山東中華櫻桃資源的ISSR分析

摘" 要：以46份中華櫻桃種質為試材，進行ISSR引物擴增，根據擴增結果計算遺傳距離并進行聚類分析。結果表明，篩選出12條多態性良好的ISSR引物，共獲得106個條帶，其中多態性條帶78個，多態率為73.58%。46份材料間遺傳相似系數為0.59 ～ 0.94，有效等位基因數、基因多樣性、香農信息指數分別為1.36、0.21、0.32，說明山東地區中華櫻桃遺傳多樣性較高。通過UPGMA方法進行聚類分析，12條ISSR引物能夠完全區分46份種質，并將其分為7個類群。研究結果為山東地區櫻桃種質資源的保存與利用提供參考。

關鍵詞：中華櫻桃；ISSR；種質資源；遺傳多樣性

中圖分類號：S662.5""""" 文獻標識號：A""""" 文章編號：1002－2910（2024）06－0036－06

ISSR analysis of Chinese cherry germplasm resources in Shandong Province

Abstract： In this study， 46 Chinese cherry （Prunus pseudocerasus Lindl.） germplasm were used as research materials， and DNA was extracted for ISSR primer amplification， and genetic distances were calculated based on the amplification results and analyzed by clustering. The results showed that 106 bands were obtained by PCR amplification with 12 selected ISSR primers， of which 78 bands were polymorphic， with a polymorphism rate of 73.58%. The genetic similarity coefficients among 46 materials were 0.59 ～ 0.94， and the effective allele number， gene diversity， and Shannon's information index were 1.36， 0.21， and 0.32， respectively， which indicated that the genetic diversity of Chinese cherry was high in Shandong Province. Cluster analysis by UPGMA method showed that 12 ISSR primers were able to completely distinguish 46 germplasm and classify them into seven taxa. The conclusion showed that the genetic analysis of ISSR molecular markers can provide reference for the conservation and utilization of cherry germplasm resources in Shandong Province.

Keywords： chinese cherry; ISSR; germplasm resources; genetic diversity

中華櫻桃（Prunus pseudocerasus Lindl.）屬于薔薇科（Rosaceae）李屬（Prunus）植物，具有早果和自交親和的特性，廣泛應用于櫻桃新品種選育[1]。山東泰安、棗莊、五蓮等地區擁有豐富的中華櫻桃地方種質資源[2，3]，但種質分類混亂，存在大量同名異物和同物異名的問題[4]，且部分種質正在或已經流失[5]，亟需加強對地方種質資源的收集、保護與利用。圃地保存是種質資源保存的常用方法，但需地面積大，工程量相對較大[6]。對于性狀相近的種質，通過表型特征難以區分，需要從基因層面進行種質鑒定。目前ALFP[7]、RAPD[8]、RFLP[9]、SSR[10]等分子標記技術已經應用于歐洲甜櫻桃的遺傳多樣性分析，能夠從基因層面反映不同種質之間的差異?；诜肿訕擞?，對四川、貴州等地區的中華櫻桃地方種質遺傳資源進行了分析[11，12]。ISSR（Iinter-simple Sequence Repeat）標記是一種基于微衛星序列（SSR）的多態性分子標記技術，由加拿大特利爾大學的學者[13]提出。ISSR使用帶有1～4個簡并堿基的微衛星序列作為引物擴增重復序列之間的區域，不依賴已知物種的基因組序列，是一種理想的分子標記技術[14]，具有操作簡單高效、技術難度低和成本低等優點，廣泛應用于種質資源鑒定、進化與親緣關系分析、遺傳多樣性評價等方面[15-18]。本研究通過ISSR分子標記對34份山東地區中華櫻桃種質和12份省外種質進行遺傳多樣性分析，闡明種質資源之間的親緣關系，為山東地區中華櫻桃種質資源的分類、保存與利用、遺傳轉化等研究提供參考依據。

1" 材料與方法

1.1" 供試材料

46份中華櫻桃種質資源信息見表1，其中34份山東地區種質、12份省外種質，樣本編號前兩位字母代表取樣地（見表注）。選取無病蟲害的幼嫩葉片，保鮮袋封存，液氮處理后，保存于－80 ℃冰箱。

1.2" DNA提取

采用北京博友順生物技術有限公司的磁珠試劑盒提取葉片DNA，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計測定DNA質量及濃度，－20 ℃保存。

1.3" ISSR分析

ISSR反應體系和擴增條件。ISSR引物參照加拿大哥倫比亞大學（UBC）公布的序列（Http：//www.

biotech.ubc.ca/services/naps/primers/Primers.pdf），由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。以隨機抽取的4個樣品基因組DNA為模板，利用梯度PCR擴增儀篩選引物及退火溫度。PCR擴增體系（25 μL）為：DNA模板約40 ng，10×Bufer 2.5 μL，primer 0.3 μmol/L，四種dNTPs各0.25 μmol/L，MgCl2 1.5 mmol/L，TaqDNA聚合酶1.25U。PCR擴增程序為：94 ℃預變性5 min，然后進行35個循環：94 ℃變性45 s，55～62 ℃復性45 s，72 ℃延伸1.5 min；循環結束后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.4" ISSR 擴增產物的檢測

