基于ISSR標記的航天香蕉新材料的遺傳特異性

王金英 李華盛 鹿金穎 蔡長福 蔡邦平

關鍵詞：航天育種；香蕉；ISSR；遺傳特異性

根據APGⅢ分類系統，香蕉（MusananaLour.）是單子葉植物分支下的姜目（Zingiberales）植物，屬于芭蕉科（Musaceae）芭蕉屬（Musa）。香蕉主要產于熱帶及亞熱帶地區，是世界上非常重要的一種熱帶水果和糧食作物，也是我國南部地區的重要經濟作物之一。福建省香蕉栽培歷史悠久，但是福建地處我國香蕉栽培適區的北緣，具有一定的局限性[1]。現今福建的香蕉產業受到病害、寒害或風害的嚴重威脅，以及外來或進口香蕉的沖擊，正面臨著規模萎縮的處境。因此，選育抗病、耐寒、優質、高產的香蕉新品種，已成為福建香蕉研究亟需解決的重要課題。

航天育種是利用太空環境中的極端條件（微重力、強輻射、高真空等因素），誘發植物的遺傳物質發生改變，從中選擇優良變異，培育優質、高產、多抗的植物新品種的育種方法[2]。將傳統的育種技術與航天誘變技術相結合實現育種目標的方法，已經得到國內外育種專家的廣泛認可。我國自1987年首次開展返回式衛星航天搭載水稻等農作物種子，距今已有30多年[3]。隨著我國航天事業的發展，通過航天育種方式已選育出一大批優質、高產、多抗的新品種，正服務并助推著相關產業的發展。航天育種為植物新品種的選育打開了新世界的大門，也為香蕉新品種的選育開拓了新的途徑。

簡單重復序列區間（inter-simplesequencerepeat，ISSR）是由ZIEDEWIEZ等[4]提出的、基于SSR的基礎上發展起來的一種DNA擴增多態性檢測技術。因其具有DNA模板用量少、引物設計簡單、操作快速高效、多態性好、穩定性好、可重復性高等優勢，常在植物遺傳多樣性、種質資源鑒定、分類及親緣關系分析等方面有廣泛的應用[5-8]。本研究以2份航天香蕉種質和18份其他香蕉種質為材料，通過ISSR標記技術，旨在構建航天香蕉新材料的分子指紋圖譜，以期為航天香蕉新品種的鑒定和分類提供參考。

1材料與方法

1.1材料

供試香蕉種質共20份，包括3個基因型（AAA、ABB、AA），其中18份來自廈門市園林植物園熱帶作物品種資源庫香蕉種質圃，2份航天誘變香蕉材料（即航蕉1號和航蕉2號）由航天神舟生物科技集團有限公司提供（表1）。2份航天誘變香蕉材料是以巴西蕉為親本，通過航天誘變、篩選而得。

以新鮮卷筒嫩葉作為提取香蕉DNA的材料。采集葉片組織時，按不同品種分別做好標識，迅速清洗擦凈，并盡快用液氮速凍處理，再轉至–80℃超低溫冰箱保存，備用。

1.2方法

1.2.1DNA的提取采用CTAB法提取DNA，主要步驟如下：（1）在液氮中將葉片組織迅速研磨至粉末狀，再迅速轉入2mL離心管中；加入1mL3%CTAB裂解液和20μLβ-巰基乙醇，搖勻，65℃水浴20～30min；（2）10000r/min離心10min，取上清液，加入500μL氯仿∶異戊醇（24∶1）溶液，混勻；（3）重復上一步驟；（4）10000r/min離心10min，吸取上清夜，加入2/3體積的異丙醇，混勻；（5）10000r/min離心5min，棄上清夜，留下絮狀沉淀，加入200～300μL70%乙醇清洗，再離心5min；（6）待乙醇揮發后，將沉淀用200μLddH2O保存于4℃下，備用（長期保存于–20℃冰箱）。

1.2.2PCR反應和電泳檢測采用反應體系：10μL2×TaqPCRmixture，2μLPrimer（10μmol/L），30ngDNAtemplate，加重蒸水補足至20μL。

PCR擴增循環體系：反應條件為94℃預變性4min；94℃變性30s，54℃退火40s，72℃延伸90s，45個循環；最后72℃延伸6min，于4℃保存。

PCR擴增產物在2%瓊脂糖上進行電泳檢測，拍照記錄檢測結果。

1.3數據處理

根據電泳檢測結果，采用人工計數的方法讀取條帶并統計，同一條引物擴增出的相同條帶記為數值1，無相同條帶則記為0，由此構建出0-1數據矩陣。根據所得到的數據矩陣，利用NTSYSpcversion2.10e統計軟件計算各香蕉種質間的遺傳相似系數（coefficient），并采用該軟件中的非加權組平均法（unweightedpair-groupmethodwitharithmeticmeans，UPGMA）進行聚類分析[9]。

