異尾次目寄居蟹總科線粒體基因組比較分析及系統發育研究

江婷琪 胡璧麟 張楠楠 汪凱欣 呂振明 龔 理

(浙江海洋大學海洋科學與技術學院, 海洋生物種質發掘與利用國家地方聯合工程研究中心, 舟山 316022)

異尾次目(Anomura)隸屬于節肢動物門(Arthropoda)軟甲綱(Malacostraca)十足目(Decapoda), 是一類體型介于蝦類和蟹類之間高度特化的甲殼動物。根據形態特征, 異尾次目可分為鎧甲蝦型(Squat lobster form)、蟹型(Crab-like form)和寄居蟹型(Hermit form)三個主要類群; 其中, 寄居蟹型又可以分為對稱寄居蟹型(Symmetrical hermit form)和不對稱寄居蟹型(Asymmetrical hermit form)。對稱寄居蟹型常見于門螯寄居蟹科(Pylochelidae)種類, 不對稱寄居蟹型多見于陸寄居蟹科(Coenobitidae)、擬寄居蟹科(Parapaguridae)和寄居蟹科(Paguridae)絕大多數種類。寄居蟹獨特的形態特征代表了甲殼動物從長尾類(Macrura)到短尾類(Brachyura)的過渡狀態, 因而在甲殼動物進化過程中占據十分重要的地位[1]。

雖然1802年Latreille就建立了寄居蟹總科(Paguridea), 但是該總科分類系統長期以來未有定論[2,3]。最初的研究把所有寄居蟹都歸于寄居蟹總科, 直至1957年, MacDonald等[4]提出將寄居蟹分為寄居蟹總科和陸寄居蟹總科, 其中寄居蟹總科包括石蟹科(Lithodidae)、擬寄居蟹科和寄居蟹科, 陸寄居蟹總科包括陸寄居蟹科和活額寄居蟹科(Diogenidae),該分類體系并未考慮澳洲寄居蟹科(Lomisidae) 的歸屬。McLaughlin[5]則認為澳洲寄居蟹科應該歸屬獨立總科, 同時提議廢除陸寄居蟹總科, 僅保留寄居蟹總科。Martin和Davis[6]支持僅設寄居蟹總科的觀點, 并新增門螯寄居蟹科。McLaughlin等[7]基于形態特征重建了寄居蟹總科系統發育樹, 提議將石蟹科獨立出來, 并將其歸于石蟹總科(Lithodoidea)。當前, 石蟹科到底歸于寄居蟹總科還是石蟹總科仍有爭議。由于螯蓋寄居蟹科(Pylojacquesidae)物種稀少(目前僅發現2屬2種), 直至2001年該科才被建立。至此, 寄居蟹總科包括擬寄居蟹科、寄居蟹科、陸寄居蟹科、活額寄居蟹科、門螯寄居蟹科和螯蓋寄居蟹科6科的分類系統正式確立。

雖然, 目前寄居蟹總科的分類系統被絕大多數學者所認可[8—10], 但是該類群內部分類及親緣關系仍具爭議。Richter和Scholz[3]首次基于形態特征分析了寄居蟹類的進化關系, 認為寄居蟹總科中除了最原始的門螯寄居蟹是并系群外, 其余種類均為單系群; 而當前絕大多數分子數據都支持活額寄居蟹科為并系群[11,12]。隨著寄居蟹科分子數據不斷增加, 越來越多的研究發現該科也為非單系群, 如寄居蟹科中的Pagurus longicarpus不與同屬物種聚為一支, 而是與寄居蟹科和石蟹科組成的姐妹支聚支[10,13],支持寄居蟹科的非單系性。此外, 寄居蟹和石蟹之間的進化關系也是甲殼動物系統進化學家關注的焦點[8,14,15]。因此, 開展寄居蟹總科系統分類學研究對異尾次目乃至整個甲殼類分類及系統演化具有重要意義。

