尿沉渣中鈣信號相關(guān)mRNA 作為IgA 腎病足細(xì)胞損傷無創(chuàng)性指標(biāo)的研究

劉 翔 湯絢麗 余 瑾

IgA 腎病（IgA nephropathy，IgAN）是目前最常見的原發(fā)性慢性腎小球疾病，5%～25%的IgAN 患者10年內(nèi)進(jìn)展為終末期腎臟病（end-stage renal disease，ESRD），需行腎臟替代治療[1]。近年來，足細(xì)胞在IgAN中，致病作用受到更多關(guān)注，足細(xì)胞損傷與蛋白尿及IgAN 病情進(jìn)展正相關(guān)[2]。傳統(tǒng)的免疫熒光染色技術(shù)測定尿足細(xì)胞，因受染色費(fèi)時(shí)，依賴培訓(xùn)的個人技術(shù)等限制，陽性率及準(zhǔn)確性大大下降。隨著對尿足細(xì)胞生物標(biāo)志物研究的深入，監(jiān)測尿沉渣中mRNA 和蛋白質(zhì)被認(rèn)為是量化足細(xì)胞損害的工具。在體內(nèi)外研究中發(fā)現(xiàn)，鈣依賴的經(jīng)典瞬時(shí)受體電位陽離子通道蛋白（transient receptor potential canonical，TRPC）6 介導(dǎo)鈣依賴的足細(xì)胞損傷，尿鈣蛋白酶（Calpain）活性亦能反映足細(xì)胞的損傷，并證實(shí)單體漢防己甲素可以通過干預(yù)TRPC6 介導(dǎo)的鈣依賴信號途徑改善足細(xì)胞損傷[3-4]。本實(shí)驗(yàn)通過提取IgAN 患者予單體漢防己甲素治療前后尿沉渣中鈣信號相關(guān)mRNA 及細(xì)胞骨架相關(guān)錨定蛋白Talin-1、足細(xì)胞骨架蛋白synaptopodin mRNA，觀察上述生物標(biāo)志物能否實(shí)時(shí)反映該病變的動態(tài)演變。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015 年9 月至2017 年8 月杭州市中醫(yī)院腎病科收治的經(jīng)首次腎組織活檢病理明確診斷為原發(fā)性IgAN 患者36 例為IgAN 組。選取同期常規(guī)體檢正常（只尿液檢查，不腎穿），無高血壓、糖尿病及心腎疾病史的8 例我科醫(yī)務(wù)人員建立健康對照組。本研究取得受試對象或其親屬知情同意，并通過浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬杭州市中醫(yī)院倫理委員會審批，倫理批號為2015KY035。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 腎組織活檢明確以IgA 沉積為主的系膜增生性腎小球腎炎，排除繼發(fā)性IgAN，包括過敏性紫癜性腎炎、乙肝相關(guān)性腎炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等。

1.3 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）原發(fā)性IgAN患者且腎活檢病理光鏡下小球數(shù)＞10 個。（2）有完整腎活檢病理及臨床資料。（3）年齡在18～60 歲之間。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并有心、腦、肺、肝、造血系統(tǒng)等嚴(yán)重系統(tǒng)性疾病，惡性腫瘤患者；（2）排除各種急慢性感染，例如肺部感染、慢性阻塞性肺疾病、泌尿系感染、活動性結(jié)核、慢性病毒性肝炎等，或腎移植術(shù)后者。

1.4 方 法 選取其中12 例IgAN 患者（1 g/24 h≤蛋白尿≤3 g/24 h，及血肌酐≤264 μmol/L）進(jìn)行治療，口服漢防己甲素（規(guī)格20 mg，浙江康恩貝生物制藥公司）40 mg 每天3 次，治療時(shí)間2 個月。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 臨床指標(biāo) 收集腎活檢時(shí)患者的年齡、性別、病程、平均動脈壓（mean arterial pressure，MAP）、血白蛋白（albumin，Alb）、血肌酐（serum creatine，Scr）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、腎小球?yàn)V過率（estimated glomerular filtration rate，eGFR）等，尿檢包括尿常規(guī)紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、24 h 尿蛋白定量。并根據(jù)24 h尿蛋白定量的嚴(yán)重程度進(jìn)行半定量分級，＜0.5 g，評分為0；0.5～＜1 g，評分為1；1～＜3 g，評分為2；≥3 g，評分為3。其中MAP 定義為舒張壓+1/3 脈壓差。eGFR 采用慢性腎臟病流行病學(xué)合作研究（Chronic Kidney Disease Epidemiology Collaboration，CKD-EPI）公式計(jì)算[5]。GFR=a×（血肌酐濃度/b）c×（0.993）年齡；a 值女性=144，男性=141；b 值女性=0.7，男性=0.9；c 值女性：血清肌酐≤0.7 mg/dL=-0.329，＞0.7 mg/dL=-1.209；男性血清肌酐≤0.7 mg/dL=-0.411，＞0.7 mg/dL=-1.209。

