急慢性潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型的建立與比較研究

劉闖，李依林，左澤平，田穎穎，趙新月，呂英楠，徐意，張碩峰，王志斌，

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102401；2.北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠，北京 100071）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis,UC）是炎癥性腸病（inflammatory bowel disease, IBD）的亞型之一，是一種以結(jié)腸黏膜連續(xù)性、彌漫性炎癥改變?yōu)橹饕卣鞯穆苑翘禺愋匝装Y性疾病[1]，在臨床上具有難治愈、病程長、易復(fù)發(fā)等特點。流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，在全球范圍內(nèi)UC 的發(fā)病率呈上升趨勢，UC 的發(fā)病率和患病率在發(fā)達(dá)國家較高并趨于穩(wěn)定，在發(fā)展中國家較低但呈明顯上升趨勢。近年來，我國UC 門診就診人數(shù)呈增長趨勢[2]。為了探究UC 的發(fā)病機(jī)制并尋找能夠有效防止UC 的藥物，選擇理想的UC動物模型尤為重要。

目前常用的UC 臨床前研究動物模型主要包括化學(xué)誘導(dǎo)模型、免疫誘導(dǎo)模型、基因編輯模型以及中醫(yī)證候模型。其中化學(xué)誘導(dǎo)模型主要是通過化學(xué)試劑刺激誘導(dǎo)結(jié)腸黏膜損傷，進(jìn)而發(fā)生UC[3]。葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium salt，DSS）與噁唑酮（oxazolone，OXZ）是常見的2 種化學(xué)誘導(dǎo)劑，DSS 多通過自由飲水的方式進(jìn)行模型制備，OXZ 多通過致敏后聯(lián)合乙醇灌腸的方式誘導(dǎo)UC[4]。本研究通過DSS 誘導(dǎo)小鼠慢性UC 和OXZ 誘導(dǎo)小鼠急性UC兩種模型并進(jìn)行比較，以期能夠為UC治療方法及機(jī)制的研究提供理論和實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

SPF 級雄性C57/6N 小鼠24 只，8 周齡，體質(zhì)量22～24 g；SPF 級雄性Balb/c 小鼠30 只，8 周齡，體質(zhì)量22～24 g，均購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2021-0006，動物在室溫（23±2）℃、濕度40%～70%、12 h 晝夜交替環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。動物實驗經(jīng)北京中研同仁堂醫(yī)藥研發(fā)有限公司倫理審查委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：YJY-2022-082902，YJY-2022-110301）。

1.2 主要試劑

DSS（MP Biomedicals，0216011080）；4-乙氧基亞甲基-2-苯基-2-惡唑啉-5-酮（噁唑酮，Sigmaaldrich，E0753-10G）；無水乙醇（AR，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20211214）；TNF-α檢測試劑盒（SEA133Mu）、INF-γ檢測試劑盒（SEA049Mu）與IL-10 檢測試劑盒（SEA056Mu）均購自武漢云克隆科技股份有限公司。

1.3 主要儀器

BT 25 S 型萬分之一天平（賽多利斯）；ME3002精密天平（梅特勒-托利多）；BX53光學(xué)顯微鏡（日本Olympus）；VS200掃描儀（日本Olympus）。

2 方法

2.1 DSS誘導(dǎo)小鼠慢性UC模型[5]

C57/6N 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)后開始造模，分為對照組、模型組。模型組第1周1%DSS自由飲水，第2周到第3 周恢復(fù)小鼠正常飲水，第4 周更換為1%DSS自由飲水，第5 周到第6 周恢復(fù)正常飲水，第7 周更換為1%DSS 自由飲水。對照組始終給予正常動物飲水。期間每兩天進(jìn)行1 次稱重與疾病活動指數(shù)（DAI）評分（見表1）。第7周結(jié)束后，剖檢取材。

表1 DAI評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 DAI scoring criteria

2.2 OXZ誘導(dǎo)小鼠急性UC模型[6]

Balb/c 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分成對照組、模型組。模型組小鼠腹部剃毛，皮膚涂抹2.4%的OXZ（溶于無水乙醇）致敏劑0.2 mL，1 d 后重復(fù)涂抹1 次，實驗第5 天禁食不禁水24 h，第6 天將直徑2.5 mm的硅膠軟管插入結(jié)腸距肛緣約4 cm，緩緩注入0.8%的OXZ（溶于40%乙醇）造模劑0.1 mL，誘導(dǎo)制備UC 小鼠模型。對照組灌腸等量的生理鹽水。灌腸后每天進(jìn)行DAI 評分，評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。灌腸后1周進(jìn)行剖檢。