線粒體基因組被廣泛應用于分子系統學研究,解決了很多長期以來備受爭議的分類鑒定及系統進化等問題。如傳統形態學認為沙蟹總科和方蟹總科是單系群, 但是越來越多的分子結果(包括線粒體基因組數據)顯示這兩個總科為并系群[16—19]。除了線粒體基因組序列本身外, 也有研究發現線粒體基因排序也可以為分子系統學提供有用信息。如Tan等[20]比較了已有異尾次目和短尾次目線粒體全序列后提出基因重排可以用于異尾次目系統發育研究, 如前期基于線粒體基因組序列構建的系統發育樹無法確定輝蝦屬(Aegla)(輝蝦總科)和澳洲寄居蟹屬(Lomis)(澳洲寄居蟹總科)之間的親緣關系,但是基因排序信息則顯示澳洲寄居蟹總科和柱螯蝦總科有著最近的親緣關系, 兩者再與輝蝦總科形成姐妹群關系, 隨后不斷有研究證實了這一觀點[12,13]。關于線粒體基因重排現象, 目前主要用串聯復制-隨機丟失(Tandem duplication and random loss)[21]、串聯復制-非隨機丟失(Tandem duplication and nonrandom loss)[22]和線粒體內重組(Intramitochondrial recombination)[23]等模型假說來解釋。

然而, 相比甲殼類其他類群, 研究人員對異尾次目線粒體基因組關注度明顯不足; 尤其是寄居蟹總科, 截2023年4月, GenBank數據庫中僅有16個物種的線粒體基因組全序列, 這極大阻礙了寄居蟹分子系統學研究發展。因此, 本研究以我國海域分布最廣泛的活額寄居蟹科物種作為研究對象, 以刺足真寄居蟹(Dardanus hessii)為代表種, 首次測定其線粒體基因組全序列, 并結合已公布的16個寄居蟹物種的基因組全序列, 對寄居蟹總科線粒體基因組序列特征及基因排序進行了比較分析, 同時構建了寄居蟹總科系統發育樹, 探究線粒體基因重排在系統進化研究中的適用性。本研究結果不僅豐富了寄居蟹總科的線粒體基因組數據, 同時為異尾次目分類及系統進化提供新的觀點和思路。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及測序

刺足真寄居蟹樣品采自浙江省舟山市桃花島,參考《中國海活額寄居蟹科分類學研究》[24]進行形態學鑒定。取約100 g肌肉組織利用二代測序技術進行線粒體基因組全序列測定(上海元莘生物醫藥科技有限公司)。測序前先使用插入片段大小為400 bp的VAHTS Universal Plus DNA文庫制備試劑盒構建基因文庫, 在Illumina NovaSeq 6000高通量測序平臺進行PE150測序; 使用NOVO Plasty[25]軟件對去除接頭的有效數據(Clean data)進行從頭組裝; 將鱗紋真寄居蟹線粒體基因組(GenBank登錄號: MW147148)作為種子序列進行序列延伸。為了評估二代測序的準確性, 研究還利用一代測序技術(Sanger測序)測定了線粒體COⅠ基因序列, 比較兩種測序方法得到的序列相似性。

1.2 線粒體基因組注釋和序列分析

基于MITOS Web Server[26]及tRNAscan-SE 1.21[27]預測結果, 利用Sequin軟件(version 15.10, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Sequin/)對新組裝的刺足真寄居蟹線粒體基因組進行注釋; 使用NCBI-BLAST對蛋白質編碼基因和核糖體RNA基因進行邊界分析; 控制區由于序列變異較大, 根據近緣種序列及其相鄰基因位置判斷。利用以下公式計算堿基的鏈不對稱性: GC-skew=(G-C)/(G+C); AT-skew=(A-T)/(A+T)[28]。使用 MEGA X軟件[29]計算核苷酸含量。從GenBank 數據庫中下載另外16種寄居蟹總科物種的線粒體COⅠ基因序列, 結合本研究測定的刺足真寄居蟹物種COⅠ序列, 利用軟件Clustal X 2.0[30]對這些序列進行比對, 并基于Kimura 2-parameter (K2P)參數替代模型計算17個物種COⅠ的遺傳距離, 利用軟件MatGAT 2.02[31]進行多序列相似性比較分析。