1.5.2 腎臟病理 所有腎活檢標(biāo)本常規(guī)處理，免疫熒光，光鏡及電鏡檢查。參照牛津MEST-C 評分對病理進(jìn)行評分[6]。并將鏡下足細(xì)胞損傷按照足突融合的程度分為4 個等級（小部分融合：足突融合≤25%；部分融合：25%＜足突融合≤50%；大部分融合：50%＜足突融合≤75%；廣泛融合：足突融合＞75%）。

1.5.3 免疫組織化學(xué)法測定TRPC6 進(jìn)行免疫組化半定量分析，每例患者的切片中至少觀察5 個完整的腎小球，利用Image Pro Plus 6.0 圖像分析軟件進(jìn)行分析，測定每個腎小球中TRPC6 陽性面積占其整個腎小球面積的比，取平均值作為此標(biāo)本中腎小球TRPC6 陽性面積所占的比值。

1.5.4 尿足細(xì)胞熒光測定 采用晨尿標(biāo)本50 mL，離心后棄上清，留沉渣混勻，間接免疫熒光法測定足細(xì)胞表達(dá)，高倍鏡下確認(rèn)足細(xì)胞、攝像、計(jì)算機(jī)儲存。然后選擇左上、左下、右上、右下和中間，5 個不同部位，共計(jì)20 個高倍視野，記錄下熒光顯示呈（+++）且形態(tài)相對完整的足細(xì)胞數(shù)。

1.5.5 尿沉渣中鈣依賴的足細(xì)胞相關(guān)蛋白TRPC6以及Calpain、骨架蛋白Talin-1、synaptopodin mRNA測定 同一份晨尿標(biāo)本20 mL，1 h 內(nèi)處理，離心后棄去上清，留取尿沉渣，采用Trizol 法對尿沉渣的總RNA 進(jìn)行提取，并完成質(zhì)量檢測。提取細(xì)胞總RNA，PrimeScriptTMRTMaster 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用Power－SYBRGreen 進(jìn)行qRT-PCR 檢測。使用2-ΔΔCt方法歸一化目的基因的表達(dá)。本研究所用引物由上海生工公司設(shè)計(jì)及合成。引物序列如下：TRPC6 F：5'-AGTTCCTTGTGGTCCTTGCTGTTG-3'，R：5'-GAAGGAGGCTGCGTGTGCTAC-3'；Calpain-1 F：5'-CGAACTTCATGCGGGAGTTCAC-3'，R：5'-GTGCCTTCGTAGAGTGTGGTGTTC-3'；Talin-1 F：5'-CTGGTACTGCGTCTGTGGTGAAC-3'，R：5'-GGTTGGAGGAGATTGTGGTGACTG-3'；synaptopodin F：5'-GCCCAAACCCAACCAGAACCTC-3'，R：5'-CTGGCGTGTGGCTTGAAGACTC-3'；Nephrin F：5'-CCCCAACATCGACTTCACTT-3'；R：5'-GGCAGGAVATCCRTGAG-3'；GAPDHF：5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'；R：5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 23.0 軟件包，計(jì)量資料方差齊性以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，治療前后比較采用配對t 檢驗(yàn)；方差不齊用中位數(shù)及四分位數(shù)表示，用Mann-Whitney 非參數(shù)檢驗(yàn)結(jié)果。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和/或百分?jǐn)?shù)表示，兩組間比較采用卡方檢驗(yàn)。多組間比較，采用Kruskal-Wallis 秩和檢驗(yàn)。運(yùn)用Spearman rank方法分析各目的基因表達(dá)量與臨床指標(biāo)間的關(guān)聯(lián)性。構(gòu)建受試者工作特征（ROC）曲線評估各目的基因診斷的敏感度及特異度。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組研究對象一般資料比較 兩組研究對象年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。IgAN 組高血壓比例高于健康對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組研究對象一般資料比較

2.2 兩組研究對象尿沉渣鈣信號相關(guān)蛋白TRPC6以及Calpain、骨架蛋白Talin-1、synaptopodin 的mRNA 比較 兩組研究對象尿沉渣中Calpain-1 mRNA 比較，IgAN 組較健康對照組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。兩組間TRPC6、Talin-1 及synaptopodin mRNA 比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