2.3 剖檢與取材

剖檢前一天禁食不禁水，異氟烷對小鼠進(jìn)行吸入麻醉后，腹主靜脈取血，置于EDTA 抗凝管中，完成血液學(xué)檢測后，離心分離上清于?80 ℃保存。取小鼠結(jié)腸（盲腸至恥骨聯(lián)合處）、心臟、肝臟、脾臟、胸腺、腎臟、全腦，測量或稱重后使用4%（φ）多聚甲醛進(jìn)行固定，或置于液氮中進(jìn)行凍存。剖檢過程中對結(jié)腸進(jìn)行拍照記錄測量結(jié)腸長度，取材后立即對各臟器進(jìn)行稱重記錄，計算臟腦系數(shù)[7]（以臟腦比記），公式如下：

2.4 ELISA檢測小鼠結(jié)腸勻漿中相關(guān)細(xì)胞因子

樣本前處理：準(zhǔn)確稱取小鼠結(jié)腸組織質(zhì)量，按質(zhì)量（g）∶體積（mL）＝1 g∶18 mL 的比例加入PBS，放入研磨珠，制備結(jié)腸組織勻漿，4 ℃，3 500 r/min離心20 min，分裝上清液于EP 管中。根據(jù)BCA、IL-10、TNF-α、IL-1β試劑盒說明書對結(jié)腸勻漿中相關(guān)細(xì)胞因子進(jìn)行檢測。

2.5 結(jié)腸組織病理檢查

所有結(jié)腸組織經(jīng)4%多聚甲醛充分固定后，經(jīng)取材修塊，梯度酒精脫水，石蠟包埋，切片厚度4 μm，HE 染色后光鏡檢查結(jié)腸橫截面組織病理學(xué)變化，記錄各組結(jié)腸橫截面。

2.6 統(tǒng)計分析

3 結(jié)果

3.1 一般狀態(tài)觀察

3.1.1 DSS 誘導(dǎo)小鼠慢性UC 模型 DSS 造模小鼠出現(xiàn)體質(zhì)量下降、稀便與便血的癥狀，癥狀出現(xiàn)一般在DSS 自由飲水的第3 天以后出現(xiàn)。圖1A、B 所示為DSS 造模小鼠體質(zhì)量與DAI評分變化。在第1次開始給予DSS 自由飲水后第10 天，模型組小鼠DAI 評分與對照組比較開始出現(xiàn)顯著差異（P＜0.01）。反復(fù)誘導(dǎo)期間，DSS 自由飲水后小鼠癥狀加重，更換為普通飲水，小鼠癥狀開始緩解。

圖1 兩種模型小鼠體質(zhì)量與DAI評分變化Figure 1 Changes of body weight and DAI score in two model mice(,n=12)

3.1.2 OXZ 誘導(dǎo)小鼠急性UC 模型 第2 次腹部涂抹OXZ 致敏后，小鼠出現(xiàn)明顯過敏反應(yīng)，表現(xiàn)為體質(zhì)量持續(xù)下降，毛色黯淡，耳廓表現(xiàn)出明顯紅腫。圖1C、D 所示為OXZ 造模中小鼠體質(zhì)量與DAI 評分變化。致敏后小鼠體質(zhì)量即開始下降，而DAI 評分無顯著變化。灌腸后，小鼠反應(yīng)明顯，當(dāng)天即出現(xiàn)黏液便與便血的癥狀，DAI 評分與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），灌腸后第3 天小鼠癥狀最為嚴(yán)重，期間出現(xiàn)造模小鼠死亡的情況，第4天以后造模小鼠癥狀逐漸開始恢復(fù)，但與對照組比較仍有顯著差異（P＜0.05）。

3.2 結(jié)腸大體觀察與臟器指數(shù)

剖檢過程中發(fā)現(xiàn)，DSS 誘導(dǎo)UC 小鼠結(jié)腸顯著縮短（P＜0.01），且可見明顯出血（圖2），模型組小鼠胸腺指數(shù)與腎臟指數(shù)與對照組比較出現(xiàn)顯著降低（P＜0.01），而脾臟指數(shù)出現(xiàn)了顯著升高（P＜0.01）。OXZ誘導(dǎo)小鼠急性UC模型中正常組小鼠結(jié)腸表面光滑，無充血水腫等表現(xiàn)，結(jié)腸內(nèi)有成形的糞便。OXZ 模型組病變以遠(yuǎn)端結(jié)腸為主，腸黏膜充血、水腫、潰瘍，并連續(xù)存在。對結(jié)腸長度進(jìn)行統(tǒng)計分析，模型組結(jié)腸長度與對照組比較顯著縮短（P＜0.01）。

