MK886和celecoxib對結腸癌HT-29細胞增殖的影響

李仕宇 彭丹若 趙逵

(1遵義醫科大學第三附屬醫院(遵義市第一人民醫院)消化內科,貴州 遵義 563000;2遵義醫科大學附屬醫院)

隨著人們生活水平的提高,飲食結構也隨之發生變化,我國結直腸癌的發病率及病死率在胃腸道惡性腫瘤中僅次于胃癌和食管癌,且發病年齡逐漸年輕化〔1〕。花生四烯酸(AA)是人體的一種必須脂肪酸,主要通過脂氧合酶(LOX )和環氧合酶(COX)兩條代謝途徑代謝,生成多種代謝物質直接參與結直腸腫瘤的發生發展〔2〕。5-乙炔基-2′脫氧嘧啶核苷(EdU)是一種胸腺嘧啶核苷酸類似物,它主要是檢測細胞處于增殖期時代替胸腺嘧啶(T)滲入正在復制的DNA分子中,通過與特有的熒光染料結合來顯示DNA的復制活性,能更敏感、快速、簡單、精確的檢測細胞增殖。有效抑制腫瘤細胞增殖的速度可明顯抑制腫瘤生長、延緩腫瘤進程。本研究采用EdU和CCK-8法分別檢測抑制AA的COX和LOX代謝途徑中的COX-2和5-LOX的活性,探討COX-2抑制劑celecoxib和5-LOX抑制劑MK886對結腸癌細胞增殖的抑制作用。

1 材料和方法

1.1材料 人結腸癌細胞株HT-29購于中科院上海細胞庫,MK886(Cayman公司);celecoxib(Solarbio公司),胰蛋白酶、雙抗、RPMI1640培養基、胎牛血清(美國Hyclone公司),CCK-8(日本同仁公司),EdU試劑盒(銳博生物科技),二甲基亞砜(DMSO,Solarbio公司)。

1.2細胞培養 人結腸癌細胞株HT-29培養于含12%胎牛血清、1%雙抗的RPMI1640培養基,置于37 ℃、5%CO2的培養箱中常規培養,待細胞貼壁生長至80%～90%融合時,用0.25%胰蛋白酶進行消化傳代繼續培養,待細胞生長狀態良好、處于對數期時用于實驗。DMSO溶解MK886和celecoxib分別配成10、20 mmol/L的母液過濾后置于-20 ℃冰箱備用,實驗時用完全培養基稀釋,使其DMSO終濃度使用時<0.1%。

1.3CCK-8法 分別檢測MK886和celecoxib對HT-29細胞的增殖抑制率,取對數生長期的HT-29細胞按1×104/孔密度接種于96孔板中,每孔100 μl細胞懸液,置于37 ℃、5%CO2的培養箱中培養24 h待細胞貼壁生長。設對照組及實驗組。對照組只加完全培養基,不含細胞懸液。實驗組加含MK886藥物濃度梯度分別200.0、100.0、50.0、25.0、12.5 μmol/L的完全培養基,含celecoxib濃度梯度分別為200.0、100.0、50.0、25.0、12.5 μmol/L的完全培養基。每個藥物濃度及對照組均設5個復孔,置于培養箱中繼續分別培養24、48 h。然后向每孔中加入10 μl CCK-8溶液,培養箱中培養1 h,酶標儀450 nm處測各孔吸光度(A)值,計算不同濃度的MK886和celecoxib分別作用HT-29細胞24、48 h后的增殖抑制率。細胞增殖抑制率(%) =(陰性對照組-實驗組)/(陰性對照組-空白組) ×100%。該實驗至少重復3次。