2.3 尿TRPC6 mRNA 與腎組織TRPC6 之間的關(guān)系

在正常腎組織中，腎小球臟層上皮細(xì)胞（足細(xì)胞）僅有少量TRPC6 表達(dá)或者不表達(dá)，TRPC6 在腎小管上皮細(xì)胞和間質(zhì)的血管壁也有少量表達(dá)。IgAN 各組足細(xì)胞上的TRPC6 表達(dá)都增加。見圖1。

不同水平的尿mRNA，其腎組織中TRPC6 的表達(dá)不同，與健康對照組0.05（0.02，0.08）相比，10≤尿TRPC6 mRNA＜100 組2.70（1.99，3.42），及尿TRPC6 mRNA≥100 組5.64（2.77，8.34）腎組織中TRPC6 陽性面積明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。10≤尿TRPC6 mRNA＜100 組相比于TRPC6 mRNA≥100 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表2 兩組研究對象尿沉渣鈣信號相關(guān)蛋白及骨架蛋白mRNA 比較

圖1 不同組間腎小球TRPC6 免疫組化圖（×400）

2.4 足細(xì)胞陰性與陽性組臨床資料及尿mRNA 比較 兩組患者病理上S 及T 的積分比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。兩組患者尿mRNA 比較，足細(xì)胞陽性組較陰性組尿TRPC6 mRNA 及Calpain-1 mRNA 水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。兩組患者一般資料中血肌酐、24 h 尿蛋白定量、血白蛋白、eGFR 比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。2.5 尿液mRNA 水平與臨床病理指標(biāo)相關(guān)性分析尿TRPC6 mRNA 與Calpain mRNA 及synaptopodin mRNA 呈現(xiàn)正相關(guān)（r=0.626，P=0.001；r=0.734，P＜0.001），與Talin-1 mRNA 無相關(guān)性，尿Calpain mRNA 與synaptopodin mRNA 呈現(xiàn)正相關(guān)（r=0.626，P=0.001）。

尿TRPC6 mRNA 與蛋白尿分級水平呈現(xiàn)正相關(guān)（r=0.407，P=0.049），與足細(xì)胞融合的程度呈現(xiàn)正相關(guān)（r=0.452，P=0.027）。尿Calpain mRNA 與蛋白尿分級水平呈現(xiàn)正相關(guān)（r=0.493，P=0.014），與MAP 呈現(xiàn)正相關(guān)（r=0.469，P=0.021）。

2.6 ROC 曲線下面積分析 利用各項(xiàng)測得的尿mRNA 指標(biāo)評估足細(xì)胞損傷（足突融合分級≥3），尿TRPC6 mRNA 預(yù)測足細(xì)胞損傷的曲線下面積（AUC）為0.705（P=0.048），敏感度和特異度為66.7%和33.3%（見圖2），尿Calpain-1 mRNA 的AUC 為0.580，但P 值＞0.05（P=0.440），而尿synaptopodin mRNA、Talin-1 mRNA 的AUC 均＜0.05。見圖2。

2.7 治療前后臨床指標(biāo)及尿液mRNA 對照 與治療前比較，治療后24 h 尿蛋白定量減少，MAP 較前下降，相應(yīng)的尿TRPC6 mRNA 及Calpain-1 mRNA水平較治療前下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），尿足細(xì)胞陽性人數(shù)較治療前減少，但差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），尿Talin-1 mRNA 及synaptopodin mRNA 水平未見明顯差異（P＞0.05）。見表4。

3 討 論

IgAN 患者尿液中包含許多生物學(xué)信息，主要包括各種細(xì)胞因子、趨化因子、脫落細(xì)胞及其相關(guān)的mRNA 等。近10 年以來，研究和發(fā)掘尿中生物標(biāo)志物，以期更好地診斷和評估IgAN，一直是國內(nèi)外眾多學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)。

目前多種研究證實(shí)IgAN 存在足細(xì)胞損傷的機(jī)制，IgAN 患者血清中分離的IgA1 糖基化異常可誘導(dǎo)足細(xì)胞炎癥反應(yīng)和纖維化，分泌促炎性細(xì)胞因子，促進(jìn)與IgAN 相關(guān)的炎癥級聯(lián)反應(yīng)和腎纖維化變化[7]，并進(jìn)而引起腎小球硬化[8]。因此監(jiān)測、防治IgAN 足細(xì)胞損傷是治療IgAN 的重要環(huán)節(jié)。

