癌的重要治療靶點。有研究顯示,在乳腺癌細胞中LncRNA SNHG3可靶向下調miR-330-5p,從而介導促進其增殖〔11〕,本研究探討LncRNA SNHG3通過miR-330-5p/PAK1信號軸調節前列腺癌細胞的增殖、凋亡和上皮間質轉化。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器 人前列腺上皮細胞(貨號CP-H019)、人前列腺上皮細胞完全培養基(貨號CM-H019)、PC-3細胞(貨號CL-0185)、Ham F-12K培養基(貨號PM150910)、VCaP細胞(貨號CL-0241)、DMEM培養基(貨號PM150210)、DU 145細胞(貨號CL-0075)、MDM培養基(貨號PM150410)、胎牛血清(貨號164210-500)、青鏈霉素混合液(貨號PB180120)購自武漢普諾賽生命科技有限公司;PAK1、miR-330-5p、U6與GAPDH引物、LncRNA SNHG3 siRNA、miR-330-5p inhibitor、LncRNA SNHG3 siRNA陰性對照、miR-330-5p inhibitor陰性對照、野生型miR-330-5p 3′-UTR報告質粒、LncRNA SNHG3空載質粒、LncRNA SNHG3過表達質粒、突變型miR-330-5p 3′-UTR報告質粒、miR-330-5p 3′-UTR無義序列均購自生工生物工程(上海)股份有限公司;噻唑藍(MTT)試劑盒(貨號M1020)、脂質體2000(貨號L7800)、膜聯蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素(Annexin Ⅴ-FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡檢測試劑盒(貨號CA1020)、5-乙炔基-2′脫氧尿嘧啶核苷(EdU)細胞增殖檢測試劑盒(貨號CA1170)、總RNA提取試劑盒(貨號R1200)、Opti-MEM減血清培養基(貨號31985070)、一步法實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)試劑盒(貨號T2210)、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(貨號D0010)購自北京索萊寶科技有限公司等。二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(貨號P0012)、伊紅染色液(貨號C0109)、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(貨號A0208)、RIPA裂解液(貨號P0013E)均購自上海碧云天公司。兔源抗大鼠抗-GAPDH抗體(貨號ab181602)、兔源抗大鼠抗-Vimentin抗體(貨號ab193555)、兔源抗大鼠抗-E-cadherin抗體(貨號ab76319)購自美國Abcam公司等。酶標儀-型號iMark,RT-PCR儀-型號CFX96,基礎電泳儀電源-型號1645050,蛋白電泳儀與轉膜儀(型號Mini PROTEAN)均購自BIO-RAD公司(美國);熒光顯微鏡(型號FSX100)購自日本奧林巴斯公司;雙目顯微鏡(型號DM3000)購自Leica公司(德國);智能熒光流式細胞儀(型號Countstar Rigel),Countstar Rigel智能熒光流式細胞儀(中國)等。

1.2細胞培養及各細胞系中LncRNA SNHG3、miR-330-5p與PAK1表達檢測 于39.5 ℃水浴中快速解凍購買的人前列腺上皮細胞及人前列腺癌細胞株PC-3、DU 145、VCaP,以含有10%胎牛血清和1%青鏈霉素混合液的培養基復蘇培養,細胞融合率達到70%～80%時進行傳代,將傳代的各種細胞接種在培養皿中培養,細胞鋪滿培養皿時收集細胞沉淀,使用總RNA提取試劑盒自各種細胞中提取純化總RNA后,采用一步法qRT-PCR試劑盒進行PCR擴增,實驗步驟均遵照各自試劑盒說明書指導進行,得到的各細胞樣品循環閾值通過2-ΔΔCt法做分析,以內參基因GAPDH作標準,計算出各基因相對表達水平,其引物序列(5′-3′),PAK1正向:CGCCCAGAGCACACAAAATC,反向:GTCCCGAGTTGGAGTGACAG;miR-330-5p正向:TCTCTGGGCCTGTGTCTTAG,反向:CAGTGCGTGTCGTGGAGT;GAPDH正向:CAGGAGGCATTGCTGATGAT,反向:GAAGGCTGGGGCTCATTT;U6正向:TCCGATCGTGAAGCGTTC,反向:GTGCAGGGTCCGAGGT;E-cadherin正向:TACAACGACCCAACCCAA,反向:TCCTCCGAAGAAACAGCA;Vimentin正向:GCGTGACGTACGTCAGCAATATGA,反向:GTTCCAGGGACTCATTGGTTCCTT。

1.3分組轉染PC-3細胞及收集標本 將傳代的PC-3細胞接種在12孔板,無菌培養12 h后隨即分為對照組、LncRNA SNHG3 siRNA組、miR-330-5p inhibitor組、共轉染陰性對照(LncRNA SNHG3 siRNA陰性對照+miR-330-5p inhibitor陰性對照)組、共轉染(LncRNA SNHG3 siRNA+miR-330-5p inhibitor)組,以脂質體分組轉染LncRNA SNHG3 siRNA及其陰性對照、miR-330-5p inhibitor及其陰性對照,具體步驟遵照脂質體說明書指導進行,繼續無菌培養24 h后收集各組細胞沉淀。

