A族鏈球菌體內耐受β-內酰胺類藥物的機制研究進展

郭孟楊 綜述 姚開虎 審校

（國家兒童醫學中心/首都醫科大學附屬北京兒童醫院/北京市兒科研究所微生物研究室/國家呼吸系統疾病臨床醫學研究中心/教育部兒科重大疾病研究重點實驗室，北京 100045）

A族鏈球菌（group AStreptococcus,GAS）可導致多種臨床疾病，包括咽炎、猩紅熱、膿皰病、蜂窩織炎在內的非侵襲性急性疾病，亦包括壞死性筋膜炎和鏈球菌中毒性休克綜合征等侵襲性疾病。此外，感染GAS 還可引起免疫介導性疾病，如急性風濕熱（acute rheumatic fever,ARF）、風濕性心臟病、鏈球菌感染后腎小球腎炎等，嚴重影響人體健康［1］。目前尚無針對GAS 的疫苗投入臨床應用，其感染治療主要依靠抗菌藥物［2］。青霉素作為一線藥物治療GAS 疾病已有80 余年，體外試驗還從未確認過有對青霉素耐藥的GAS 菌株，指南或共識目前仍推薦使用青霉素等β-內酰胺類藥物治療GAS 感染［3-4］。但是，自20 世紀50 年代開始，便時有青霉素治療GAS感染失敗的報道［5］。關于GAS 體內耐受β-內酰胺類藥物的機制至今尚無定論，研究者從不同方面對這一現象產生的原因進行了假設和研究。本文就GAS 體內耐受β-內酰胺類藥物的現象及可能機制進行回顧和總結，以期引起國內同行對相關情況的重視，為臨床用藥和后續研究提供參考。

1 GAS體內耐受β-內酰胺類藥物的現象

至今為止，β-內酰胺類藥物治療GAS 感染失敗的主要臨床報道見表1。Markowitz 等［6］回顧了1953—1993 年間報道的青霉素治療GAS 所致咽扁桃體炎失敗的情況，經咽拭子細菌培養證實，為期10 d 的口服青霉素治療失敗率為19.1%～21.7%。Gastanaduy 等［7］研究發現，對于GAS 所致咽喉炎患者，依據細菌培養結果，口服或肌注青霉素治療的失敗率為25%左右，且治療失敗組的抗鏈球菌溶血素O 和抗鏈球菌DNA 酶B 的滴度在治療前高于治療成功組，可能該類患者發病前為GAS 攜帶者，而青霉素對處于增殖活躍期的細菌清除效果更好，治療失敗（細菌清除失敗）或許與是否為GAS 攜帶狀態有關［12］。當GAS 所致咽炎治療不及時或不徹底時，或會引起風濕熱、心內膜炎、腦膜炎等危及生命健康的嚴重疾病。有研究發現，GAS 咽部和皮膚感染或攜帶狀態會增加ARF 的發病風險，但應用β-內酰胺類、大環內酯類和磺胺類等抗生素并不能降低該風險，尚不能確定其是否與藥物不能徹底清除感染或攜帶菌有關［13］。近幾十年來，時有β-內酰胺類藥物治療GAS 感染失敗的相關報道，雖然各研究中關于治療失敗的判定標準不一，但用藥后未徹底清除體內GAS 的現象基本一致，該現象及其背后的機制值得關注。

表1 β-內酰胺類藥物治療GAS感染失敗的情況

2 GAS體內耐受β-內酰胺類藥物的機制

關于β-內酰胺類藥物治療GAS 感染/清除體內GAS 失敗的原因，研究者提出了不同觀點。總結既往文獻，可從致病菌株的藥物敏感性和其他作用兩個方面進行考慮：一是GAS 菌株對β-內酰胺類藥物敏感性降低；二是其他微生物與藥物在人體內發生相互作用，或菌株在機體內出現不同于體外試驗的其他特性，如持留性（persistence）、產生生物膜的能力等，使得GAS無法被完全清除。

