槲皮素對白血病細胞增殖、凋亡的影響

陳瑜 陶石 胡敏 徐璐 王嬌 符才波 周威倫

(海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院血液內(nèi)科 海南省臨床醫(yī)學中心,海南 海口 570100)

白血病是因造血干細胞出現(xiàn)特異變化的克隆性惡性疾病〔1,2〕,該病患者伴有貧血、淋巴腫大等癥狀〔3,4〕。今年來,白血病在我國的發(fā)病率和病死率逐漸攀升,位于世界中等水平〔5,6〕。目前,白血病的治療手段已化療為主,并沒有明確的特效藥。但化療藥物毒副作用大,所以尋找效果良好且毒副作用小的藥物刻不容緩。有研究表明,許多中藥提取物對白血病細胞有殺傷作用,如雷公藤甲素、人參多糖等〔7,8〕,這類中藥提取物還具有對人體毒副作用小,成本低,治療效果好的優(yōu)點。槲皮素是天然化合物,屬于黃酮類,在花、葉和果子中可以提取,也在部分中藥中可以提取,對炎癥反應、過敏反應,病毒、細菌、癌細胞等具有較好的治療作用,近些年來,關于其對腫瘤的抑制、抵抗作用也被廣泛研究報道〔9～13〕。本研究旨在體外培養(yǎng)白血病細胞,探討槲皮素對白血病細胞的增殖、凋亡及殺傷效果,同時對可能存在的作用機制進行分析。

1 材料與方法

1.1細胞、試劑、儀器 人原髓細胞白血病細胞(HL-60,貨號:CL-0110,公司:普諾賽);槲皮素(貨號:Q4951,公司:Sigma);二甲基亞砜(DMSO,貨號0219605580,公司:MP Biomedicals);RPMI1640培養(yǎng)基(貨號PM150110P,公司:普諾賽);胎牛血清(貨號:164210,公司:普諾賽);CCK-8(貨號P-CA-001,公司:普諾賽);TUNEL(貨號:P-CA-007,公司:普諾賽);Hoechst33342染色液購自北京萌壯科技有限公司;TDL-80-2B低俗臺式離心機;瑞沃德CO2培養(yǎng)箱:賽默飛的酶標儀和蛋白成像系統(tǒng);Leica徠卡熒光顯微鏡;默克光度計和電泳儀;轉(zhuǎn)膜儀購自的山海艾研生物科技有限公司。

1.2細胞培養(yǎng) HL-60轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)基中,37 ℃、5%CO2培養(yǎng),每2～3 d傳代換液,取處于對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.3槲皮素配制 槲皮素溶解于DMSO配成40 μmol/L儲備液,-20 ℃冰箱保存,以RPMI1640培養(yǎng)液稀釋到10、20、40 μmol/L。

1.4CCK-8法檢測HL-60增殖活力 調(diào)整HL-60密度2×105個/ml,接種于96孔板。加入不同濃度的槲皮素100 μl〔14〕(10、20、40 μmol/L),分別記為槲皮素10、20、40 μmol/L組,另加入RPMI1640培養(yǎng)液100 μl為空白組。分別等待24、48、72 h,加入10 μl CCK-8,靜置3 h。計算增殖率。不同濃度設6個對照,取平均值,下同。

1.5TUNEL法檢測HL-60凋亡情況 藍色熒光為細胞核未凋亡,綠色熒光為細胞核凋亡或破碎。熒光顯微鏡下選10個視野進行鏡下觀察,計算凋亡率。凋亡率 =(視野內(nèi)凋亡HL-60細胞數(shù)/視野內(nèi)HL-60總數(shù))×100%。

1.6細胞黏附實驗檢測HL-60黏附力 細胞分組、處理、加藥同上。在24孔板接種。磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次,0.1%結(jié)晶紫染色,0.2% Triton X-100固定,紫外分光光度計在550 nm處檢測各孔 A,計算黏附率。黏附率= A給藥組/A空白組×100%。

1.7劃痕修復實驗檢測HL-60遷移能力 調(diào)整HL-60密度2×105個/ml,接種于96孔板。細胞單層生長鋪滿時,無菌移液槍頭均勻劃線,PBS沖洗劃落細胞。37 ℃、5% CO2及飽和濕度培養(yǎng)48 h,測量劃痕處細胞遷移面積,計算遷移率。遷移率=給藥組遷移面積/空白組遷移面積×100%。

1.8transwell法檢測HL-60侵襲能力 基質(zhì)膠4 ℃靜置一夜,直至融化,培養(yǎng)基稀釋(1∶3),取40 μl均勻鋪于下室,37 ℃孵育1 h,待其膠凝,待用。37 ℃、5% CO2及飽和濕度培養(yǎng)48 h,分別取200 μl接種于transwell小室上室,并在transwell小室下室加入含有20%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)液600 μl。 37 ℃、5% CO2及飽和濕度等待24 h后,去掉未穿膜細胞,收集遷移至濾膜下層的細胞,甲醇固定,染色。計算侵襲數(shù)。