1.3 線粒體基因組比較分析

以刺足真寄居蟹線粒體基因組作為參考序列,用CGView Comparison Tool (CCT)[32]軟件對所有17種寄居蟹總科物種線粒體基因組序列進行比較,同時用Mauve v2.4.0[33]軟件對其進行共線性分析。采用CREx[34]軟件預測基因重排事件, 基因重排包括倒置(R)、移位(T)和倒置移位(RT)三種類型。

1.4 系統發育分析

從GenBank數據庫下載目前已有16種寄居蟹總科物種線粒體基因組全序列, 加上本研究新測定的刺足真寄居蟹基因組, 以方蟹總科的側足厚蟹(Helice latimera)和伍氏擬厚蟹(Helicana wuana)為外類群, 基于13個蛋白質編碼基因, 使用PhyloSuite[35]同時構建寄居蟹總科最大似然樹(ML)和貝葉斯樹(BI)。最大似然樹使用IQ-TREE構建, 其中bootstrap設置為Ultrafast, Num of bootstrap設置為100000,抽樣次數為1000。貝葉斯樹使用MrBayes構建, 使用4條蒙特卡羅馬爾可夫鏈(Markov Chain Monte Carlo, MCMC)同時運行2000000代, 抽樣頻率為1000, 摒棄25%的老化樣本。

2 結果

2.1 刺足真寄居蟹線粒體基因組序列特征

刺足真寄居蟹線粒體基因組全序列長度為17821 bp(GenBank登錄號OP930882), 包含37個基因(13個蛋白質編碼基因, 22個tRNA和2個rRNA基因)和1個控制區。13個蛋白質編碼基因總長為11183 bp, 共編碼3716個氨基酸。所有蛋白質編碼基因均以典型的ATN作為起始密碼子; 除ND5和ND6基因以T作為終止密碼子外, 其余蛋白質編碼基因以TAA或TAG作為終止密碼子(表1)。tRNA基因分散在整個線粒體基因組中, 22個tRNA的總長度為1471 bp。16S rRNA位于ND1和tRNA-Val之間, 長度為1393 bp;12S rRNA位于tRNA-Val和CR之間, 長度為798 bp。雖然線粒體基因組各基因排列非常緊湊, 但是在刺足真寄居蟹基因組中23處共發現270 bp的基因間隔區, 其中最長的為75 bp, 介于tRNA-His和ND4之間。當然, 同時也在5處發現了累計15 bp的重疊區域, 最長的重疊區為7 bp, 位于ND4和ND4L之間(表1)。

表1 刺足真寄居蟹線粒體基因組特征Tab.1 Features of the mitochondrial genome of D.hessii

2.2 寄居蟹總科物種線粒體基因組比較分析

用CCT軟件對17種寄居蟹總科的線粒體基因組進行了比較分析, 結果顯示, 17個物種的線粒體基因組都發生了基因重排, 且基因排序和序列相似性都相對保守。除控制區和16S rRNA部分序列有較大變異外, 其余基因相似性普遍高于82%, 尤其是COⅠ和COⅢ基因在所有寄居蟹物種線粒體基因組中十分保守(圖1)。

COⅠ基因作為最常用的DNA條形碼, 在物種分類鑒定有著廣泛的應用。因此本研究計算了17種寄居蟹總科物種的COⅠ基因遺傳距離及其序列相似性。結果顯示, 日本寄居蟹(Pagurus japonicus)和長腕寄居蟹(Pagurus filholi)間的遺傳距離最小(0.005), 二者對應的序列相似性也最高(99.5%), 表明兩者很有可能為同一物種; 最大的遺傳距離出現在Pagurus longicarpus和灰白陸寄居蟹(Coenobita rugosus)之間(0.292), 對應的序列相似性為75.7%。本研究新測定的刺足真寄居蟹和同屬的紅星真寄居蟹(Dardanus asperses)及鱗紋真寄居蟹(Dardanus arrosor)的遺傳距離最小, 分別為0.203和0.204, 序列相似性分別為82.1%和82.0%。

