GeneXpert MTB/RIF糞便檢測在兒童結核病中的研究進展

李曉迎 方玉蓮 寧靜 徐勇勝

據世界衛生組織(World Health Organization,WHO)2022年統計[1],估算2021年全球新發結核病患者1060萬例,其中兒童患者約120萬例,占11%,其中兒童結核病死亡患者約20萬例,占14%。按照2018—2022年聯合國高級別會議(UNHLM)里程碑目標,截止到2021年底,只有54%(190萬例)兒童結核病患者得到了妥善的治療(目標350萬例)。Dodd 等[2]和Jenkins等[3]估算全球每年新發兒童耐多藥結核病(multidrug-resistant tuberculosis, MDR-TB)患者約2.5萬～3.5萬例,此外,超過50%的兒童結核病患者未被確診或報告。可見,早期明確診斷、及時治療對改善患兒預后尤為重要。

有研究顯示,涂片鏡檢結核分枝桿菌(MTB)的陽性率不足15%[4],而MTB培養及菌種鑒定作為診斷結核病的金標準,其陽性率僅為30%～40%[5],結核菌素皮膚試驗(TST)聯合γ-干擾素釋放試驗(IGRA)作為臨床診斷肺結核的參考標準之一,其不能區分結核分枝桿菌潛伏感染和活動性結核病。而利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測技術(Xpert)作為近年新興起的結核病診斷檢測方法,其對成人肺結核的診斷價值已得到大量研究證實[6],WHO也推薦其用于兒童結核病的診斷,但鑒于兒童痰液及胃液標本留取困難,尋找新的無創性操作獲取標本并準確診斷兒童結核病已成為當前研究的重點。筆者就Xpert方法檢測MTB用于診斷兒童肺結核、肺外結核及糞便標本處理方法及臨床應用等方面進行綜述,為糞便Xpert檢測在兒童結核病診斷中的應用提供參考。

一、糞便Xpert應用優勢

由于兒童結核病診斷過程中痰液或胃液抽吸物樣本獲得較困難,目前其在兒童結核病診斷中的敏感度較低[7],其次,兒童體液量較少,胸腔積液、腦脊液、肺泡灌洗液、胃液等樣本量采集量不足;且兒童配合度低,采集標本質量差[8],這就使得兒童結核病的診斷更加困難。

Cordova等[9]指出,含MTB的痰可被吞咽,特別是在睡眠期間,抗酸桿菌也已被證明可在消化過程中存活,并可在糞便中檢測到,因此,糞便Xpert檢測用于診斷肺結核是可行的,而Liu等[10]研究成果中指出Xpert檢測糞便標本在兒童和青少年結核病的治療管理中有重要的診斷價值。同時針對Xpert檢測敏感度低的特點,隨著新一代測序技術GeneXpert MTB/RIF Ultra(簡稱“Xpert Ultra”)出現,補充了Xpert檢測敏感度低的問題[11],Xpert Ultra較Xpert增加了IS1081和IS6110區域探針,提高了MTB的檢出率。

二、糞便Xpert檢測樣本處理方法

不同的糞便樣本處理方法可能會影響結果的敏感度及特異度,從而影響最終的診斷結果,因此,標本的處理方法至關重要,目前國際及國內尚無統一的糞便處理方法,已知用于Xpert檢測的糞便處理方法如下:

1.離心法:其主要是應用磷酸鹽緩沖液(PBS溶液)對樣本進行處理, Chipinduro等[12]采用0.15 g大便方法,將收集好的糞便于2～8 ℃中運輸,在-80 ℃ 中冷凍儲存(儲存后在6個月內對標本進行處理),收集合適量的糞便后,將糞便解凍后取0.15 g 置于2.4 ml PBS中混勻,室溫靜置20 min,取上清1 ml,3500 r/min離心15 min,棄掉上清,在1 ml PBS中重新懸浮,然后用樣品試劑2∶1稀釋,加入Xpert試劑盒中進行化驗。需注意離心法中糞便處理方法及在PBS混勻后的靜置時間略有不同[13-15];此外,離心法需要較高級別的生物安全措施[16]。