2.1 GAS對青霉素敏感性降低及其機制

已有研究報道了對β-內酰胺類藥物敏感性降低的GAS 菌株［14-19］。目前，美國臨床和實驗室標準協會（Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI）只有GAS 對青霉素敏感的判定界值（MIC≤0.12 μg/mL 為敏感），沒有GAS 對青霉素中介或耐藥的判定界值［20］。與CLSI 不同，歐洲抗菌藥物敏感性試驗委員會（European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing,EUCAST）關 于GAS 體外藥敏試驗結果的判讀包括敏感和耐藥而無中介的標準，具體標準如下：敏感為MIC≤0.125 μg/mL（腦膜炎）、MIC≤0.25 μg/mL（非腦膜炎）；耐藥為MIC>0.125 μg/mL（腦膜炎）、MIC>0.25 μg/mL（非腦膜炎）［21］，且有系統綜述表明并未有以此為判定標準的耐藥菌株報道［14］。

尚未見確證的青霉素耐藥GAS 菌株的報告，但青霉素最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration,MIC）升高的GAS 菌株時有出現［14］。Vannice等［15］發現2株GAS菌株對氨芐青霉素、阿莫西林和頭孢噻肟的MIC值升高，分別為0.25 μg/mL、0.25 μg/mL、0.06 μg/mL，比對照菌株的MIC 值高3～6倍，且其青霉素結合蛋白2x（penicillin binding protein 2x,PBP2x）發生了Thr553Lys 氨基酸替換。美國一項多中心研究報道，GAS菌株中PBP2x存在Pro601Leu 氨基酸替換的青霉素MIC 值（0.023～0.032 μg/mL）是野生型GAS 菌株（0.012 μg/mL）的2～3 倍；具有Phe599Tyr 和Gly600Asp 雙氨基酸替換的GAS 菌株青霉素MIC 值（0.023 μg/mL）大于或等于僅具有Gly600Asp氨基酸替換的GAS菌株青霉素MIC 值（0.016 μg/mL），雙氨基酸替換可能對MIC 值的增加具有累積效應。以上研究提示PBP2x中某些氨基酸替換導致GAS菌株對β-內酰胺類藥物的敏感性降低，且有報道提出該種現象在GAS流行的emm型別中更常見［16］。有研究亦證明，具有停乳鏈球菌似馬亞種（Streptococcus dysgalactiae subspecies equisimilis,SDSE）4 Kb 重組基因片段的PBP2x 嵌合體可導致GAS 在體外試驗中對β-內酰胺類藥物敏感性降低，且經相同劑量的青霉素治療之后，感染突變菌株的壞死性肌炎小鼠四肢的細菌載量更高［17］。1995—2016 年冰島一項對1 515株耐紅霉素GAS菌株的研究發現，具有Met593Thr氨基酸替換的GAS菌株青霉素和氨芐青霉素MIC 值（青霉素：0.023 μg/mL，氨芐青霉素：0.032 μg/mL）是野生型GAS 菌株（青霉素：0.012 μg/mL，氨芐青霉素：0016 μg/mL）的2 倍［18］。2015—2021 年美國一項涵蓋侵襲性GAS感染菌株的研究發現，具有PBP2x 中Thr553Lys 氨基酸替換的GAS 菌株，其氨芐青霉素和阿莫西林MIC 值是無此替換菌株的5～10 倍，提示PBP2x 的氨基酸改變與GAS 對β-內酰胺類藥物（氨芐青霉素、青霉素G、頭孢噻肟、頭孢西丁和美羅培南等）敏感性降低有關［19］。

細菌外排泵亦與耐藥性密切相關，有研究發現，青霉素不敏感GAS 菌株中編碼外排泵相關的基因表達上調，但同時與蛋白質合成和菌細胞生長相關的基因表達下調，這亦表明GAS 菌株對青霉素產生抗性也需付出一定的生存代價［22］。

實際臨床工作中普遍以CLSI 或EUCAST 規定的標準判定GAS 菌株是否耐藥/不敏感，而該標準的制定以患者臨床療效為參考，雖然青霉素對于大部分GAS 感染仍有較好療效，且CLSI 無GAS 對青霉素中介或耐藥的判定界值，無法確定“耐藥株”，但近年來不斷有關于青霉素MIC 值增加的GAS菌株的報道［14-19］，MIC值增加提示菌株具有耐藥傾向，需要警惕體外試驗耐藥菌株的出現。