1.4PC-3細胞增殖及凋亡檢測 取96孔板,將各孔隨即分為空白對照組、對照組、LncRNA SNHG3 siRNA組、miR-330-5p inhibitor組、共轉染陰性對照組、共轉染組,每組6個孔,空白對照組不接種細胞,其余各組接種傳代的PC-3細胞,無菌培養12 h后按照1.3中方法分組轉染24 h后,加入MTT液50 μl培養4 h,然后小心吸出上清,每孔加入二甲基亞砜150 μl,置于酶標儀中震蕩,充分溶解結晶物后測定490 nm下各孔吸光值,計算細胞活力(%)=(轉染組吸光值-空白對照組吸光值)/(對照組吸光值-空白對照組吸光值)×100%;將傳代的PC-3細胞接種在24孔板,無菌培養12 h后按照1.3中方法分組并轉染,24 h后以50 μmol/L EdU孵育2 h,小心吸出培養基后洗滌細胞,4%多聚甲醛固定后,參照EdU細胞增殖檢測試劑盒說明書指導于熒光顯微鏡下觀察檢測細胞增殖情況,以對照組EdU陽性細胞數作為標準計算各組EdU陽性細胞相對于對照組的比值,作為各組細胞相對增殖率,將對照組相對增殖率記為100%。

以磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸1.3中收集的各組細胞,于37.5 ℃下分別避光孵育10 μl Annexin Ⅴ-FITC和5 μl PI,15 min后離心洗滌細胞沉淀,再次以500 μl PBS重懸各組細胞后上樣,采用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況,所得數據運用Muticycle AV軟件進行分析,即能獲得各組細胞凋亡率。

1.5PC-3細胞侵襲情況檢測 以含血清的培養基重懸1.3中收集的各組細胞,以細胞計數板測出各組細胞濃度后,均調整為5×105個/ml,每組取250 μl細胞懸液分別接種在基質膠包被過的Transwell上室中,在Transwell下室中同時加入無血清的培養基,培養24 h后擦去上室細胞,以PBS洗滌下室細胞后,固定、伊紅染色液孵育,于光學顯微鏡下觀察并計數著色細胞,隨機選6個視野拍照。

1.6PC-3細胞miR-330-5p、PAK1與上皮間質轉化因子E-鈣黏附蛋白(cadherin)、波形蛋白(Vimentin)表達檢測 以qRT-PCR實驗檢測PC-3細胞miR-330-5p、PAK1、E-cadherin與Vimentin mRNA表達,具體步驟參照1.2中方法進行。

1.7檢測PC-3細胞中LncRNA SNHG3對miR-330-5p的靶向調控 將傳代的PC-3細胞接種在12孔板,無菌培養12 h后隨機分為轉染野生型miR-330-5p 3′-UTR報告質粒+LncRNA SNHG3過表達質粒組、轉染野生型miR-330-5p 3′-UTR報告質粒+LncRNA SNHG3空載質粒組、轉染突變型miR-330-5p 3′-UTR報告質粒+LncRNA SNHG3過表達質粒組、轉染突變型miR-330-5p 3′-UTR報告質粒+LncRNA SNHG3空載質粒組、轉染miR-330-5p 3′-UTR無義序列+LncRNA SNHG3過表達質粒組、轉染miR-330-5p 3′-UTR無義序列+LncRNA SNHG3空載質粒組,以1.3中方法分組轉染質粒及RNA序列,24 h后收集各組細胞沉淀檢測其雙熒光素酶相對活性,具體步驟參照采用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書指導進行。

1.8統計學分析 采用SPSS22.0軟件進行單因素方差、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1前列腺癌細胞中LncRNA SNHG3、miR-330-5p與PAK1 mRNA的表達 與人前列腺上皮細胞相比,PC-3、DU 145、VCaP細胞中LncRNA SNHG3、PAK1 mRNA表達明顯升高,miR-330-5p mRA表達明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組細胞LncRNA SNHG3、miR-330-5p與PAK1 mRNA相對表達水平

2.2LncRNA SNHG3對PC-3細胞增殖的影響 與對照組、共轉染組相比,LncRNA SNHG3 siRNA組細胞活力與相對增殖率均明顯降低,miR-330-5p inhibitor組細胞活力與相對增殖率均明顯升高(P<0.05),共轉染陰性對照組細胞活力與相對增殖率均無顯著差異(P>0.05)。見表2、圖1。

圖1 各組PC-3細胞增殖(Edu染色,×200)

表2 各組細胞活力與相對增殖率

2.3LncRNA SNHG3對PC-3細胞凋亡的影響 與對照組、共轉染組相比,LncRNA SNHG3 siRNA組細胞凋亡率均明顯升高(P<0.05),miR-330-5p inhibitor組細胞凋亡率均明顯降低(P<0.05),共轉染陰性對照組細胞凋亡率均無顯著差異(P>0.05)。見圖2、表3。