2結果與分析

2.1ISSR標記多態性分析

從30條ISSR引物中，篩選出清晰、穩定性高、重復性好的2條擴增條帶，并呈多態性的引物（表2、圖1）。2條ISSR引物在20份香蕉種質資源中，共擴增獲得17條清晰的條帶，條帶的片段長度范圍為300～2500bp，其中多態性條帶共有13條，平均多態性比率為76.47%。

在17條總條帶的17個位點中，航蕉1號（20號泳道）相比親本巴西蕉（16號泳道）有4個特異性位點，另有13個相似位點，特異性位點占23.53%；航蕉2號（19號泳道）相比親本巴西蕉有3個特異性位點，另有14個相似位點，特異性位點占17.65%。

由此可見，參試的20份香蕉種質資源具有較高的ISSR多態位點，在DNA分子水平上的遺傳多樣性比較豐富。同時，供試的航天香蕉材料（即航蕉1號和航蕉2號）與親本巴西蕉之間存在明顯的差異性。

2.2航天香蕉材料的遺傳特異性分析

ISSR引物UBC881的擴增結果顯示：在分子量為1000bp的位置，1、3～20號泳道均有1條明亮的特異性條帶，僅2號柴蕉的條帶較弱；7號貢蕉在分子量約為1300bp的位置無特異性條帶，其他材料均有條帶擴增；在分子量分別約為2000bp和2500bp的位置，19號泳道上的航蕉2號和20號泳道上的航蕉1號均無條帶擴增（圖1A，箭頭所示位置），而其他香蕉種質，包括親本巴西蕉（16號泳道）在此位置均有擴增產物。因此，ISSR引物UBC881可以將2個航天香蕉材料與親本巴西蕉，以及柴蕉、貢蕉等其他18個香蕉種質區分開。

ISSR引物UBC847電泳結果顯示：在分子量約為1800bp位置，2號泳道存在特異性條帶缺失的現象；約800bp位置，7號泳道存在特異性條帶缺失的現象；在分子量約為750bp的位置，航蕉1號（泳道20）和3號有1條較明顯的亮色條帶（圖1B，箭頭所示位置），而其他香蕉種質，包括親本巴西蕉（16號泳道）在該位置無擴增條帶。由此可見，ISSR引物UBC847可以將航天香蕉材料航蕉1號與航蕉2號，以及其他18種香蕉種質進行區分。

2.3香蕉種質資源的遺傳相似系數

根據0-1數據矩陣，利用NTSYSpcversion2.10e統計軟件計算各香種質間的遺傳相似系數（表3）。20個供試香蕉種質間的遺傳相似性系數介于0.545～1.000之間，平均遺傳相似性系數為0.905。

其中華南甜蕉、漳州選、河口高把、天寶矮蕉、龍州中把、廣東2號、齊尾、安定高芽、菲律賓之間，以及高腳遁地雷、威廉斯8188、索馬里強、北大矮、巴西蕉之間的遺傳相似性系數最大，為1.000，顯示各個種質間具有較近的親緣關系。柴蕉與貢蕉之間的遺傳相似性系數最小，為0.545，說明它們彼此之間存在較大的遺傳差異。

航天香蕉材料航蕉1號與航蕉2號之間的遺傳相似性系數為0.952，航蕉2號與其他18個香蕉品種間的遺傳相似性系數為0.667～0.909，航蕉1號與其他18個香蕉種質間的遺傳相似性系數為0.636～0.870。其中航蕉1號（20號材料）與親本巴西蕉（16號材料）的遺傳相似性系數為0.833；航蕉2號（19號材料）與親本巴西蕉的遺傳相似性系數為0.870。

綜上，2種航天香蕉材料之間、2種航天香蕉材料與親本巴西蕉之間、以及2種航天香蕉材料與其他17個香蕉種質間均具有一定的遺傳差異，從數值上來看，在DNA分子水平上，航蕉1號與其他18個香蕉種質的遺傳差異大于航蕉2號。