1.4EdU法分別檢測MK886和celecoxib對結腸癌HT-29細胞DNA合成的影響 取處于對數期、生長狀態良好的HT-29細胞以每孔1×104的細胞密度接種于96孔板,每孔100 μl細胞懸液,培養箱中培養24 h待細胞貼壁生長后換液。分別設對照組和藥物組,對照組只加入完全培養基,藥物組分別加入含MK886藥物濃度為50.0、25.0、12.5 μmol/L的完全培養基,含celecoxib藥物濃度為50.0、25.0、12.5 μmol/L的完全培養基。每個濃度組及對照組均設3個復孔。培養箱中常規培養48 h后加EdU培養基(試劑A)進行EdU標記,多聚甲醛進行細胞固定,棄固定液后加入甘氨酸溶液,脫色搖床5 min,然棄甘氨酸,磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗,滲透劑孵育10 min。室溫避光條件下進行Apollo染色,然后用1×Hhoechst33342進行DNA染色。避光倒置熒光顯微鏡下每孔隨機采取5個不同的視野,分別拍攝4′,6-二脒基-乙苯基吲哚(DAPI)狀態下(藍色)和熒光EdU下(紅色)的染色細胞,用Image-plus圖像分析軟件進行細胞計數。處于S期的細胞增殖率=(EdU細胞數/DAPI細胞總數)×100%。以上實驗重復3次。

1.5平板克隆形成試驗檢測MK886對結腸癌細胞HT-29克隆形成能力 HT-29細胞經消化吹散后,以每孔500個細胞接種于60 mm無菌培養皿中,貼壁過夜后進行分組:對照組(只含HT-29細胞和培養液,不加MK886)、MK886組(含HT-29細胞和培養液,加入MK886,終濃度為25 μmol/L)。每3～4 d更換1次培養液,共培養17 d,取出使用甲醇固定,吉姆薩(Giemsa)染色15 min,拍照、觀察,倒置顯微鏡下計數克隆形成數。克隆形成率=(克隆形成數/接種細胞數)×100%。每皿計數5個視野,實驗重復3次。

1.6細胞劃痕實驗檢測MK886對結腸癌HT-29細胞遷移能力的影響 事先在無菌的6孔板背面劃3條約0.5 cm寬的直線進行標記。取對數期生長狀態好的細胞,常規消化、計數。以每孔4×105接種于6孔板中,混勻,置于培養箱中貼壁過夜后分組:對照組(只含HT-29細胞和培養液,不加MK886)、MK886組(含HT-29細胞和培養液,加入MK886,終濃度為25 μmol/L),每組設2個復孔。待細胞生長鋪滿板底后,用無菌槍頭(10 μl)垂直6孔板先做好的標記線來劃痕,盡量去除漂浮的細胞。每孔選取3～5個視野進行拍照記錄劃痕寬度,繼續培養24、48 h。然后分別拍照記錄同樣位置的劃痕寬度的變化,并作對比。每個孔選取4個視野,每個視野選取2個距離點,取其平均值。細胞的遷移距離=藥物刺激前細胞兩邊的距離-藥物刺激后細胞兩邊的距離。實驗重復3次。

1.7統計學分析 采用SPSS17.0軟件進行方差分析、兩獨立樣本t檢驗。

2 結 果

2.1CCK-8法分別檢測MK886和celecoxib對結腸癌細胞的增殖抑制作用 MK886和celecoxib均能明顯抑制結腸癌HT-29細胞增殖,且隨著藥物濃度增加和作用時間延長,細胞增殖的抑制率逐漸增加,呈明顯劑量和時間依賴性(P<0.05)。見表1。

表1 不同濃度的MK886和celecoxib對HT-29細胞生長增殖抑制率的影響

2.2EdU法分別檢測MK886和celecoxib對結腸癌HT-29細胞DNA合成期的影響 不同濃度的MK886、celecoxib干預結腸癌細胞48 h后,較低濃度(12.5 μmol/L)的MK886、celecoxib能明顯抑制癌細胞DNA的合成從而抑制細胞增殖,與對照組相比差異具有統計學意義(P<0.05)。當藥物濃度逐漸增加,細胞增殖率呈明顯劑量依賴性降低(均P<0.05)。說明MK886和celecoxib能明顯抑制結腸癌HT-29細胞DNA合成,且呈劑量依賴性,且該結果比CCK-8檢測細胞增殖更敏感、更精確。見表2、圖1。

