臨沂和周口地區中高溫大曲細菌群落結構與基因功能差異性研究

馬夢月，郭 壯，李學思，管桂坤，劉 宇，李富強，王玉榮,

（1.湖北文理學院湖北省食品配料工程技術研究中心，湖北襄陽 441053；2.河南牧業經濟學院食品與生物工程學院，河南鄭州 450046；3.山東蘭陵美酒股份有限公司，山東蘭陵 277731；4.河南省宋河酒業股份有限公司，河南周口 477262）

作為中國市場占有率最高的白酒，濃香型白酒因其獨特的釀造工藝和綿柔醇厚的口感受到了廣大消費者的喜愛[1-2]。濃香型白酒在釀造過程中使用大曲多為中溫大曲或中高溫大曲，其中，中高溫大曲以軟質小麥為原料，蘊含了豐富的微生物群和酶類，為白酒的發酵生香提供了動力[3]。王清龍等[4]采用MiSeq高通量測序技術對河南南部、東部、西部和中部地區濃香型白酒大曲微生物群落結構進行了差異研究，發現南部和西部大曲的細菌屬以芽孢桿菌屬（Bacillus）為主，東部和中部大曲的細菌屬以青枯菌屬（Ralstonia）和乳桿菌屬（Lactobacillus）為主；MA 等[5]采用MiSeq 高通量測序技術對山東濰坊、江蘇宿遷和四川綿陽地區濃香型大曲微生物群落結構進行了差異研究，發現山東濰坊大曲中細菌屬以魏斯氏菌屬（Weissella）和未分類的歐文菌科（unclassified Erwiniaceae）為主，江蘇宿遷大曲中細菌屬以糖多孢菌屬（Saccharopolyspora）、Bacillus和Weissella為主，四川綿陽大曲細菌屬以變形桿菌屬（Proteus）、Lactobacillus和Weissella為主；吳樹坤等[6]采用MiSeq 高通量測序技術對四川宜賓、瀘州和遂寧地區濃香型大曲的微生物群落結構進行了差異研究，發現宜賓和瀘州大曲中細菌屬以Weisslla和高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）為主，遂寧大曲中細菌屬以Bacillus和Staphylococcus為主。由此可見，地域環境的不同會對大曲所含微生物的類群造成一定的影響。同處于黃淮流域超級產區的山東臨沂和河南周口地區，孕育了蘭陵和宋河等多數知名濃香型白酒。其中臨沂市位于山東省東南部，地近黃海，該地區以沂、沭河為中心，西、北、東三面群山環抱，光照充足，雨量充沛，屬溫帶季風氣候[7]。周口市位于豫東平原，河南省東南部，該地區擁有沙潁河、渦河、西肥河和洪汝河四大水系，降水分布不均，日照、氣溫變幅大，屬暖溫帶半濕潤季風型氣候[8]。由此可見，兩地氣候存在明顯差異，且兩地相差500 公里左右，其環境亦存在一定差異。因此，對臨沂和周口地區的中高溫大曲細菌類群進行比較分析，不僅可以加深研究人員對2 個地區中高溫大曲中微生物資源進行全面了解，亦可以進一步論證地域環境的因素是否會對大曲細菌類群結構產生影響。

近年來，隨著第二代高通量測序技術的迅速發展，眾多學者不斷地利用該項技術來解析酒醅[9]、酒曲[10]和窖泥[11]的微生物多樣性，同時該方法也被廣泛應用于解析不同香型白酒釀造過程中酒醅微生物群落結構的動態變化趨勢。與傳統的微生物培養方法相比，第二代測序技術具有無需培養、高通量、檢測速度快和結果準確等優點，此外，該技術還能準確識別難以培養、豐度較低的微生物，全面和客觀地揭示微生態系統中微生物群落結構[12]，為探索白酒大曲中微生物的多樣性和功能提供了新的工具。

本研究采用Illumina MiSeq 高通量測序技術對臨沂和周口地區共28 份中高溫大曲細菌群落結構進行比較分析，同時基于直系同源蛋白數據庫對2 個地區中高溫大曲細菌潛在的功能差異進行解析，以期為黃淮流域超級產區釀酒微生物資源的挖掘提供數據支撐和理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