2.4香蕉種質資源聚類分析

基于ISSR擴增結果，根據20份香蕉種質的遺傳相似性系數，按照UPGMA法進行聚類分析得到親緣關系樹狀圖（圖2）。從圖2可以看出，設定遺傳相似性系數為0.850時，供試的20份香蕉種質群體可簡單地分為2個類群（Ⅰ、Ⅱ），其中類群Ⅰ僅有柴蕉1種，其他19種香蕉種質均歸為類群Ⅱ，說明柴蕉與其他19種香蕉之間的親緣關系較遠。在類群Ⅱ中，當設定遺傳相似性系數為0.880時，即可判斷供試的目標材料航蕉1號、航蕉2號與親本巴西蕉，以及其他16種香蕉材料的親緣關系有較大差異。當設定遺傳相似性系數為0.900時，類群Ⅱ又分為4個亞類，即航蕉1號和航蕉2號為1個亞類（Ⅱa），貢蕉為1個亞類（Ⅱb），那龍高把和那坡高把為1個亞類（Ⅱd），其他14種香蕉品種為1個亞類（Ⅱc），4個亞類之間聚類差異明顯。當遺傳相似性系數為0.960時，可分為8類，可看出航天香蕉材料航蕉1號和航蕉2號之間有明顯的聚類差異，存在遺傳多樣性。而華南甜蕉、漳州選、河口高把、天寶矮蕉、龍州中把、廣東2號、齊尾、安定高芽、菲律賓之間，以及高腳遁地雷、威廉斯8188、索馬里強、北大矮、巴西蕉之間無明顯的聚類差異，說明這些種質間親緣關系相對較近。

3討論

目前，ISSR分子標記技術在植物遺傳育種以及種質資源研究中已得到廣泛應用，范圍涉及糧、油、果、蔬作物以及觀賞、藥用植物等。張超等[10]應用ISSR標記技術對103份裸大麥進行分析，得出裸大麥的地理分布與遺傳多樣性的關系。丁燦等[11]通過ISSR標記對油棕新品種進行了遺傳多樣性分析。趙依杰等[12]利用ISSR標記技術，鑒定了枇杷的新品種東湖早。周成城等[13]采用ISSR標記對18份櫻屬材料進行了有效區分和鑒定，并進一步分析了材料之間的親緣關系。ISSR標記技術在香蕉方面的研究也有報道，包括香蕉種質資源[14-15]、遺傳多樣性[16-18]、親緣關系[19-20]、品種選育[21-22]、抗病性研究[23-24]等。這些研究充分說明了ISSR分子標記技術在香蕉研究應用上的可行性。

浩瀚無際的太空已然成為人類探索研究農業生產、植物育種的新基地。本課題組所選育的2份航天香蕉材料（航蕉1號和航蕉2號）是以巴西蕉為母本，在航天空間誘變的基礎上，經過連續栽培選育出來的。本研究在ISSR分子標記的層面上，從30條引物中，篩選出2條引物構建DNA數字化指紋圖譜進行遺傳特異性分析，得出供試的目標材料航蕉1號與航蕉2號存在特異性位點可區別于其他18份香蕉種質，航蕉1號相比親本巴西蕉特異性位點占23.53%，航蕉2號相比親本巴西蕉特異性位點占17.65%。航蕉1號與巴西蕉的遺傳相似性系數為0.833，航蕉2號與巴西蕉的遺傳相似性系數為0.870，2種航天材料與其他18份香蕉種質存在明顯的聚類差異。結合田間觀察，航蕉1號、航蕉2號與親本巴西蕉在表型性狀上也存在一定的差異，如植株大小、果穗果實形態、果實產量等性狀。根據試驗結果分析得出，航蕉1號、航蕉2號與母本巴西蕉（基因型均為AAA）三者之間，以及與其他17份香蕉種質之間存在明顯的遺傳特異性，研究結果為新品種的分類鑒定和保護提供了科學依據，也為香蕉種質資源的創新和新品種選育提供參考。

根據聚類分析結果，結合各香蕉種質的基因型特點，可以得出柴蕉（基因型為ABB）和貢蕉（基因型為AA）之間存在差異，同時與其他香蕉種質（基因型為AAA）之間也有明顯不同的表現，可以初步說明基因型不同的香蕉種質之間親緣關系相對較遠，表現出明顯的遺傳差異，這與前人的研究結果[16-17]基本一致。雖然巴西蕉是2種航天香蕉材料的親本，但是從聚類圖可以看出，航蕉1號、航蕉2號與巴西蕉之間的遺傳距離相對較遠，說明航天搭載可使巴西蕉的遺傳物質在某些特定的位點發生較大的改變，充分證明了航天搭載是一種非常行之有效的誘變育種技術，故而可從變異后代中選育出新品種[24]。但是，航蕉1號、航蕉2號與巴西蕉之間的遺傳距離相對較遠，以及基因型AA的貢蕉與基因型為AAA的香蕉材料未被簡單地分成2類，這并不排除由于本研究為了區分2份航天香蕉目標材料與其他材料之間的遺傳差異，而篩選所用的引物數量較少的原因。