2.緩沖液制備法:屬于非離心法,需格外配置緩沖液。AL緩沖液(Qiagen, Valencia, CA)+10%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)+2 ml Xpert樣品試劑 (SR)+3 mm玻璃微珠。與大便混勻后,室溫下孵育30 min,將獲得樣品通過玻璃棉注射器過濾器放入單獨容器中,再將2 ml濾液放入Xpert試劑盒中[17-18]。

3.TS法(two-step processing method):簡稱兩步法,是一種接近痰液處理流程的方法,取1 g糞便樣本,用木質涂布棒將其添加到10 ml PBS(pH值為7.4)溶液中,劇烈振蕩混勻,沉淀10 min后,取2 ml 上清液與2～4 ml Xpert樣品試劑混勻,孵化15 min后,取2 ml混合物進行測試[19]。

4.優化蔗糖浮選法(optimized sucrose flotation,OSF):該方法為主要檢測糞便中寄生蟲蟲卵的方法,現已用于糞便Xpert檢測,在糞便樣本中加入56%蔗糖溶液,通過密度梯度從糞便顆粒中分離分枝桿菌[20],具體步驟為:(1)在10 ml 56%蔗糖溶液中加入0.5 g糞便;(2)渦流搖動;(3)漏斗紗布濾過;(4)100×g離心1 min;(5)取上清0.5 ml與1.8 ml Xpert樣品試劑混合并渦流搖動。該方法需離心,且至少需要生物安全2級。隨后 Lounnas等[21]開發一種新的操作方法,在上述傳統方法中進行了改進,稱OSF法,其開發并發現了蔗糖處理方法的最佳組合方法,即應用0.5 g標本量,用沉降法代替上述離心,采用玻璃棉過濾,沉淀30 min,稀釋比例為1∶3.6。

5.簡單一步法(SOS法):此方法是基于重力沉降,其原理類似于痰液Xpert處理方法[22]。取0.8～1.0 g糞便,直接加入至8 ml檢測試劑中,混合液進行搖晃靜置,將靜置后的上層“無碎屑”的上清液轉移到Xpert試管中進行檢測。SOS檢測其對標本處理方法上較其用于痰液處理時有所改進,主要體現在以下幾點:(1)加入玻璃珠以改善樣品的均勻化,增加MTB的釋放量;(2)用PBS稀釋類似“TS”方法;(3)按照Banada方法進行過濾。該方法被Jasumback等[23]定義為最適合在低資源配置中實施的方法。

三、糞便Xpert檢測肺結核的敏感度和特異度

既往研究發現,不同的研究機構及研究樣本敏感度及特異度有一定差異,總體來說,Xpert檢測MTB的敏感度為25%～85%,特異度為91.7%～100%[24-28]。而Xpert Ultra檢測的敏感度為45.5%～60.3%,特異度為88.1%～100%。

糞便Xpert較適用于呼吸系統標本收集相對較為困難的兒童,國外學者Kokuto等[29]發現在成人痰涂片陽性的肺結核患者中,糞便Xpert檢測肺結核的敏感度為100%,痰涂片弱陽性的患者,糞便Xpert檢測的敏感度為81%,痰涂片陰性患者中敏感度為50%,非肺結核組糞便Xpert檢測均陰性,特異度為100%。此外,Walters等[18]收集了280例疑似肺結核的兒童患者進行糞便檢測,并與單一呼吸道標本進行比較,發現其檢測的敏感度及特異度分別達到了44.4%和99%以上,糞便Xpert檢測的特異度較高,但其敏感度略低于呼吸道標本。

另外,Hasan等[30]比較與兒童糞便Xpert與培養(胃液/痰液)方法診斷兒童肺結核的一致性,發現糞便Xpert檢測的敏感度為88.9%(95%CI: 50.7%～99.4%),特異度為95%(95%CI: 81.8%～99.1%),且發現胃液標本與糞便檢測結果基本一致。Banada等[17]及Walters等[ 15]研究發現,當糞便Xpert直接與單一胃液或痰液檢出率進行比較時,糞便并沒有表現出劣勢。 我國Liu等[10]使用Xpert Ultra方法對126例兒童結核病患者的糞便、呼吸道標本進行檢測并與痰培養、痰涂片等進行比較,發現痰Xpert Ultra檢測的敏感度及特異度最高,而糞便與痰Xpert Ultra一致率為84.1%,敏感度為45.5% (95%CI: 35.0%～56.0%),特異度為94.7%(95%CI: 82.0%～99.0%),與MTB培養的敏感度[45.5% (95%CI: 35.0%～56.0%)]相似,但高于痰抗酸染色涂片法[27.3%(95%CI: 18.0%～38.0%)]。