DAPI:藍色細胞核代表全部細胞(增殖和非增殖);EdU:紅色細胞核代表增殖細胞;Overlay:紅色代表增殖細胞,藍色代表非增殖細胞圖1 MK886和celecoxib對HT-29細胞DNA合成的影響(×200)

表2 不同濃度MK886和celecoxib對結腸癌HT-29細胞DNA合成的影響

2.3MK886對結腸癌HT-29細胞集落形成的影響 MK886組克隆形成能力明顯低于對照組〔(10.15±7.54)% vs(54.00±9.91)%;t=7.043,P<0.01〕。見圖2。

圖2 兩組結腸癌HT-29細胞集落形成(Giemsa染色)

2.4MK886對結腸癌細胞株HT-29遷移能力的影響 經過濃度為25.0 μmol/L的MK886干預結腸癌HT-29細胞24 h后,細胞兩邊劃痕的距離均較0 h時明顯縮短,MK886組細胞遷移的距離(29.95±4.23)明顯小于相同時間點對照組(52.05±7.39;t=4.492,P<0.05);干預時間延長至48 h后,細胞兩邊劃痕的距離進一步縮短,MK886組細胞遷移距離(38.35±2.43)明顯小于相同時間點對照組(66.6±7.64;t=6.103,P<0.01)。見圖3。

圖3 MK886對兩組不同時間點HT-29細胞遷移的影響(×100)

3 討 論

AA是人體的一種必需脂肪酸,是含20 C的多不飽和脂肪酸,通常被酯化后生成許多脂類物質,如類二十烷酸。類二十烷酸參與了許多腫瘤的發生發展,包括結直腸癌。AA在鈣依賴性磷脂酶A2的作用下 (cPLA2)從核膜外磷脂上釋放出游離的AA,游離的AA主要通過COX和LOX 2條酶促途徑代謝,通過COX途徑生成前列腺素類(PGs)和血栓素(Txs),通過LOX途徑生成白三烯(LTs)、羥基二十碳四烯酸(HETEs)等生物活性物質〔3〕。AA的代謝產物前列腺素(PG)和羥基二十碳四烯酸(HETEs)與腫瘤密切相關。PGE2可調控生長因子活性,并在腫瘤基因促進增殖過程中具有重要作用,外源性PGE2的使用不僅能激活腫瘤細胞增殖,還能與表皮生長因子(EGF)產生協同作用,促進腫瘤基因c-myc表達及細胞增殖〔4〕。此外,PGE2還可刺激促血管生成因子產生,具有促腫瘤組織血管新生的作用〔5〕。故COX-2抑制劑能通過抑制COX-2活性,減少AA生成PGE2,達到阻滯腫瘤細胞增殖的目的。

AA通過COX途徑生成的PGs代謝產物與結直腸癌進展、轉移、侵襲及腫瘤新生血管形成等相關,通過非甾體抗炎藥(NSAIDs)抑制這條代謝途徑可抑制腫瘤增殖并延遲腫瘤進展〔6〕。celecoxib的COX-2的特異性抑制劑,已被廣泛的應用于臨床,包括一些炎癥性疾病如類風濕關節炎等。celecoxib可通過抑制COX-2途徑來抑制腫瘤活性,也被證實可通過抑制腫瘤增殖、誘導凋亡、抑制新生血管形成,也有研究發現,celecoxib可通過預防腫瘤的復發、增強抗癌藥物的毒性、增加放化療的敏感性而達到對惡性腫瘤的治療效果〔7〕。但celecoxib是否對結腸癌細胞也有預防作用,是否通過抑制腫瘤細胞的增殖而抑制結腸癌的生長,具體機制如何尚不明確。