PCR產物在2.0 %的瓊脂糖凝膠（電壓120V電泳50 min）檢測，以DL 2 000 Marker（天根生化科技北京有限公司）為標準分子量對照，紫外凝膠成像系統照相。

1.5" 數據統計分析

PCR擴增產物在凝膠的某個相同遷移率位置上有DNA條帶記為1，無DNA條帶記為0。對擴增產物的條帶總數和多態性條帶進行數量統計，計算多態性條帶所占比例，形成ISSR的表型數據矩陣，通過NTSYS軟件計算相似系數（DICE系數），并按照UPGMA法進行聚類分析，構建遺傳熱度圖和聚類分析圖。用POPGENE 32軟件對供試材料的遺傳多樣性指數進行分析，計算觀測等位基因數（Na）、有效等位基因數（Ne）、Nei氏多樣性（H）和香農信息指數（I）。

2" 結果與分析

2.1 "引物篩選及多態性分析

使用4個樣本（QD1、TA5、ZZ1、ZZ8），在48條ISSR通用引物中篩選出12條多態性豐富、重復性好且擴增條帶特征明顯的引物進行批量實驗（表2）。利用Popgene.32軟件對46份櫻桃資源的12條引物分別進行遺傳多樣性分析。

擴增結果表明，ISSR 標記數多，多態性豐富（圖1），12條引物共擴增出長度為200～750 bp的條帶106個，其中多態性標記 78個，多態率為73.58%。12條引物擴增的多態性條帶在2～14條之間，平均每條引物擴增出6.5個標記，并且不同引物間存在較大差異。每個位點的平均有效等位基因數（Ne）為1.36，基因多樣性（H）0.21，香農信息指數（I）0.32，因而上述引物可用于中華櫻桃種質的鑒定。

2.2" 遺傳相似系數分析

根據12條引物擴增產生的106份條帶，計算46份櫻桃種質間的遺傳相似系數（DICE）。46份種質的遺傳相似系數分布在0.59～0.94之間，平均遺傳相似系數為0.78。其中LS-01嶗山豐產（QD3）和丁家喬長把（QD4）2份種質的遺傳相似系數最大，為0.94，表明2份種質的親緣關系最近，可能為同物異名或者其親本相似。成都C4（SC5）和LS-01嶗山豐產（QD3）的遺傳相似系數最小，為0.59，表明兩者的親緣關系較遠。根據各個地區種質之間的平均遺傳相似系數，山東泰安、五蓮、嶗山、棗莊地區平均遺傳相似系數為0.81，其中泰安地區最高，為0.82，而棗莊地區最低，為0.79，表明山東不同地區種質之間親緣關系較近，種質資源多樣性較差。來自江蘇的東塘櫻桃（JS1）[19]和其他45份種質的平均遺傳相似系數最低，為0.67，遺傳距離最遠。

2.3" ISSR聚類分析

根據“0”“1”矩陣數據，利用NTSYS軟件分別計算46份種質遺傳相似矩陣，構建遺傳距離矩陣熱圖（圖2）。根據GS值矩陣，利用UPGMA法對46份種質的ISSR結果進行聚類分析，得到環狀聚類圖（圖3）。

根據UPGMA聚類分析圖，46份中華櫻桃可以分為7個類群以及山亭超早紅（ZZ6），烏皮櫻桃（CQ1）2份游離種質。其中第I類群包括尖嘴黃櫻（ZZ10）、MYRX（LY2）、丁家喬長把（QD4）、

LS-01嶗山豐產（QD3）、成都紅花（SC4）、東塘櫻桃（JS1）共6份種質；第II類群包括成都C4（SC5）、五蓮水櫻桃（RZ5）、安丘大硬（WF2）、五蓮大紅（RZ1）、五蓮尖黃（RZ2）、山亭尖嘴黃櫻1（ZZ8）、山亭尖嘴黃櫻2（ZZ9）、五蓮硬肉1（RZ6）共8份種質；第III類群包括天寶紅櫻（TA1）、蒙陰紅櫻（LY1）、沂源尖嘴（ZB1）、龍廷尖黃院內（TA4）、嶗山黃櫻（QD1）、丁家喬短把（QD5）、襄星（SC6）、泰山紅櫻1（TA5）共8份種質；第IV類群包括4份泰安地區的種質（泰山干櫻、泰山紅櫻2、天寶黃櫻、龍廷尖黃山上）以及嶗山紅櫻（QD2）共5份種質；第V類群包括五蓮短枝紅（RZ4）、五蓮早紅（RZ3）、越星（ZJ2）、安丘尖嘴（WF1）、山亭桃源黃櫻（ZZ5）共5份種質；第VI類群包括大果脆（SC1）、成都賈家土櫻桃1（SC2）、成都賈家土櫻桃2（SC3）、浦江小櫻桃（ZJ1）、瑪瑙紅（GZ1）共5份種質，第VII類群包括來自棗莊的5份種質（山亭小白花、山亭小尖葉、滕縣大紅櫻桃、山亭大尖葉、山亭大窩婁葉）以及來自湖北的房縣小櫻桃1（HB1）和房縣小櫻桃2（HB2），共7份種質。

