銀杏葉提取物抑制miR-128-3p表達對阿爾茨海默病老齡大鼠的干預效果

李冬梅 朱偉民 楊佳梅 種寶貴

(衡水市人民醫院藥學部,河北 衡水 053000)

阿爾茨海默病常發生于老年前期和老年期,是一種神經退行性腦部疾病。相比于男性,女性患病率更高,臨床癥狀多為失語、記憶障礙、執行能力障礙、行為改變等。該病可能是一組異質性疾病,頭部外傷、家族遺傳、病毒感染、生活環境因素等均可能導致阿爾茨海默病的發生。尚無特效藥可以治愈該病,一些中醫治療方法可以緩解癥狀〔1,2〕。轉化生長因子(TGF)-β1可以調控細胞增殖、生長、凋亡。白細胞介素(IL)-1β是趨勢化因子的一員,驅動β-淀粉樣前體蛋白的合成,導致蛋白板塊產生,沉積在腦組織中。IL-6是一種炎癥因子,可調節多種細胞分化、生長,具有造血功能〔3,4〕。miR-128-3p參與調控機體炎癥、氧化應激等過程〔5〕。有研究發現,抑制Toll樣受體(TLR)4/核因子(NF)-κB通路可以控制腦皮質組織損傷,改善神經組織〔6〕。另有研究發現,銀杏葉提取物可改善血液流變性、保護中樞神經系統、保護心腦血管等〔7〕。本文探究銀杏葉提取物抑制miR-128-3p表達對阿爾茨海默病老齡大鼠的干預效果。

1 對象與方法

1.1研究動物 選取50只20月齡的SPF級Wistar大鼠,體質量315～485 g,由廣東至遠生物醫藥科技有限公司提供,動物許可證號:SYXK(粵)2021-0251,大鼠飼養于相對濕度為40%～60%,恒溫25 ℃的環境中。試驗操作均參照動物試驗倫理要求的相關規定,且經醫院倫理委員會批準同意。

1.2分組建模 隨機選取大鼠10只為正常組,其余40只大鼠參照陳虹茹等〔8〕研究建立阿爾茨海默病模型,正常組給予普通飼料喂養,阿爾茨海默病模型鼠給予高脂飼料(脂肪30%,蛋白質20%,碳水化合物50%)喂養,喂養1 w后每組隨機抽樣正常和模型鼠各2只,取海馬組織蘇木素-伊紅(HE)染色,發現模型鼠海馬組織胞體形狀不規則、出現大量細胞的核仁固縮為建模成功。建模成功后將阿爾茨海默病模型鼠分為模型組(13只)、低劑量組(12只)、高劑量組(13只)。

1.3給藥干預 建模分組后開始給藥。低劑量組給予銀杏葉提取物10 mg/kg灌胃,高劑量組給予銀杏葉提取物40 mg/kg灌胃,銀杏葉提取物由上海吉至生化科技有限公司提供(批號:G67840-25 g)。正常組和模型組給予等量的生理鹽水。以上各組均連續灌胃2 w。

1.4病理形態學觀察 采血后取海馬組織進行脫水、透明、包埋、制備橫切面石蠟切片,做HE染色,觀察光鏡下海馬組織的病理變化。

1.5TGF-β1、IL-1β、IL-6水平檢測 取老齡大鼠海馬組織,加入適量(1∶10)組織蛋白抽離液,充分碾碎,離心處理(離心半徑3 cm,轉速2 000 r/min,離心時間15 min),提取上清液,0 ℃保存待測,通過酶聯免疫吸附試驗(ELISA)對各組老齡大鼠TGF-β1、IL-1β、IL-6水平進行檢測。試劑盒由博輝生物科技(廣州)有限公司(產品貨號:EK-R36877)提供,重復實驗5次。

1.6miR-128-3p檢測 取老齡大鼠海馬組織,采用熒光定量PCR檢測miR-128-3p,具體步驟按照說明書嚴格進行,試劑盒由武漢益普生物科技有限公司(產品貨號:PPL01655-3a)提供。最后得到組織總RNA,用Nanodrop2000檢測RNA的濃度和純度,放置-80 ℃保存。進行逆轉錄,反應條件:97 ℃預熱8 min、95 ℃變性5 s、60 ℃退火31 s,共進行40個循環,采用2-△△Ct方法計算出miR-128-3p表達量,miR-128-3p上游引物:5′-AGGCTCACAGTGAACCGGTC-3′,下游:5′-CGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′,內參GAPDH上游引物:5′-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3′,下游:5′-TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG-3′。

1.7海馬組織中TLR4/NF-κB信號通路蛋白測定 通過Western印跡對海馬組織中的TLR4/NF-κB信號通路蛋白TLR4、NF-κB表達量進行檢測,按照12 000 r/min轉速離心,10 min后對總蛋白定量,取50 μg樣品與上樣緩沖液均勻混合,100 ℃下加熱5 min促使蛋白變性。凝膠電泳、轉膜、取膜、封膜,以1∶1 000比例使用0.05%～0.10% TBST稀釋一抗,加入鼠源性一抗(TLR4、NF-κB)后4 ℃孵育過夜,0.05%～0.10% TBST洗膜3次,加入1∶10 000的稀釋羊抗鼠二抗,晃動孵育1 h,做0.05%～0.10% TBST洗膜,二氨基聯苯胺(DAB)顯色,以GAPDH為內參照,定量分析蛋白表達情況。羊抗鼠二抗由深圳市安提生物科技有限公司提供(產品貨號:AT01IgGAb),重復實驗5次。