而AA的LOX途徑的代謝產物已被大量研究證實具有促進結腸腫瘤形成的作用,5-LOX是AA合成LTS的關鍵限速酶,相關文獻〔8〕報道稱,5-LOX在結腸癌中以高表達為主,在正常組織中低表達或不表達。而5-LOX代謝通路中相關抑制劑能通過各個環節表現出抗腫瘤作用,不良反應比目前常規使用的化療藥物小,可能對今后的抗腫瘤藥物帶來新的希望。MK-886是像鈍化劑一樣與5-LOX活化蛋白(FLAP)結合,阻止5-LOX的活化,它是第一個被廣泛應用于臨床研究的FLAP抑制藥〔9〕。本實驗證實,抑制5-LOX活性可抑制結腸癌細胞增殖,抑制癌細胞DNA合成。Tong等〔10〕也發現,LOX抑制劑能明顯下調抗凋亡蛋白B細胞淋巴瘤(Bcl)-2和Mcl-1的表達而上調凋亡蛋白Bcl-2相關X蛋白(Bax)表達,且能明顯誘導細胞質線粒體內細胞色素C的釋放,繼而導致細胞凋亡蛋白與抗凋亡蛋白的失調,并在體外的實驗中得到相同的實驗結果。另外有相關研究也表示〔2〕,HT-29細胞在AA作用下抑制了脂肪生成,不能合成足夠的脂肪酸進行細胞分裂,HT-29細胞可能將更多的AA摻入其膜磷脂中增殖,引起內質網應激,作為主要成分并入膜磷脂可能會導致膜結構異常,引發細胞凋亡反應,AA可作為抗腫瘤藥物應用于基礎脂肪酸合成酶水平較低的癌細胞。5-LOX 也可通過絲裂原活化蛋白激酶/細胞外調節蛋白激酶(MEK/ERK)途徑和磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)級聯反應促進細胞增殖。Tong等〔11〕在隨后的研究中發現,5-LOX的代謝產物5,12-二羥基-6,8,10,14-二十碳四烯酸(LTB)4能迅速地活化MEK及ERK1/2酶,而MEK的抑制劑能夠阻斷LTB4依賴激活的ERK1/2的活化及細胞增殖。LTB4可被PI3激酶抑制劑阻斷,還能通過誘導Akt磷酸化,部分LTB4誘導依賴的細胞增殖也可被PI3激酶抑制劑阻斷。有研究者〔12〕設計了mPGES-1/5-LOX雙重抑制和COX-1/2保留的先導分子licofloone類似物LFA-9,LFA-9可抑制mPGES-1/5-LOX及其產物PGE2和LTB4,而抑制COX-1/2及其產物PGI2。LFA-9與人體內的mPGES-1/5-LOX酶強結合,引起其二級結構的改變,從而抑制其酶活性。LFA-9抑制大鼠的炎癥反應(70.4%)、抑制CD68免疫細胞浸潤(P≤0.000 1)和腫瘤壞死因子(TNF)-α表達,LFA-9通過抑制PGE2水平從而抑制結腸腫瘤細胞干性。另外有研究發現〔13〕COX-1/2、5-LOX的聯合抑制劑Licofelone具有抗炎及抗腫瘤作用,但由于COX相關毒性未進入市場。Chattopadhyay等〔14〕發現,阿司匹林(180 mg/kg)具有潛在的抗炎作用,同時可引起胃黏膜損傷。Ding等〔15〕發現塞來昔布也有胃黏膜損傷作用,并開發了人/小鼠特異性mPGES-1抑制劑作為抗炎藥,而且具有胃腸道安全性。

綜上,MK886及celecoxib均能抑制結腸癌HT-29細胞等增殖、遷移能力,且呈時間及劑量依賴性。腫瘤的發生是一個多因素、多步驟、多階段參與的復雜過程,不管是基因突變、炎癥致癌還是腫瘤干細胞學說都證明腫瘤的發生不是單一因素導致,無法從單一因素上完全解釋腫瘤發生發展的這一復雜過程,所以需要聯合多因素來進一步深入研究腫瘤進展的具體機制。炎癥反應伴隨著腫瘤進展的各個不同階段,有效控制炎癥反應或可有效地控制腫瘤發生發展及其通過何種機制來促進腫瘤進展仍需進一步研究。本實驗證實,通過5-LOX抑制劑來抑制AA的LOX途徑也可明顯抑制結腸癌細胞生長、增殖、遷移,但具體機制仍需深入研究。