圖2 兩種UC模型小鼠結(jié)腸大體觀察Figure 2 Gross observation of the colon in two UC model mice(,n=12)

免疫因素在UC 的發(fā)病中有重要的作用，脾臟與胸腺是重要的免疫器官。兩種模型中，模型小鼠的脾臟指數(shù)與對照組相比均顯著升高（P＜0.01），而胸腺指數(shù)與對照組比較均顯著降低（P＜0.01），表明DSS與OXZ對小鼠的免疫系統(tǒng)有一定的抑制作用。除此之外，與OXZ誘導(dǎo)小鼠急性UC 模型不同，DSS誘導(dǎo)小鼠慢性UC 小鼠的腎臟指數(shù)出現(xiàn)了顯著降低（P＜0.01），該現(xiàn)象可能是DSS 誘導(dǎo)小鼠慢性UC 的結(jié)腸外癥狀。見圖3。

圖3 兩種UC模型小鼠臟器指數(shù)Figure 3 Organ indices in two UC model mice(,n=12)

3.3 血液學(xué)檢查

在DSS 誘導(dǎo)小鼠慢性UC 模型中，與對照組比較，模型組白細(xì)胞計數(shù)（WBC）顯著升高（P＜0.01），說明機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)。模型組小鼠血液中的血小板計數(shù)（PLT）與血小板壓積（PCT）與對照組比較顯著升高（P＜0.01）。血液學(xué)檢查結(jié)果顯示，與對照組比較模型組小鼠血液中網(wǎng)織紅細(xì)胞百分比（%RETIC）顯著升高（P＜0.01），中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞（NLR）、血小板計數(shù)/淋巴細(xì)胞（PLR）顯著升高（P＜0.01）。見圖4。

圖4 血液學(xué)檢查結(jié)果Figure 4 Hematologic test results(,n=12)

在OXZ 誘導(dǎo)小鼠急性UC 模型中，模型組小鼠白細(xì)胞計數(shù)與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而模型組小鼠血液中的PLT、PCT 和%RETIC 與對照組相比顯著升高（P＜0.01）。模型組小鼠外周血NLR與PLR與對照組比較顯著升高（P＜0.05）。

3.4 ELISA檢測相關(guān)細(xì)胞因子

ELISA 檢測結(jié)果如圖5 所示，DSS 誘導(dǎo)慢性UC小鼠結(jié)腸組織勻漿中TNF-α水平和IL-10 水平與對照組比較均顯著升高（P＜0.01），IFN-γ水平顯著降低（P＜0.01）。在OXZ 誘導(dǎo)小鼠急性UC 模型中，小鼠結(jié)腸組織勻漿中TNF-α水平和IL-10 水平與對照組比較均顯著升高（P＜0.05），而IFN-γ水平出現(xiàn)下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖5。

圖5 ELISA法檢測相關(guān)細(xì)胞因子結(jié)果Figure 5 Results of ELISA assay for relevant cytokines(,n=12)

3.5 病理檢查

如圖6所示，在兩種模型中，對照組小鼠結(jié)腸黏膜層、黏膜下層、肌層和外膜各層形態(tài)清晰，結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞排列規(guī)則，腸道結(jié)構(gòu)完整，黏膜下層無水腫增厚，腸基部無淋巴細(xì)胞聚集和炎性細(xì)胞浸潤，腸隱窩排列整齊。模型組結(jié)腸組織病理表現(xiàn)有所不同，如圖6A 所示，DSS 誘導(dǎo)的慢性UC 小鼠結(jié)腸局部黏膜上皮脫落，上皮損傷，大量炎癥細(xì)胞浸潤至黏膜下層，腸腺明顯擴(kuò)張擴(kuò)大，腸隱窩數(shù)量明顯減少，腸黏膜下層水腫增厚，隱窩扭曲并萎縮。OXZ 誘導(dǎo)急性UC小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞消失和（或）上皮組織再生，杯狀細(xì)胞減少或消失，結(jié)腸黏膜增厚，黏膜不完整，細(xì)胞排列不規(guī)則，有大量紅細(xì)胞及炎性細(xì)胞浸潤，腸壁水腫，纖維化，且上述病理表現(xiàn)在灌腸后第2天即出現(xiàn)，第3或第4天最為嚴(yán)重，灌腸后第7天有所緩解，潰瘍面積減少且可見隱窩再生（見圖6B）。

