銀樂丸質(zhì)量控制方法的研究

趙小偉,吳劍坤,王宏蕾,李洋,陳占功（毛克臣全國名老中醫(yī)藥專家傳承工作室,首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院,北京 100010）

銀樂丸是北京中醫(yī)醫(yī)院皮膚科常用的院內(nèi)制劑，具有活血解毒、潤膚除濕的功效，用于瘀滯肌膚證的銀屑病。銀樂丸在北京中醫(yī)醫(yī)院皮膚科臨床應(yīng)用多年，對于銀屑病有很好的治療效果，但是沒有較為完善的質(zhì)量控制方法，本文應(yīng)用現(xiàn)代手段，定性與定量相結(jié)合的方法，建立銀樂丸質(zhì)量控制的方法，保障臨床用藥安全。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 1260America Agilent HPLC色譜儀，超聲清洗機(jī)（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司），TD-Ⅱ型全自動薄層鋪板機(jī)（上海科哲生化有限公司），XS205分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司），Milli-Q純水儀（MILLIPORE）。

1.2 試藥 丹參對照藥材（批號120923-200911）、芍藥苷（批號110736-200934）、大黃素（批號756-9203）、當(dāng)歸對照藥材（批號120927-200613）、丹參酮ⅡA對照品（批號110766-201520）、丹酚酸B對照品（批號110562-201514）；銀樂丸（本院制劑室提供）。薄層板為硅膠G（青島）；分析純試劑（北京試劑公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 丹參的薄層色譜鑒別 取本品2袋（10g），研磨成細(xì)粉，加水50ml，充分?jǐn)嚢韬箅x心，將上清液以乙酸乙酯萃取2次，20ml/次，將乙酸乙酯液合并后蒸干，以甲醇1ml將殘渣溶解，將其作為供試品標(biāo)準(zhǔn)溶液。另取丹參對照藥材1.5g，加水20ml加熱煎煮30min，放冷后過濾，續(xù)濾液用鹽酸調(diào)整pH約為2，按照供試品溶液制備方法制備，可得到丹參對照藥材溶液。依照中國藥典2020年版一部附錄薄層色譜鑒別法試驗[1]，分別吸取5μl供試品溶液和對照藥材溶液，點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5∶4∶1）作為展開劑，展開后將其取出，晾干后噴3%三氯化鐵乙醇溶液，以熱風(fēng)將其吹干。在色譜圖中，供試品和對照藥材斑點清晰。色譜結(jié)果見圖1。

圖1 銀樂丸中丹參的薄層色譜鑒別圖譜。①丹參陰性對照；②丹參對照藥材；③-⑤供試品

2.1.2 赤芍、白芍的薄層色譜鑒別 將2.1.1中剩余的水層以水飽和正丁醇20ml萃取2次，將正丁醇溶液以30ml正丁醇飽和水洗滌1次，水浴蒸干正丁醇，以甲醇1ml將殘渣溶解，將其作為供試品溶液。精密稱定芍藥苷對照品適量，用乙醇制備成1mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液。以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40∶5∶10∶0.2）的下層溶液作為展開劑，展開后晾干，噴5%香草醛硫酸溶液，加熱直至斑點明顯。在色譜圖中，供試品和對照藥材斑點清晰，色譜結(jié)果見圖2。

圖2 銀樂丸中赤芍、白芍的薄層色譜鑒別圖譜。①赤芍、白芍陰性對照；②⑥芍藥苷對照品；③-⑤供試品

2.1.3 首烏藤的薄層色譜鑒別 將2.1.1中離心后的沉淀晾干，加入40ml乙醚，超聲提取15分鐘，過濾后蒸干濾液，以乙酸乙酯1ml將殘渣溶解，作為供試品溶液。精密稱定大黃素適量，用乙醇制備成0.2mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液。以石油醚（30℃-60℃）-甲酸乙酯-冰乙酸（15∶5∶1）為展開劑，晾干置365nm紫外光燈下觀察。在色譜圖中，供試品和對照品熒光斑點清晰；以氨蒸氣熏后，斑點變?yōu)榧t色（大黃素），色譜結(jié)果見圖3。