研究還對17種寄居蟹總科物種的線粒體基因組共線性進行了比較分析, 軟件分析顯示, 所有寄居蟹物種線粒體基因組均可分為5個大的保守區域(圖2, A—E), 其中區域A(P-ND1-16S rRNA) 的位置和長度在所有寄居蟹物種線粒體基因組中都是最保守的, 區域B的位置和長度變異最大, 其余3個區域則相對保守。值得注意的是毛氏門螯寄居蟹(Pylocheles mortensenii) 基因組中的區域B(12S rRNA)發生了倒置, 由輕鏈編碼變成了重鏈編碼, 而在其余16種寄居蟹總科物種線粒體基因組均仍由輕鏈編碼; 此外, 區域E (T-ND6-Cytb-S2) 在紅星真寄居蟹基因組中發生了較明顯的移位, 而其在其余16種寄居蟹總科物種線粒體基因組中位置十分保守。

圖2 17種寄居蟹總科物種線粒體基因組共線性分析Fig.2 Collinearity analysis of 17 Paguroidea mitogenomes

進一步分析發現17種寄居蟹總科物種的線粒體基因組共分為4種共線性類型, 其中7種寄居蟹科物種共享一種共線類型(1—7); 5種陸寄居蟹科和3種活額寄居蟹科物種共享一種共線類型(8—15);活額寄居蟹科的紅星真寄居蟹獨享一種共線類型(16), 與該科其他3個物種線粒體基因排序明顯不同, 表現在紅星真寄居蟹基因組中T-ND6-Cytb-S2移位至R-N-E基因簇下游, 而在5種陸寄居蟹和3種活額寄居蟹基因組中, 該區域移位至ND4L下游;門螯寄居蟹科的毛氏門螯寄居蟹獨享一種共線類型(17), 該類型與其他3種類型最大的區別是12S rRNA發生了倒置。

2.3 線粒體基因重排分析

與泛甲殼動物(Pancrustacea) 線粒體基因組原始基因排序(Type 0)相比, 刺足真寄居蟹基因順序經歷了大規模的重排, 共有6處基因或基因簇位置發生了顯著變化, 涉及到12個tRNA基因(L2、G、A、S1、P、L1、I、Q、M、W、C和Y)和2個蛋白質編碼基因(ND3和ND2)。在這6處重排中, 包含了倒置移位(RT)和移位(T)兩種重排類型。單個的L2和L1基因、G-ND3-A-S1和W-C-Y基因簇發生了倒置移位, 單個的P基因和I-Q-M-ND2基因簇僅發生移位,未發生倒置; 其中L2基因由重鏈編碼倒轉至輕鏈,同時從COⅠ基因下游移至G基因的下游(圖3 ①);G-ND3-A-S1基因簇也是由重鏈編碼倒轉至輕鏈, 變成了S1-A-G-ND3排序, 位置從COⅢ基因的下游移至了控制區(CR)的下游(圖3 ②);P基因未發生倒置, 僅發生位置上的變化, 從T基因的下游移至S2基因的下游(圖3 ③);L1基因則由輕鏈編碼倒轉至重鏈, 位置從ND1基因的下游移位至COⅠ基因的下游(圖3 ④);I-Q-M-ND2基因簇僅位置發生變化, 其被分為兩部分, 其中I-M-ND2整體移至K基因的下游, 且I和M的前后位置發生了互換, 形成了M-IND2排序,Q基因則移至線粒體基因組的線性末端位置(圖3 ⑤); 最后一處重排發生在W-C-Y基因簇,其中W和Y基因發生了倒置移位, 形成了新的Y-WC排序(圖3 ⑥)。

圖3 寄居蟹總科物種線粒體重排類型(A) 及寄居蟹總科系統發育關系(B)Fig.3 Mitochondrial rearrangement types of species of Paguridea (A) and phylogenetic relationship of Paguridea (B)