圖6 結(jié)腸組織病理HE染色Figure 6 HE staining of colon histopathology

4 討論

DSS 常用于UC 發(fā)病機(jī)制研究及并發(fā)癥研究，OXZ常用于UC急性發(fā)作期藥物藥效研究[5?6]。DSS是一種具有抗凝血特性的化合物，能夠誘導(dǎo)結(jié)腸上皮損傷。通過調(diào)整DSS 的濃度以及給藥頻次可以實現(xiàn)誘導(dǎo)結(jié)腸急性、慢性以及復(fù)發(fā)的模型，具有操作簡單、成功率高以及可重復(fù)的特點。研究認(rèn)為DSS 對基底隱窩腸上皮細(xì)胞具有毒性，當(dāng)上皮損傷時，屏障完整性受損，隨后黏膜和黏膜下免疫細(xì)胞暴露于腔內(nèi)抗原（例如細(xì)菌抗原），導(dǎo)致快速出現(xiàn)明顯的炎癥免疫反應(yīng)。因此該模型常被用于研究腸道菌群和飲食等因素對結(jié)腸炎發(fā)病的影響以及固有免疫機(jī)制在黏膜炎癥發(fā)展和屏障完整性重建中的作用。DSS 是一種高分子化合物，無法穿過細(xì)胞膜且吸收不良，其作用僅限于結(jié)腸，而其他臟器所產(chǎn)生的損傷多由疾病本身造成，因此可用于研究UC疾病本身對其他臟器造成的傷害[8]。

噁唑酮是一種半抗原試劑，在小鼠直腸給藥后可引起嚴(yán)重的結(jié)腸炎。在OXZ 誘導(dǎo)的UC 模型中，固有層T 細(xì)胞產(chǎn)生的2 型和9 型細(xì)胞因子（IL-4、IL-5、IL-9 和IL-13）的升高與人類觀察到的UC 的特征相似。分泌IL-13 的自然殺傷T 細(xì)胞被認(rèn)為是疾病的重要觸發(fā)者，可能是通過CD1d 的抗原呈遞而激活。因此，該模型被用于研究腸道炎癥過程中與2型和9 型相關(guān)的免疫反應(yīng)。同時，較低劑量的OXZ也可能誘導(dǎo)混合Th1/Th2應(yīng)答[9]。

DSS 誘導(dǎo)小鼠UC 癥狀與臨床UC 患者癥狀一致。本研究過程中發(fā)現(xiàn)DSS 誘導(dǎo)慢性UC 的小鼠自由飲水5～7 d 成模，在自由飲水期間體質(zhì)量持續(xù)下降，出現(xiàn)稀便伴有明顯便血，血液學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)小鼠白細(xì)胞、血小板及免疫炎癥指數(shù)升高，病理檢查發(fā)現(xiàn)黏膜下層水腫增厚明顯，造模死亡率0%；OXZ 誘導(dǎo)急性UC 的小鼠灌腸當(dāng)天即出現(xiàn)癥狀，致敏期間體質(zhì)量下降，灌腸后前3 天體質(zhì)量下降，后逐漸恢復(fù)，黏液便明顯，造模初期可見便血，血液學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)小鼠白細(xì)胞變化不明顯，病理檢查發(fā)現(xiàn)腸壁變薄，造模第3 天病理損傷最為嚴(yán)重，造模死亡率約50%，而存活下來的部分動物可能由于造模程度較輕且恢復(fù)較快而在試驗周期內(nèi)就恢復(fù)，無法與藥物治療組進(jìn)行比較。在本研究中，出現(xiàn)OXZ 灌腸后，動物體質(zhì)量快速降低，部分動物由于機(jī)體損傷嚴(yán)重而死亡，出現(xiàn)動物死亡率較高的情況，而存活下來的部分動物可能由于造模程度較輕且恢復(fù)較快而在試驗周期內(nèi)就恢復(fù)，無法與藥物治療組進(jìn)行比較。因此使用該模型進(jìn)行藥理研究需要大量實驗小鼠，代價較高且可能會引發(fā)倫理問題。兩個模型小鼠均有脾臟指數(shù)上升，胸腺指數(shù)下降。

此外，在本研究預(yù)實驗中還利用Wistar 大鼠進(jìn)行造模，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大鼠OXZ 造模雖然也出現(xiàn)了體質(zhì)量下降及稀便的癥狀，但幾乎未出現(xiàn)便血的情況，從造模結(jié)果無法診斷其為UC，且動物恢復(fù)速度較快，所有造模動物均在1周內(nèi)恢復(fù)正常狀態(tài)，不再有任何臨床癥狀。因此，作者考慮可能通過少量多次給予OXZ 灌腸反復(fù)誘導(dǎo)小鼠UC，降低模型動物死亡率并維持模型動物臨床癥狀，使該模型能更加適用于藥物治療UC 的藥理學(xué)研究。在對UC 的機(jī)制研究和其治療藥物的臨床前研究中應(yīng)根據(jù)研究目的與實驗特點選擇合適的動物模型。