圖3 銀樂丸中首烏藤的薄層色譜鑒別圖譜。①首烏藤陰性對照；②大黃素；③-⑤供試品

2.1.4 當(dāng)歸的薄層色譜鑒別 取當(dāng)歸對照藥材0.5g，用20ml乙醚超聲10分鐘，以乙醇1ml將蒸干的濾液殘渣溶解，作為對照藥材溶液。以正己烷-乙酸乙酯（4∶1）為展開劑，展開后將其取出，晾干后置365nm紫外光燈下觀察。在色譜圖中，供試品和對照藥材熒光斑點清晰，色譜結(jié)果見圖4。

圖4 銀樂丸中當(dāng)歸的薄層色譜鑒別圖譜。①當(dāng)歸陰性對照；②當(dāng)歸對照藥材；③-⑤供試品

2.2 丹酚酸B的含量測定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗[1]流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液（22∶78）；20℃的柱溫；1.2ml/min的流速；286nm的檢測波長。理論板數(shù)大于6000。

2.2.2 對照品溶液的制備 取丹酚酸B對照品，精密稱量，加甲醇與水（8∶2）混合溶液，制備0.10mg/ml的溶液，即可。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品粉末10g，置于具塞錐形瓶中，精密加入50ml甲醇與水（8∶2）混合溶液，精密稱量，超聲0.5小時，放置常溫后再精密稱量，以甲醇與水（8∶2）混合溶液將其減少的重量補(bǔ)足，搖勻，精密量取5ml續(xù)濾液，加甲醇與水（8∶2）混合溶液定容至10ml容量瓶中，取續(xù)濾液，即可。

2.2.4 陰性對照溶液的制備 取不含丹參的處方中其他藥材，以2.2.3相同的制備方法制備丹參陰性對照溶液。

2.2.5 專屬性試驗 精密吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液，分別進(jìn)樣10μL。結(jié)果顯示在該色譜條件下陰性對照無干擾，具有專屬性。

式中：Nii，Hii以及Jii分別表示矩陣N，H，J的第i行第i列的元素；m為量測向量的維數(shù)；Fk+1為狀態(tài)方程的jacobian矩陣；ωk+1為殘差，η為遺忘因子，取值在0～1之間，通常取為0.95。

2.2.6 線性關(guān)系的考察 精密吸取0.1mg/ml的丹酚酸B對照品溶液，分別進(jìn)樣4、6、8、10、12、14μl，注入HPLC色譜儀，檢測峰面積。縱坐標(biāo)（Y）為峰面積積分值，橫坐標(biāo)（X）為進(jìn)樣量，求得回歸方程為Y=799444X-3103.7，r=1.0000，丹酚酸B在0.1000-1.000μg范圍內(nèi)，進(jìn)樣量與丹酚酸B峰面積積分值線性關(guān)系良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，精密吸取各10μl，每隔2小時進(jìn)樣一次，測定不同時間點的峰面積，記錄8小時，峰面積RSD值為1.51%，結(jié)果顯示樣品在8小時內(nèi)有良好的穩(wěn)定性。

2.2.8 精密度試驗 取同一丹酚酸B對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10μl，計算其峰面積RSD為0.08%，結(jié)果顯示儀器精密度良好。

2.2.9 重復(fù)性試驗 取六份同一批號的樣品，依照供試品溶液制備方法制備6份供試品溶液，進(jìn)樣10μl，計算峰面積RSD值為0.73%，結(jié)果顯示重復(fù)性良好。

2.2.10 回收率試驗 取已知含量的銀樂丸6份，加入一定量的對照品溶液，按照2.3.3方法制備，結(jié)果見表1。

表1 銀樂丸中丹酚酸B加樣回收率檢測結(jié)果

表2 銀樂丸中丹酚酸B含量檢測結(jié)果(mg/g)

2.3 丹參酮ⅡA的含量測定

2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性[1]流動相A為乙腈，流動相B為磷酸溶液（0.02%），按藥典方法進(jìn)行梯度洗脫；20℃的柱溫；270nm的檢測波長。理論板數(shù)大于60000。

2.3.2 對照品溶液的制備 取丹參酮ⅡA對照品精密稱量，放于棕色容量瓶中，加甲醇制備0.02mg/ml的溶液，即可。

2.3.3 供試品溶液的制備 取本品粉末10g，精密稱量，置于具塞錐形瓶中，以50ml甲醇超聲0.5小時，放置常溫后再精密稱量，用甲醇補(bǔ)足減少的重量，搖勻，取續(xù)濾液，即可。