1.8統計學處理 采用SPSS19.0統計軟件進行方差齊性檢驗、獨立樣本t檢驗。

2 結 果

2.1阿爾茨海默病模型判定及各組海馬組織病理 如圖1所示,造模后病理切片顯示,正常組海馬組織細胞排列緊密,胞體呈卵圓形,排列有序,基本沒有核仁固縮現象;模型組海馬組織細胞排列松散,胞體形狀不規則,出現大量細胞的核仁固縮,細胞核明顯減小,空洞較大。低劑量組病變減輕,空洞明顯縮小。高劑量組海馬組織胞核明顯,組織形態基本正常,空洞較小。

圖1 各組海馬組織病理特征(HE染色,×400)

2.2各組海馬組織TGF-β1、IL-1β、IL-6比較 如表1所示,與正常組相比,模型組、低劑量組、高劑量組上述指標水平升高,具有統計學差異(P<0.05);與模型組相比,低劑量組、高劑量組上述指標水平降低,差異具有統計學意義(P<0.05);與低劑量組相比,高劑量組TGF-β1、IL-1β、IL-6水平降低,差異具有統計學意義(P<0.05)。

表1 各組海馬組織TGF-β1、IL-1β、IL-6比較

2.3各組海馬組織miR-128-3p比較 如表2所示,與正常組相比,模型組、低劑量組、高劑量組miR-128-3p水平升高;與模型組相比,低劑量組、高劑量組miR-128-3p水平降低;與低劑量組相比,高劑量組miR-128-3p水平降低,差異均具有統計學意義(均P<0.05)。

表2 各組海馬組織miR-128-3p及TLR4/NF-κB通路蛋白相對表達量比較

2.4各組海馬組織TLR4/NF-κB通路蛋白相對表達量 如表2、圖2所示,與正常組相比,模型組、低劑量組、高劑量組TLR4、NF-κB表達量升高,具有統計學差異(P<0.05);與模型組相比,低劑量組、高劑量組上述指標表達量降低,具有統計學差異(P<0.05);與低劑量組相比,高劑量組上述指標表達量降低,差異具有統計學意義(P<0.05)。

1～4:正常組、模型組、低劑量組、高劑量組圖2 各組海馬組織TLR4/NF-κB通路蛋白表達

3 討 論

阿爾茨海默病的發生與年齡相關,病理學特征包括神經元損傷,老年斑及大腦皮質細胞病理變化〔9,10〕。其病因較為復雜,不是由多個基因或單個基因引起,涉及了較多的信號通路,影響大腦功能、結構連接改變,也稱為“失連接綜合征”。有研究顯示,銀杏葉分離出的提取物具有抗性腦缺血、抗炎性反應、抗氧化、降血脂的功能,其作用機制有待更深的挖掘〔11〕。

TGF-β1對不同類型的細胞具有不同活性,可通過相同的受體信號通路發揮功能〔12〕。IL-1β可促進B細胞分泌和增殖抗體〔13〕。IL-6主要由B淋巴細胞、T淋巴細胞、巨噬細胞產生,是一種多效細胞因子〔14〕。微小RNA與記憶形成過程中的特定信號緊密相關,miR-128-3p能調節神經炎癥和神經性疼痛,與多種神經系統疾病有關〔15〕。本文研究提示,銀杏葉提取物可以改善腦皮質組織氧化應激,減輕神經功能受損、神經炎性反應。分析原因:提取物是從干燥的銀杏葉中分離純化的化合物,主要成分有萜類內酯和黃酮苷類,具有多靶點抗腦缺血作用,可使海馬谷氨酸遞質、線粒體功能改善,從而提高其記憶力。TLR4/NF-κB信號通路與多種炎癥因子調控有關,該通路介導了腦缺血神經元損傷〔16,17〕。TLR是參與天然免疫的重要蛋白分子,可以識別并激活機體產生免疫細胞答應。TLR4可以誘導中樞神經損傷、調控小膠質細胞〔18,19〕。NF-κB信號通路廣泛存在組織細胞內的核轉錄因子,在細胞的免疫答應、炎癥反應等過程中起到關鍵作用,其中NF-κB p65對調控靶基因轉錄有關鍵作用。NF-κB是眾多致病因子釋放的關鍵,許多細菌代謝產物和各種表面受體的活化會激活NF-κB通路〔20,21〕。本研究提示,銀杏葉提取物可能通過TLR4/NF-κB信號通路抑制神經炎癥反應,從而發揮保護神經作用,防治該疾病,表明TLR4/NF-κB信號通路與阿爾茨海默病的發展密切相關。

綜上,阿爾茨海默病發生后伴隨著神經元損傷、神經炎癥反應升高等表現,經過銀杏葉提取物干預后可以減輕海馬組織病變,減輕腦組織內炎性反應,經銀杏葉提取物抑制miR-128-3p后可使阿爾茨海默病臨床癥狀改善,其機制可能與抑制TLR4/NF-κB通路有關。