Sun 等[31]對141例兒童活動性肺結核及34例兒童非結核性呼吸系統疾病患者分別采用Xpert和Xpert Ultra方法對糞便樣本進行檢測,同時采用Xpert Ultra方法檢測同一患兒胃液,并與胃液培養及涂片進行比較,發現糞便Xpert Ultra檢測的敏感度為60.3% (95%CI: 51.7%～68.3%),特異度為97.1% (95%CI: 82.9%～99.8%);糞便Xpert檢測的敏感度為32.6%(95%CI:25.1%～41.1%),特異度為100.0% (95%CI:87.4%～100.0%),Xpert Ultra較Xpert有更高的敏感度,但特異度略低于Xpert,并指出糞便Xpert Ultra可替代胃液Xpert Ultra用于兒童肺結核診斷,且糞便與胃液Xpert Ultra陽性均可作為肺結核的細菌學診斷依據。

2022年世界衛生組織《兒童結核病診療指南》[32]指出,在兒童和青少年結核病的管理中明確指出,在具有典型的肺結核癥狀的兒童中,啟用Xpert Ultra對痰液、鼻咽分泌物、胃液和糞便等樣本作為結核病的初始診斷及利福平耐藥的檢測工具,而不是痰涂片/培養和表型藥物敏感性試驗。

四、糞便Xpert檢測腸結核的敏感度和特異度

兒童腸結核患者癥狀不明顯,體征非特異性,臨床體征與許多其他疾病相似,如克羅恩病等,因此腸結核的診斷較為困難。

腸道糞便Xpert檢測是基于腸結核的干酪肉芽腫性病變可在糞便中脫落分枝桿菌這一假設進行的。關于Xpert用于腸結核診斷方面的研究中, Bellam等[33]應用腸鏡取成人腸黏膜組織進行Xpert檢測,發現其檢測的敏感度、特異度、陰性預測值、陽性預測值及準確率分別為32% (95%CI: 15.0%～53.5%)、 100% (95%CI: 78.2%～100%)、 46.88% (95%CI: 40.3%～53.6%)、 100%和57.50% (95%CI: 0.9%～72.9%),但以上均為有創性檢查,在兒童中適用性較差。

熊瑜等[34]選取我國3家較大型的醫院收集254例疑似腸結核患者進行試驗,結果發現以臨床診斷為標準,糞便Xpert檢測的敏感度和特異度分別為60.4%和100%;糞便抗酸桿菌涂片的敏感度和特異度分別為13.2%和98.3%;糞便BACTEC MGIT 960 培養的敏感度和特異度分別為43.2%和100.0%。糞便Xpert檢測的敏感度明顯高于抗酸桿菌涂片及BACTEC MGIT 960 培養。

糞便Xpert用于腸結核診斷尤其用于腸結核診斷研究數據較少,其在兒童中的應用有待進一步大樣本數據研究。

五、總結與展望

糞便Xpert檢測因其檢測時間短及有較高的診斷準確性,為診斷兒童肺結核提供了一種新的方法,對于控制結核病的傳播有較為深遠的影響,且糞便標本獲得比較方便,在很大程度上避免了支氣管鏡等操作獲取標本。但目前糞便Xpert檢測在方法學上無統一標準,還需大樣本研究確定統一的參考標準,為臨床的實際應用提供更好的價值。另外,糞便Xpert 陽性也不能作為診斷金標準,無論是肺結核或者腸結核均不能以Xpert陽性作為診斷金標準,此外,糞便Xpert的診斷效能受到感染部位、標本類型、標本質量和合并其他病原感染等因素的影響,需要完善標本采集體系,建立規范的標本采集和檢測流程,尤其對于不同年齡階段兒童的適用性及使用價值。因此,糞便Xpert在兒童結核病診斷中的應用需進一步改良和優化,以便更廣泛地應用于臨床及不同年齡肺結核的診斷和治療。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻李曉迎:文章撰寫及文章修改;方玉蓮:文獻檢索;寧靜:對文章的知識性內容作批評性審閱;徐勇勝:對文章的知識性內容作批評性審閱、支持性貢獻