研究進一步比較了所有寄居蟹總科物種線粒體基因排序, 結果顯示17種寄居蟹總科物種線粒體基因組表現出7種不同類型的基因重排, 其中寄居蟹科物種線粒體基因組貢獻了4種基因重排類型(圖3Ⅰ—Ⅳ); 所有陸寄居蟹科物種和3種活額寄居蟹科共享一種重排類型(圖3Ⅴ); 活額寄居蟹科的紅星真寄居蟹和門螯寄居蟹科的毛氏門螯寄居蟹各自獨享一種重排類型(圖3Ⅵ和Ⅶ)。相比其余3種基因排序(圖3Ⅴ—Ⅶ) 之間的差異, 寄居蟹科中4種基因重排類型(圖3Ⅰ—Ⅳ) 內部差異顯得很小,僅在AIMD基因簇排序、H及V的位置上有差異。活額寄居蟹科具有兩種不同的基因重排類型(圖3Ⅴ和Ⅵ), 兩者之間差異僅體現在T-ND6-Cytb-S2基因簇的位置, 包括大部分活額寄居蟹科在內的寄居蟹總科物種T-ND6-Cytb-S2基因簇位于ND4L基因下游, 僅在活額寄居蟹科的紅星真寄居蟹基因組中位于R-N-E基因簇下游。門螯寄居蟹科基因排序(圖3Ⅶ)最大的不同在于12S rRNA的編碼鏈, 在其余6種基因重排類型中, 12S rRNA均由輕鏈編碼, 而該基因在門螯寄居蟹科線粒體基因組中發生了倒置, 由輕鏈編碼轉為重鏈編碼, 與線粒體基因組共線性分析結果一致。

2.4 系統發育分析

本研究基于13個蛋白質編碼基因的核苷酸序列同時構建了寄居蟹總科最大似然樹(ML tree)和貝葉斯樹(BI tree), 結果顯示兩種方法構建的系統發育樹具有相同的拓撲結構; 因此, 本研究只顯示其中一種樹, 節點處同時標記出貝葉斯后驗概率和最大似然樹自展值。系統樹顯示本研究新測定的刺足真寄居蟹跟鱗紋真寄居蟹及紅星真寄居蟹聚為一支, 表明這三者親緣關系很近, 組成了活額寄居蟹科的一部分; 然而, 活額寄居蟹科的另一個物種, 下齒細螯寄居蟹并沒有與同科的3個物種聚在一起, 而是先與陸寄居蟹科聚為一支, 再與3種活額寄居蟹科物種形成姐妹群, 表明活額寄居蟹科為非單系群。寄居蟹總科內部親緣關系為活額寄居蟹科與陸寄居蟹科形成姐妹群后再與寄居蟹科聚在一起, 最后與門螯寄居蟹科聚支。需要提醒的是,NCBI數據庫中長腕寄居蟹(LC222528)與日本寄居蟹(LC222532)的線粒體基因組序列可能來自同一物種, 與COⅠ遺傳距離和序列相似性結果一致。兩者形態上有較大差異(如楯部比例、螯上小刺或短剛毛等), 暗示其中至少有一個物種鑒定有誤。

3 討論

異尾次目分類及演化是進化系統學備受關注的科學問題。然而, 該類群分類及內部親緣關系長期以來一直缺乏定論[8,15,36,37]。隨著測序技術的飛速發展及測序成本的不斷降低, 線粒體基因組全序列在分類鑒定、系統進化和適應性進化等領域解決了很多備受爭議的難題[16,20,38]。本研究基于17種寄居蟹總科物種13個線粒體蛋白質編碼基因序列重建了寄居蟹總科系統發育關系, 結果顯示活額寄居蟹科與陸寄居蟹科親緣關系最近, 兩者形成姐妹群后再與寄居蟹科聚為一支, 最后與門螯寄居蟹科聚在一起; 該聚類關系與絕大多數分子系統樹結果一致[12,20,39,40]。雖然, 本研究也支持了活額寄居蟹科的非單系性, 但是值得注意的是造成該科非單系的關鍵物種, 下齒細螯寄居蟹與陸寄居蟹科的關系與前人研究結果略有區別。在近期的異尾次目系統發育研究中, 陸寄居蟹科先與大多數活額寄居蟹科聚支后再與下齒細螯寄居蟹聚在一起[11], 而本研究并入刺足真寄居蟹后則顯示陸寄居蟹科先與下齒細螯寄居蟹聚為一支, 再與大多數活額寄居蟹科聚在一起, 該結果與Tsang等[41]基于5個核蛋白編碼基因構建的寄居蟹總科系統發育關系一致。不難發現下齒細螯寄居蟹在系統樹中的位置并不完全穩定, 今后可增加活額寄居蟹科和寄居蟹科代表種數量進一步厘清這兩個科的親緣關系。