中高溫大曲 分別采集自山東省臨沂市蘭陵縣（E117°41′～118°18′，N34°37′～35°06′）和河南省周口市鹿邑縣（E115°02′～115°37′，N33°43′～34°05′），樣品隨機選取，及時粉碎后備用。其中，臨沂地區大曲樣品采集13 份，周口地區大曲樣品采集15 份。中高溫大曲制作步驟基本如下：選取麥粒完整、飽滿和無農藥污染的小麥為生產原料，加入深井水對其進行潤料再輥磨粉碎，粉碎后二次加入深井水進行拌料，拌料均勻后輸送到壓曲機制作曲坯，待曲坯成型后立即入房排列進行臥曲，再發酵培養28～30 d，曲坯培養至曲心水分基本全部蒸發，品溫降至接近室溫時，曲已培養成熟，即可將曲塊出房入庫，貯存3～6 個月。

QIAGEN DNeasy mericon Food Kit DNA 基因組提取試劑盒 德國QIAGEN 公司；5×TransStartTMFastPfu Buffer、dNTPs Mix、FastPfu Fly DNA Polymerase 北京全式金生物技術有限公司；引物338F/806R（正向引物序列338F：5’-ACTCCTACGGGAG GCAGCA-3’；反向引物序列806R：5’-GGACTACHV GGGTWTCTAAT-3’）上海桑尼生物科技有限公司；MiSeq 高通量測序配套試劑 美國Illumina 公司。

Veriti FAST PCR 儀 美國ABI 公司；DYY-12電泳儀 北京六一儀器廠；UVPCDS8000 凝膠成像分析系統 美國ProteinSimple 公司；ND-2000C 微量紫外分光光度計 美國Nano Drop 公司；PE300 MiSeq高通量測序平臺 美國Illumina 公司；R930 機架式服務器 美國DELL 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 宏基因組DNA 提取、PCR 擴增和高通量測序 按照試劑盒的操作步驟對中高溫大曲中細菌的基因組DNA 進行提取，并以其為模板，使用已添加核苷酸標簽（barcode）的引物338F/806R 對總DNA的16S rRNA V3～V4區域進行擴增，擴增體系與方法參照GUO 等[13]的進行，之后將檢測合格的PCR 產物寄至上海美吉生物醫藥科技有限公司完成2×300 bp 的雙末端測序。

1.2.2 生物信息學分析 本研究利用QIIME（v1.9.1）平臺進行生物信息學分析。首先遵循重疊區的堿基數≥10 bp、重疊區錯配率≤0.2、barcode 堿基錯配或有效序列長度≥50 bp 的原則對測序返回的雙端序列進行拼接和高質量序列篩選[14]，使用PyNAST進行校準并排齊序列[15]，按照100%和97%相似度進行序列劃分構建分類操作單元（operational taxonomic units，OTU）[16]，使用ChimeraSlayer 去除含有嵌合體的OTU[17]，最后選取代表性序列在RDP[18]、Greengenes[19]和SILVA[20]數據庫中進行同源性比對并確定其分類學地位；計算各樣品中細菌類群的超1、發現物種數、香農和辛普森等α多樣性指數；基于加權和非加權UniFrac 距離進行主坐標分析2 個地區大曲細菌類群的β多樣性；采用PICRUSt（phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states）軟件對大曲中細菌基因功能進行預測[21]。

1.3 數據處理

使用兩獨立樣本的非參數（Mann-Whitney）檢驗和多元方差分析（multivariate analysis of variance，MANOVA）解析2 個地區細菌類群的差異。使用R 軟件（v4.1.3）繪制箱型圖和PCoA 散點圖；使用在線網站（http://jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html）繪制Venn 圖；使用Origin 2017 軟件繪制堆積柱狀圖；使用在線網站（http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/）繪制LEfSe 圖；使用STAMP 軟件繪制菌群功能差異圖。

2 結果與分析

2.1 兩個地區中高溫大曲α 多樣性比較分析

基于高通量測序技術，28 份中高溫大曲共獲得1477414 條高質量16S rRNA 基因序列，每份樣品平均52764 條，采用100%和97%相似度進行序列劃分共得到9330 個OTU。超1 指數、發現物種數和香農指數、辛普森指數反映了微生物物種的豐富度和多樣性，指數越高代表物種的豐富度和多樣性越高[22]。本研究首先對2 個地區中高溫大曲的α多樣性進行了比較分析，結果如圖1 所示。

圖1 兩個地區中高溫大曲α 多樣性比較分析Fig.1 Comparative analysis of α diversity in medium-high temperature Daqu in two regions