2.2 接種效應

接種效應（inoculum effect）指體外試驗中當細菌接種量高于藥敏試驗使用量時，抗菌藥物對其抗菌活性減弱的現象［23］。當抗生素殺死細菌并破壞細菌細胞壁時，死亡菌體釋放出能破壞抗生素的酶，從而減少抗生素進入仍存活細菌的濃度，產生接種效應。雖然GAS 不產生β-內酰胺酶，但近年來研究表明其亦存在對青霉素的接種效應。Eagle［5］在20世紀50年代發現，若給小鼠接種GAS后24 h 內給藥或細菌接種量低于107CFU/mL，則青霉素治療通常有效，若GAS 接種濃度達到107～108CFU/mL，則細菌清除效果不佳，認為此現象可能與細菌處于不同生長周期有關。不同生長周期的GAS 表達青霉素結合蛋白（penicillin binding protein,PBP）的量不同，給小鼠接種GAS 24～48 h后，其PBP表達量明顯低于前24 h，青霉素主要與PBP結合以達到抗菌效果，因此青霉素治療GAS失敗或與用藥開始的時間有關［23］。有研究表明，GAS菌株對青霉素的接種效應明顯，即在高細菌密度和生長平臺期，細菌對青霉素的敏感性明顯降低［24］。采用中空纖維感染模型（可體外模擬體內感染）研究發現，輸注青霉素減少GAS 菌落數量的幅度與首次接種劑量有關，在青霉素20 mg/q4h 的相同給藥方案下，高劑量接種組的細菌量減少幅度較小；青霉素連續輸注24 h后，接種效應最為顯著，此后再應用青霉素降低細菌量的作用沒有前24 h用藥作用明顯［24］，此現象與不同增殖期GAS 的PBP 表達量不同的研究結果一致［23］，這些研究突顯了早期治療的必要性。

2.3 共存細菌的作用

處于同一環境中的其他細菌產生β-內酰胺酶對GAS 可提供間接保護作用。有研究發現，應用阿莫西林治療GAS 引起的咽扁桃體炎時，在患者咽部檢測到了耐阿莫西林的流感嗜血桿菌，其分泌包裹β-內酰胺酶的外膜囊泡對GAS具有保護作用，在肉湯培養基中分別加入724 μg/mL 和1.2 mg/mL的外膜囊泡蛋白時，GAS阿莫西林MIC值從原來的0.016 μg/mL升至4 μg/mL和16 μg/mL，且用β-內酰胺酶抑制劑克拉維酸鹽處理后，該種保護作用消失［25］。該研究表明感染部位其他菌群分泌的包裹β-內酰胺酶的外膜囊泡與β-內酰胺類藥物治療GAS感染失敗有關。

Geyrhofer 等［26］認為，菌群存活與菌群死亡率及抗生素清除率均有關。首先，一部分細菌因暴露于抗生素而死亡，同時，存活細菌會產生分解或滅活抗生素的酶，從而降低抗生素濃度，當抗生素濃度在所有細菌被清除前降低到某一不足以殺死細菌的濃度或以下時，則會有抗性菌群的存活，要有抗性細菌存活就需達到最小接種量。產β-內酰胺酶共存細菌要產生GAS 保護作用也必需達到一定的接種量，即這些在GAS 感染部位共存的其他菌群數量與其為GAS提供的保護作用有關。

有研究發現，雖然大腸桿菌單獨存在時對氨芐青霉素敏感，但當與非耐藥枯草芽孢桿菌共存時，其可免受氨芐青霉素的清除，并對其他細菌的生長產生抑制作用［27］。該種現象的具體機制尚不明確，GAS 感染患者感染部位的非耐藥共存菌是否會導致其免受β-內酰胺類藥物的清除需要進一步的調查研究。