脊椎動物線粒體基因組排序相對穩定, 發生重排的概率較低。而在無脊椎動物線粒體基因組中,線粒體基因重排現象相對較多。以甲殼動物十足目為例, 目前已發現相手蟹科(Sesarmidae)、溪蟹科(Potamonidae)、寶石蟹科(Mithracidae)、寄居蟹科、陸寄居蟹科和活額寄居蟹科等20余科物種線粒體基因組發生顯著重排[16,42,43]。用于解釋線粒體基因重排的機制主要有串聯復制隨機丟失模型、串聯復制非隨機丟失模型和線粒體重組等[23,44]。本研究中寄居蟹總科線粒體基因組呈現7種不同的基因排序, 涉及倒置移位和移位兩種重排類型。線粒體重組是最常用于解釋倒置現象的模型, 已廣泛用于解釋包括魚類[45]、爬行類[46]、昆蟲[47]和甲殼類[10]等在內多種生物類群基因倒置現象。如半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)線粒體基因組中Q基因由輕鏈編碼轉為重鏈編碼, 這是魚類線粒體基因組中首例基因倒置現象, 研究采用線粒體重組模型對Q基因倒置進行了重排推演[40,42]。本研究中的倒置現象同樣也可以用重組模型來解釋。如在泛甲殼動物線粒體基因組(Type 0)中為V-12S排序, 兩者均由輕鏈編碼; 而在毛氏門螯寄居蟹基因組(TypeⅦ)中變為12S-V排序, 且由輕鏈編碼轉為重鏈編碼。可能的重排過程為:V的5′端和12S的3′端同時斷裂, 形成一個自由的V-12S片段, 該片段在重新連接時發生鏈倒置, 變成12S-V排序, 且由原來的輕鏈編碼變為重鏈。線粒體重組模型在其他物種類似的倒置現象中也得到廣泛應用[38,39]。線粒體基因移位是十分常見的基因重排現象, 常用串聯復制隨機丟失模型和串聯復制非隨機丟失模型來解釋。兩種模型最大的區別在于復制后的基因被刪除的方式, 前者為隨機刪除, 后者則取決于基因的轉錄極性和位置, 其刪除后的結果是具有相同極性的基因(由同一鏈編碼的基因)聚在一起。本研究中寄居蟹總科重排基因是散狀分布在基因組中, 而不是按相同極性聚在一起, 因而綜合重排基因序列特征及CREx軟件預測結果, 我們認為串聯復制隨機丟失模型是用來解釋寄居蟹總科線粒體基因組產生大規模基因重排現象最合理的假說。

研究還分析了寄居蟹總科線粒體基因排序跟系統進化之間的關系。寄居蟹科雖然擁有4種不同的基因重排類型(Type Ⅰ—Ⅳ), 但是整科物種還是聚為一支, 形成一個單系群(Clade Ⅰ)。陸寄居蟹科和活額寄居蟹科中3個物種共享同一種重排類型(Type Ⅴ), 它們最先聚為一支, 暗示基因排序一定程度上能夠反映系統進化信息[40,43]。但是值得注意的是活額寄居蟹科中鱗紋真寄居蟹先與基因排序具有較大區別的紅星真寄居蟹聚類, 兩者形成姐妹支后再與具有相同基因排序的刺足真寄居蟹聚在一起, 這又與相同基因排序優先聚類的現象相矛盾。造成該“矛盾”現象的原因是紅星真寄居蟹基因重排并未對線粒體基因序列產生大的影響, 因而在基于線粒體序列構建系統發育關系時, 物種親緣關系并未按基因重排類型進行聚類。因此, 基因排序是否適用于系統進化分析應當視具體情況而定;即當基因重排會對序列本身產生較大影響時, 重排信息可能會成為一種理想的分子標記; 反之基因重排可能不適用于系統進化分析。