圖2 流式細胞實驗檢測各組PC-3細胞凋亡

表3 各組細胞凋亡率、侵襲細胞數、細胞Vimentin、E-cadherin、miR-330-5p、PAK1 mRNA相對表達水平

2.4LncRNA SNHG3對PC-3細胞miR-330-5p與PAK1 mRNA表達的影響 與對照組、共轉染組相比,LncRNA SNHG3 siRNA組細胞miR-330-5p mRNA表達水平均明顯升高,PAK1 mRNA表達均明顯降低(P<0.05);miR-330-5p inhibitor組細胞miR-330-5p mRNA表達水平均明顯降低,PAK1 mRNA表達均明顯升高(P<0.05);共轉染陰性對照組細胞miR-330-5p與PAK1 mRNA表達水平均無顯著差異(P>0.05)。見表3。

2.5LncRNA SNHG3對PC-3細胞侵襲及上皮間質轉化的影響 與對照組、共轉染組相比,LncRNA SNHG3 siRNA組細胞Vimentin mRNA表達、侵襲細胞數均明顯降低,E-cadherin mRNA表達均明顯升高(P<0.05);miR-330-5p inhibitor組細胞Vimentin mRNA表達、侵襲細胞數均明顯升高,E-cadherin mRNA表達均明顯降低(P<0.05);共轉染陰性對照組細胞Vimentin和E-cadherin mRNA表達、侵襲細胞數均無顯著差異(P>0.05)。見表3、圖3。

圖3 Transwell遷移實驗檢測各組PC-3細胞侵襲(伊紅染色,×200)

2.6LncRNA SNHG3對PC-3細胞miR-330-5p的靶向調節 運用TCGA數據庫預測LncRNA SNHG3與miR-330-5p之間的結合位點,見圖4。與轉染野生型miR-330-5p 3′-UTR報告質粒+LncRNA SNHG3空載質粒組(1.01±0.17)比較,轉染野生型miR-330-5p 3′-UTR報告質粒+LncRNA SNHG3過表達質粒組相對熒光素酶活性(0.41±0.03)顯著降低(t=8.514,P=0.000);與轉染突變型miR-330-5p 3′-UTR報告質粒+LncRNA SNHG3空載質粒組(1.04±0.22)比較,轉染突變型miR-330-5p 3′-UTR報告質粒+LncRNA SNHG3過表達質粒組相對熒光素酶活性(1.02±0.24)無明顯差異(t=0.150,P=0.883);與轉染miR-330-5p 3′-UTR無義序列+LncRNA SNHG3空載質粒組(0.98±0.19)比較,轉染miR-330-5p 3′-UTR無義序列+LncRNA SNHG3過表達質粒組相對熒光素酶活性(0.97±0.25)無明顯差異(t=0.078,P=0.939)。

圖4 TCGA數據庫預測到LncRNA SNHG3與miR-330-5p之間存在結合位點

3 討 論

目前臨床中前列腺癌患者的預后及生存率并不理想,對前列腺癌發病機制進行深入探究,尋找更有特異性的分子治療靶點,是腫瘤臨床研究的重要課題〔12,13〕。SNHG3作為癌基因,在肝細胞癌、結直腸癌和乳腺癌等多種腫瘤中發揮明顯的致癌作用,過表達SNHG3可促進乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲,敲除SNHG3基因可抑制乳腺癌細胞異種移植腫瘤生長〔14〕。此外,SNHG3在前列腺癌中異常高表達,抑制SNHG3可降低前列腺癌細胞增殖和上皮間充質轉化活性,進而減弱其侵襲遷移,延緩前列腺癌病情進展〔15〕。本實驗結果表明,LncRNA SNHG3參與調控前列腺癌細胞生物學行為,敲低SNHG3基因可顯著抑制前列腺癌細胞上皮間質轉化,降低其增殖及侵襲活性,并促進其凋亡發生,與以前的研究相似,進一步證實了SNHG3是前列腺癌治療靶點。

miR-330-5p是調控肺癌、大腸癌、前列腺癌等多種類型腫瘤的微小RNA,在腫瘤中發揮抑癌作用,促進miR-330-5p表達可抑制肺癌增殖、糖酵解,并在體內抑制其異種移植腫瘤生長〔16〕,還可減弱前列腺癌細胞上皮間質轉化、增殖和侵襲遷移〔17〕;其下游靶基因PAK1具有明顯致癌作用〔8〕,在前列腺癌組織和細胞中表達較高水平,PAK-1抑制劑可降低前列腺癌細胞活力,并抑制其上皮間質轉化過程〔18,19〕,表明miR-330-5p/PAK1是前列腺癌的候選分子治療靶點。本實驗結果表明,miR-330-5p/PAK1參與介導敲低SNHG3對PC-3細胞增殖及侵襲的抑制過程,LncRNA SNHG3可通過miR-330-5p/PAK1信號軸調節前列腺癌細胞的增殖、凋亡和上皮間質轉化。

綜上,LncRNA SNHG3可通過靶向調節miR-330-5p介導前列腺癌細胞增殖、侵襲和上皮間質轉化等生物學行為,下調SNHG3基因可通過促使miR-330-5p分泌,抑制PAK1基因表達,從而降低前列腺癌細胞活力及上皮間質轉化活性,誘導其大量凋亡,并抑制其增殖及侵襲。