2.4 細菌持留性及生物膜的形成

細菌的持留性在抗生素治療失敗中也扮演了重要角色。2018 年，歐洲分子生物學組織定義了細菌“持留性”，即細菌一個細胞亞群在殺菌性抗生素治療中存活下來，但其并沒有產生耐藥性，且當無抗生素時，其恢復增殖并保持藥物敏感性的特性。抗生素誘導是細菌產生持留性的觸發因素之一，誘導產生具有持留性菌群的MIC 值并無改變，但其最低殺菌濃度（minimum bactericidal concentration,MBC）值高于其他菌群。這可以解釋為何青霉素治療對藥物敏感的GAS 感染仍會失敗的情況［28］。有研究表明，GAS 被接種到非生物表面形成高細菌負荷的團聚狀態（生物膜樣環境）時具有形成持留性的能力，并證明此現象與外排泵和菌細胞自身生長停滯有關［22］。臨床中嚴重GAS 感染患者即使接受了正規青霉素治療，但由于感染部位可達高細菌載量形成生物膜樣環境，產生的持留性細菌無法被清除，可能會因此導致治療失敗。

生物膜與抗生素不能清除GAS 密切相關。無癥狀患者口咽部的GAS 攜帶狀態與生物膜形成相關，皮膚和咽部的GAS 感染部位均可發現生物膜［29］。不同于MIC及MBC，清除生物膜中的細菌，藥物需要達到最低生物膜根除濃度（minimum biofilm eradication concentration value,MBEC）。生物膜可使GAS對青霉素的耐受性提高2 500～5 000倍。有研究發現，應用外切糖苷酶去除咽細胞（pharyngeal cell）的聚糖物質后，其表面所形成的GAS生物膜MBEC是未處理咽細胞表面GAS生物膜的2 倍余，說明聚糖物質可降低GAS 生物膜MEBC，增加生物膜中GAS 對青霉素的敏感性［30］。此外，亦有研究證明精氨酸脫亞氨酶（arginine deiminase,ADI）促進細菌生物膜的形成［31］。若能以咽細胞表面聚糖為基礎，研發具有相似結構或抑制ADI途徑的藥物，將其與青霉素聯用或可避免治療失敗。

2.5 GAS可內化入細胞

通常將GAS 定義為胞外菌，但它亦會侵入細胞并在胞內持續存在，以躲避免疫清除和抗生素作用［32］。研究表明，鏈球菌可通過多種機制粘附并內化（internalization）入細胞［33］。青霉素脂溶性較低，對人體細胞膜的透過率低，不能有效清除胞內菌。內化入胞的GAS 免受青霉素清除，可引起反復感染和無癥狀的咽部攜帶狀態［34］。喹諾酮類抗生素在細胞內與細胞外濃度的比值，比β-內酰胺類抗生素高約8倍，具有較強的組織細胞滲透性。對GAS 侵入的細胞應用阿莫西林和喹諾酮類藥物拉庫沙星（lascufloxacin,LSFX）后發現，阿莫西林不能減少胞內GAS量，而LSFX可有效減少內化入宿主細胞內的GAS［35］。近年來，有學者針對β-內酰胺類藥物不能清除胞內GAS 的問題進行研究，探尋新的GAS感染治療方向。Lu等［36］發現血管內皮生長因子可通過增強內皮細胞中溶酶體活性及促進異體吞噬從而有助于胞內GAS的清除。

3 結語

盡管體外試驗中GAS 總是對青霉素等敏感，但GAS 體內耐受青霉素等β-內酰胺類藥物也已得到確證。GAS 體內耐受青霉素等β-內酰胺類藥物的機制尚無定論，可能與GAS 菌株的藥物敏感性有關，也可能與機體內的其他因素，包括GAS 的接種效應、共存菌的作用、GAS 生物膜和細菌持留性，以及細菌內化入細胞等。需要注意的是，雖然有青霉素等藥物清除細菌失敗的情況，但仍然少見，包括青霉素在內的β-內酰胺類藥物對大部分GAS 感染仍然有效，換用其他藥物不論是從經濟還是療效考慮，均于患者無益［37］。臨床需要持續對治療失敗的情況保持警惕，并監測GAS 分離株體外藥物敏感狀況，為GAS 體內耐受β-內酰胺類藥物的機制研究提供更多線索和證據，促進預防和治療GAS感染新策略的研發。

作者貢獻聲明：郭孟楊查閱及整理分析文獻、撰寫文章；姚開虎把握選題、修改文章、經費支持。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。