1.9Western印跡檢測 caspase8、9、3 蛋白表達 調(diào)整HL-60密度2×105個/ml,接種于96孔板,加入40 μmol/L槲皮素分別培養(yǎng)24與48 h,記為槲皮素40 μmol/L 24、48 h組,另加入RPMI1640培養(yǎng)液100 μl為空白組。提取總蛋白,測定濃度。配制聚丙烯酰胺凝,添加電泳液。濃縮:采用100 V恒壓電泳約20 min;分離:采用恒壓120 V電泳約60 min。轉(zhuǎn)膜25 min,封閉液封閉2 h,分別加3 μl的caspase8、9、3一抗4 ℃過夜,洗脫一抗20 min,每10 min一次換液,然后用1.5 μl 二抗37 ℃搖床孵育1 h,洗脫二抗1 h,顯影,掃膜儀成像。

1.10統(tǒng)計學分析 采用SPSS23.0軟件進行t或F檢驗。

2 結(jié) 果

2.1TUNEL法檢測HL-60凋亡情況 與空白組相比,槲皮素各組HL-60凋亡指數(shù)顯著增加,且隨槲皮素濃度增加呈顯著劑量依賴性(P<0.05),見圖1、表1。

表1 HL-60增殖活力、凋亡情況、黏附力、遷移能力、侵襲能力比較

圖1 各組HL-60凋亡、遷移、侵襲

2.2劃痕修復實驗檢測HL-60遷移能力 與空白組相比,槲皮素組HL-60遷移率顯著降低,隨槲皮素濃度增加,遷移率呈顯著劑量依賴性(P<0.05),見圖1、表1。

2.3transwell法檢測HL-60侵襲能力 與空白組相比,槲皮素組HL-60侵襲數(shù)降低,且槲皮素濃度越高,細胞侵襲數(shù)越少,見圖1、表1。

2.4CCK-8法檢測HL-60增殖活力 與空白組相比,槲皮素各濃度組細胞增殖抑制率顯著增加(P<0.05),且抑制率隨時間和濃度的增加而顯著加強(P<0.05)。72 h抑制率雖高但過度抑制,后續(xù)實驗均以48 h為作用時間,見表1。

2.5細胞黏附實驗檢測HL-60黏附力 與空白組相比,槲皮素各組HL-60黏附率顯著降低,且隨槲皮素濃度增加,黏附率呈顯著劑量依賴性降低(P<0.05),見表1。

2.6Western印跡檢測caspase8、9、3蛋白表達 槲皮素40 μmol/L 24 h組、槲皮素40 μmol/L 48 h組caspase9、3蛋白的表達量較空白組顯著升高(P<0.05)。槲皮素40 μmol/L 48 h組caspase9、3表達量比槲皮素40 μmol/L 24 h組顯著增高(P<0.05)。3組caspase8差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表2、圖2。

表2 各組caspase8、9、3蛋白表達比較

1～3:空白組、槲皮素40 μmol/L 24、48 h組圖2 各組caspase8、9、3蛋白表達

3 討 論

本實驗表明,槲皮素對白血病細胞的生長具有一定的抑制作用,可將其投入臨床,應用于白血病患者的醫(yī)治。白血病的發(fā)生發(fā)展與惡性克隆的造血功能細胞的生長發(fā)育、侵襲、轉(zhuǎn)移等相關,這個特點使的絕大多數(shù)白血病患者難以治愈〔15〕。所以,降低白血病細胞的遷移和侵襲是治療的一個思路,但白血病細胞的遷移和侵襲非常復雜〔16〕。白血病是非實體瘤,所以白血病細胞的遷移和侵襲與常規(guī)的實體瘤略有不同,但大致過程例如細胞黏著、基質(zhì)合成與降解等是相似的。本研究表明,槲皮素能夠抑制白血病細胞的黏附率、遷移率和侵襲率,并且隨著槲皮素濃度的增加,抑制作用增強,這意味著槲皮素可以抑制白血病細胞的遷移和侵襲能力。

caspase與細胞的凋亡密切相關,它是一種蛋白激酶,具有相似的氨基酸序列、結(jié)構(gòu)和特異性〔17〕。caspase活化后會引起細胞凋亡,這與其對細胞結(jié)構(gòu)酶解、滅活阻止細胞凋亡有關的細胞內(nèi)物質(zhì)相關〔18〕。caspase8、9是調(diào)控caspase,與打靶和激活調(diào)控相關,其中caspase8還能夠傳遞凋亡信號;caspase3是效應caspase,是參與凋亡的效應物〔19,20〕。本研究表明,槲皮素作用后caspase9、3蛋白的表達量顯著變化,出現(xiàn)上調(diào),并且隨槲皮素作用時間增加,上調(diào)越明顯,所以由此猜測,槲皮素誘導的是內(nèi)源性通路介導的凋亡。

綜上,槲皮素能夠抑制白血病細胞增殖,誘導其凋亡,并且對白血病具有較強的殺傷作用,這與內(nèi)源性通路中caspase9和3蛋白介導的凋亡密切相關,本文為槲皮素在臨床上應用于白血病的治療提供了實驗依據(jù),其具體的通路機制還需進一步研究。