2.3.4 陰性對照溶液的制備 取不含丹參的處方中其他藥材，以2.3.3相同的制備方法制備丹參陰性對照溶液。

2.3.5 專屬性試驗 精密吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液，分別進(jìn)樣10μL。結(jié)果顯示在該色譜條件下陰性對照無干擾，具有專屬性。

2.3.6 線性關(guān)系的考察 精密吸取0.02mg/ml的丹參酮ⅡA對照品溶液，進(jìn)樣4、6、8、10、12、14μl，注入HPLC色譜儀，檢測峰面積。縱坐標(biāo)（Y）為峰面積積分值，橫坐標(biāo)（X）為進(jìn)樣量，求得回歸方程為Y=3411.7X-13.607，r=0.9999。說明丹參酮ⅡA在0.0800-0.2800μg范圍內(nèi)，進(jìn)樣量與丹參酮ⅡA峰面積積分值線性關(guān)系良好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，精密吸取各10μl，在0、2、4、6、8小時分別進(jìn)樣，測定不同時間點的峰面積，計算峰面積RSD值為0.17%，結(jié)果顯示樣品在8小時內(nèi)有良好的穩(wěn)定性。

2.3.8 精密度試驗 取同一丹參酮ⅡA對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10μl，計算其峰面積RSD為0.26%，結(jié)果顯示儀器精密度良好。

2.3.9 重復(fù)性試驗 取6份同一批號的樣品，依照供試品溶液制備方法制備6份供試品溶液，進(jìn)樣10μl，計算峰面積RSD值為0.17%，結(jié)果顯示重復(fù)性良好。

2.3.10 回收率試驗 取已知含量的銀樂丸6份，加入一定量的對照品溶液（C=0.02mg/ml），按照2.3.3方法制備，結(jié)果見表3。

表3 銀樂丸中丹參酮ⅡA加樣回收率檢測結(jié)果

2.3.11 樣品測定 取銀樂丸三批樣品，各精密稱定10g，按2.3.3項下方法制備三批供試品溶液，按照以上色譜條件分別進(jìn)樣10μl，記錄峰面積，計算丹參酮ⅡA含量，結(jié)果見表4。

表4 銀樂丸中丹參酮ⅡA的含量檢測結(jié)果(mg/g)

3 討論

銀屑病是一種慢性炎癥性皮膚病，皮損部分常伴有鱗屑性紅斑，厚層鱗屑常比皮膚表面高，常有瘙癢癥狀[2]，具有病程較長、容易復(fù)發(fā)的特點[3]，銀屑病病因復(fù)雜，目前還沒有完全治愈的方法[4]。當(dāng)前多用活性藥物或生物制劑進(jìn)行治療，但副作用大，效果不理想，復(fù)發(fā)幾率高，而傳統(tǒng)中醫(yī)藥據(jù)有整體調(diào)節(jié)的特點，對銀屑病的防治有著更大的優(yōu)勢[5]。“以血論治”在銀屑病治療中有著很高的共識度，是主要的辨證方法[6-9]。《趙炳南臨床經(jīng)驗集》[10]收載了11例銀屑病醫(yī)案，趙炳南教授提出“銀屑病發(fā)病的主要根據(jù)是血熱”[11]。銀屑病的基本證型有血熱證、血瘀證、血燥證，分別采取涼血、活血、養(yǎng)血解毒的治療方法，多項臨床試驗研究[12-17]證明了此辨證方法的有效性。

丹參為銀樂丸的君藥，常用于醫(yī)治心腦血管疾病，還具有抑菌消炎等作用[18]。周靜[19]等人研究發(fā)現(xiàn)，丹參主要成分為脂溶性的二萜醌類化合物和水溶性的酚酸類成分，丹參酮ⅡA和丹酚酸B常作為丹參質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的主要測定成分[20]。故本文以銀樂丸君藥丹參中的主要成分丹酚酸B和丹參酮ⅡA作為含量測定指標(biāo)。

銀樂丸具有活血解毒、養(yǎng)血除濕的功效，臨床用于治療銀屑病多年，療效確切，但是未建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本文采用現(xiàn)代研究手段對銀樂丸進(jìn)行質(zhì)量提升，建立質(zhì)量控制方法，方法簡便易行，專屬性良好，為臨床用藥提供質(zhì)量保證。