由圖1 可知，2 個地區中高溫大曲的平均超1 指數分別為2310 和2625，平均發現物種數分別為1353 和1611，平均香農指數分別為5.35 和5.68，平均辛普森指數分別為0.85 和0.86，經Mann-Whitney檢驗分析發現，2 個地區大曲菌群在4 個α多樣性指數上差異均不顯著（P＞0.05）。

2.2 兩個地區中高溫大曲細菌群落結構分析

經序列比對發現，2 個地區中高溫大曲共鑒定到40 個門和904 個屬，其中，臨沂地區大曲鑒定到22 個門和522 個屬，周口地區大曲鑒定到39 個門和797 個屬。本研究將平均相對豐度＞1.0%的細菌門和屬定義為優勢細菌門和屬。基于門和屬水平2 個地區中高溫大曲細菌群落結構組成如圖2 所示。

圖2 基于門（a）和屬（b）水平的兩個地區中高溫大曲中細菌群落組成分析Fig.2 Analysis of bacterial community composition in medium-high temperature Daqu in two regions based on phylum (a) and genus (b) levels

由圖2a 可知，2 個地區中高溫大曲中優勢細菌門有4 個，分別為硬壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）。在臨沂和周口地區大曲中，Actinobacteria 的平均相對豐度分別為1.05%和4.38%，Bacteroidetes 分別為0.81%和2.86%，經Mann-Whitney 檢驗分析發現兩者差異顯著（P＜0.05）。

由圖2b 可知，2 個地區中高溫大曲中平均相對含量大于1.0%的屬有6 個，分別為芽孢桿菌屬（Bacillus）、高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、克羅彭斯特德菌屬（Kroppenstedtia）、地桿菌屬（Geobacter）和泛菌屬（Pantoea）。在臨沂和周口地區大曲中，Acinetobacter的平均相對豐度分別為8.08%和4.28%，Geobacter分別為0.002%和3.44%，Pantoea分別為0.43%和1.83%，經Mann-Whitney 檢驗分析發現差異均顯著（P＜0.05）。此外，魏斯氏菌屬（Weissella）和黏液乳桿菌屬（Limosilactobacillus）在周口地區大曲中的平均相對豐度僅為0.34%和0.04%，而其作為優勢細菌屬在臨沂地區大曲中平均相對豐度分別為1.74%和1.55%。有研究報道，在大曲發酵過程中Weissella和Limosilactobacillus等乳酸菌的代謝活動為發酵提供了酸性環境，有助于微生物群落的有效自我馴化，其中Weissella還參與了2,3-丁二醇的代謝，促進了大曲風味物質的積累[23]，除此之外，乳酸菌是大曲中的優勢細菌[24]，在白酒發酵過程中具有促進美拉德反應和保持釀酒微生態環境等作用[25]，是白酒風味物質演替的推動者之一。短波單胞菌屬（Brevundimonas）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）和金黃桿菌屬（Chryseobacterium）雖為周口地區大曲中的優勢細菌屬，平均相對豐度分別為1.50%、1.44%和1.07%，但其在臨沂地區大曲中的平均相對豐度僅為0.26%、0.18%和0.25%。ZHANG 等[26]發現Staphylococcus參與了2,3-丁二醇的代謝，且其代謝產生的水解長鏈脂肪酸和甘油的脂肪酶可生成游離脂肪酸和甘油，因而構成了白酒中香味物質本身或前體物質；姚亞林等[27]發現Brevundimonas具有較強水解淀粉和蛋白質的能力，在中溫和高溫大曲中與水分和淀粉的生成呈現正相關。亦有研究指出，Thermoactinomyces、Pantoea、Staphylococcus和Chryseobacterium在大曲開始發酵階段只存在于空氣中，之后隨著發酵溫度的降低才逐漸進入大曲中得到積累[28]。由此可見，2 個地區大曲細菌類群在屬水平上存在明顯差異，且在后續研究中積極探索周圍環境因素對大曲發酵過程中細菌群落的累積與代謝是極為必要的。