3" 小結與討論

3.1" 山東櫻桃種質資源的多樣性

通過各地區櫻桃種質的聚類分布和遺傳相似系數來看，泰安地區的種質遺傳多樣性不高，在聚類分析圖上單獨聚類（第III和第IV類群），這與泰安地區平均遺傳相似系數最高的結論一致。棗莊地區的遺傳多樣性最為豐富，聚類在I、II、V、VII類群中，其中還包括一份難以聚類的種質ZZ6（山亭超早紅）。前期調查發現，棗莊地區擁有豐富的本地特色資源[20]，并進行過人工選種和對外引種工作[21]。這似乎可以解釋為何棗莊和湖北房縣的種質親緣關系較近。五蓮和嶗山地區的種質盡管地域接近，但是互相之間遺傳距離較遠，分散在I～V五個類群中，表明五蓮和嶗山地區的中華櫻桃種質遺傳多樣性相對豐富，這與之前種質資源調查的結論一致[22]。Itow的觀點認為，在氣候濕潤地區，海拔高度的增加會提高物種多樣性[23]，這可能是嶗山和五蓮地區櫻桃種質遺傳資源豐富的原因之一。此外，過去的調查表明嶗山地區曾經大量引入日本的櫻亞屬植物[24]，這進一步提高了嶗山地區種質的遺傳多樣性。綜合來看，山東省內中華櫻桃種質資源較為豐富，應當加強對地方特色種質的保護，依托特色種質選育優良品種。

3.2" 遺傳距離與地理距離的相關性

46份材料在遺傳相似度和地理距離上相關性不強，聚類分析中不同地區的種質可以被劃分為同一類群。比如第I和第II類群與其他5個類群均有一定遺傳距離，這兩個類群內包括數份來源地不同的種質，但是彼此之間有一定相似性狀，如來自第I類群的尖嘴黃櫻（ZZ10）和MYRX大山河村硬肉（LY2）都具有黃色果皮、尖嘴、心臟形果實的特征，可能代表2個類群內種質的來源比較接近或者具有相似的親本。同時也出現來源地相同的品種未能聚類在一起的情況。如兩份龍廷尖黃種質（TA3和TA4）就被劃分為不同的類群，其中TA3和嶗山紅櫻（QD2）親緣關系較近，而TA4和嶗山黃櫻（QD1）更為親近，這種現象可能是區內引種導致外地種和本地種之間發生基因滲入[25]，也可能是分子標記更能反映基因組本質差異[26]。

曹東偉認為，山東是第四紀冰期櫻亞屬植物向低緯度遷移時的避難所之一[27]，因此山東地區擁有較為集中的中華櫻桃野生群體分布。考慮到山東地區山脈成片分布，野生櫻桃群體能夠沿泰山—沂蒙山山脈擴展，并發生群落間基因交流，同時大量的區內引種降低了地理距離對于基因交流的阻礙，使得山東地區的種質具有較高的遺傳相似度。

3.3" ISSR遺傳標記對種質資源鑒定和保存的意義

中華櫻桃野生資源較多，許多野生資源形態相似，僅靠形態特征難以區分，同時在前期調查中發現部分地方種質由于尚未審定，僅使用地方名，造成大量同物異名和同名異物的現象[28]，這進一步加大了鑒別的難度。分子標記可以反映種質的遺傳本質，因此可以借助分子標記來研究不同種質的基因組差異，提高種質鑒定效率，降低重復保存。本研究篩選出12條引物，通過排列組合能夠區分全部46份種質資源。同時研究表明，通過增加ISSR引物的數量，能夠鑒別更多材料[29，30]。ISSR分子標記不需要預知物種的基因組信息，具有DNA 樣品用量少、信息量豐富、重復性好、操作簡單等特點[31]，可以作為鑒別種質資源、分析種群遺傳進化的高效手段，廣泛應用于大規模種質資源鑒別工作。汪祖華認為，經過人工選育的中華櫻桃相較于野生型表現出更大的遺傳差距和更遠的親緣關系[32]。本研究中難以聚類的兩份種質均為人工選育品種，其中烏皮櫻桃（CQ1）為省外優系[33]，山亭超早紅（ZZ6）是2007年棗莊市選育并審定的中華櫻桃品種，已經引種到省外多個地區[21]，這說明通過分子標記進行聚類分析，可以區別外地種和本地種，人工選育種和野生種。未來通過分子標記結合形態學調查，可以進一步發掘中華櫻桃的群居遺傳特征，篩選具有地方代表性的種質，發掘具有潛力的育種材料，為種質資源利用及品種改良等提供科學依據。

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