本研究進一步通過LefSe 對2 個地區中高溫大曲中的生物標志物進行了甄別，結果如圖3 所示。圖中柱長顯示了線性判別值，值越大其富集程度越高[29]。

圖3 LDA 線性判別分析圖Fig.3 LDA linear discriminant analysis diagram

由圖3 可知，在LDA 閾值得分為4.0 時，2 個地區中高溫大曲中共有9 個細菌類群存在顯著差異（P＜0.05），其中各有2 個、3 個、1 個、2 個和1 個分別體現在門、綱、目、科和屬水平上。在屬水平，Geobacter在周口地區大曲中富集，由此可見，Geobacter可作為周口地區大曲中的生物標志物；在屬水平，沒有細菌類群在臨沂地區大曲中富集，因而臨沂地區大曲中的生物標志物在屬水平未能體現。

2.3 兩個地區中高溫大曲菌群分布及β 多樣性分析

通過上述分析發現，2 個地區中高溫大曲細菌類群在門屬構成上存在一定的差異，因而為進一步直觀地展現其群落結構異同，本研究在OTU 水平上繪制了Venn 圖并基于UniFrac 距離進行了主坐標分析，結果如圖4 所示。

圖4 兩個地區中高溫大曲中細菌類群OTU 分布（a）及基于加權（b）和非加權（c）UniFrac 距離的PCoA 分析Fig.4 OTU distribution of bacterial taxa (a) and PCoA analysis based on weighted (b) and unweighted (c) UniFrac distance in medium-high temperature Daqu in two regions

由圖4a 可知，本研究共劃分了9330 個細菌OTU，其中2912 個OTU 為臨沂特有，1212 個OTU 為周口特有，5206 個OTU 為2 個地區共有。由此可見，2 個地區大曲既具有各自獨特的細菌類群，同時還含有共有的細菌群系。由圖4b 可知，在考慮各OTU 序列相對豐度的情況下進行主坐標分析時，第一主成分和第二主成分的總貢獻值為56.42%，2 個地區樣品間雖存在明顯的重疊現象，但亦具有一定的分離趨勢，經多元方差分析其方差值為5.81，結果可信度大于99.99%；由圖4c 可知，在僅考慮OTU 中是否含有序列的情況下進行主坐標分析時，臨沂地區大曲位于X 軸的正方向，周口地區大曲位于X 軸負方向，2 個地區樣品間存在明顯的分離趨勢，經多元方差分析其方差值為4.83，結果可信度大于99.99%。由此可見，2 個地區中高溫大曲中細菌類群在整體上存在明顯差異。

2.4 兩個地區中高溫大曲發酵菌群功能差異分析

在比較了2 個地區中高溫大曲細菌菌群結構的差異后，本研究對其菌群的基因功能亦進行了差異分析，將序列上傳至PICRUSt 軟件進行比對后得到具有差異的功能類群如圖5 所示。

圖5 兩個地區中高溫大曲菌群功能差異分析Fig.5 Analysis of microflora functional differences in medium-high temperature Daqu in two regions

由圖5 可知，相較于周口地區大曲，臨沂地區大曲菌群基因功能在未知功能、轉錄功能、氨基酸轉運與代謝功能、一般功能預測和核苷酸轉運與代謝功能上的表達均顯著偏高（P＜0.05），在細胞內運輸功能、翻譯后修飾，蛋白質周轉，伴侶功能、信號轉導機制功能和能量生產和轉換功能上的表達均顯著偏低（P＜0.05）。焦晶凱[30]的研究發現，乳酸菌的蛋白水解系統可為其生長提供所需氨基酸，結合大曲中細菌屬的分析結果來看，Weissella和Limosilactobacillus在臨沂地區大曲中平均相對豐度均＞1.0%，而其在周口地區大曲中平均相對豐度均不足0.4%，這可能是造成臨沂地區大曲中細菌氨基酸轉運與代謝功能較強的原因。由此可見，2 個地區中高溫大曲的細菌菌群基因功能亦存在明顯差異。

3 結論

本研究通過MiSeq 高通量測序技術對黃淮流域超級產區臨沂和周口地區中高溫大曲細菌群落結構和菌群基因功能進行了比較分析，結果發現，相較于周口地區大曲，臨沂地區大曲中Weissella和Limosilactobacillus平均相對豐度明顯偏高，Brevundimonas、Staphylococcus和Chryseobacterium平均相對豐度明顯偏低，且其在轉錄、氨基酸和核苷轉運與代謝功能表達上明顯偏高；Geobacter為周口地區大曲中的生物標志物，而臨沂地區大曲中的生物標志物在屬水平未能體現。由此可見，臨沂和周口地區中高溫大曲的細菌類群結構和菌群基因功能均存在明顯差異，并進一步證實了地域因素會對大曲細菌類群結構產生影響。