表3 足細(xì)胞陽性組與陰性組IgAN 患者臨床資料及尿mRNA 比較

圖2 受試者工作特征曲線下面積預(yù)測足細(xì)胞損傷

尿足細(xì)胞測定大多使用傳統(tǒng)的免疫熒光染色技術(shù)進(jìn)行相對計(jì)數(shù)，但受染色費(fèi)時(shí)、檢測員技術(shù)、尿液污染、清洗過程中丟失、去分化尿足細(xì)胞未被識別等限制，陽性率較低。與監(jiān)測細(xì)胞及蛋白標(biāo)志物相比，尿沉渣mRNA 或許更能作為慢性腎臟病的生物標(biāo)志物。研究發(fā)現(xiàn)，NPHS1、TRPC6 等可通過異常表達(dá)導(dǎo)致蛋白尿性腎臟疾病的發(fā)生，synaptopodin、Talin-1等因其功能異常，導(dǎo)致足細(xì)胞功能和結(jié)構(gòu)異常[9-10]。

TRPC6 陽離子通道開放能引起鈣離子內(nèi)流，介導(dǎo)鈣相關(guān)的信號通路激活，導(dǎo)致足細(xì)胞骨架蛋白改變，引起細(xì)胞脫落凋亡，導(dǎo)致濾過屏障完整性喪失，產(chǎn)生大量蛋白尿[4]。在我們的研究中，相比較正常人群，IgAN 患者的尿液中TRPC6 mRNA 表達(dá)升高，且免疫組化亦證實(shí)尿中TRPC6 mRNA 升高可以在一定程度上反映腎組織中TRPC6 表達(dá)的水平。同時(shí)，與正常人群比較，IgAN 患者尿液中Calpain-1 表達(dá)升高，尿synaptopodin、Talin-1 mRNA 未見明顯升高，可能與足細(xì)胞對相關(guān)分子的排泄不遵循一個均勻的模式及骨架蛋白上游影響因素多等原因相關(guān)。

我們將患者分為尿足細(xì)胞陰性及陽性組，足細(xì)胞陽性組的患者臨床表現(xiàn)較重，表現(xiàn)為血肌酐及蛋白尿的升高，病理上S 及T 的積分重于足細(xì)胞陰性組，與此同時(shí)，尿足細(xì)胞陽性組其尿TRPC6 mRNA水平及Calpain-1 mRNA 表達(dá)高于足細(xì)胞陰性組，且尿足細(xì)胞鈣信號相關(guān)mRNA 指標(biāo)之間有著微妙的相關(guān)聯(lián)系，表現(xiàn)為尿TRPC6 mRNA、Calpain mRNA、synaptopodin mRNA 三個指標(biāo)呈現(xiàn)兩兩正相關(guān)，提示在IgAN 足細(xì)胞損傷的患者中，鈣信號通路起了一定的作用，且能在尿中反映相應(yīng)損傷。尤其是TRPC6 mRNA、Calpain-1 mRNA 從病理生理學(xué)角度來說，這兩者之間聯(lián)系更為密切。

上述尿足細(xì)胞相關(guān)mRNA 也可反映臨床病理改變。尿TRPC6 mRNA、Calpain-1 mRNA 與IgAN 蛋白尿分級水平呈現(xiàn)正相關(guān)，尿TRPC6 mRNA 與電鏡上的足細(xì)胞融合程度正相關(guān)。進(jìn)一步利用ROC 曲線預(yù)測足細(xì)胞損傷，尿TRPC6 mRNA 反映IgAN 患者足細(xì)胞的損傷程度AUC 為0.705，敏感度和特異度為66.7%和33.3%，相比熒光尿足細(xì)胞陽性，更能反映足細(xì)胞融合程度。

既往對尿足細(xì)胞測定的研究多為斷點(diǎn)研究，難以用于實(shí)時(shí)監(jiān)測疾病動態(tài)演變及判斷病情。由于漢防己甲素可作用于鈣信號，保護(hù)足細(xì)胞，我們治療干預(yù)后，重復(fù)測定上述尿mRNA 水平，以評價(jià)其是否可作為動態(tài)監(jiān)測IgAN 足細(xì)胞損傷指標(biāo)，及評價(jià)藥物療效的指標(biāo)。12 例IgAN 患者治療后，伴隨24 h 尿蛋白定量減少和MAP 的下降，相應(yīng)的尿TRPC6 mRNA及Calpain-1 mRNA 水平較治療前下降，有一定的評價(jià)療效的作用。但本次研究樣本量少、隨訪觀察時(shí)間短，且為開放式觀察，有待于我們擴(kuò)大樣本量，延長治療、隨訪時(shí)間，為尿TRPC6 mRNA 及Calpain-1 mRNA 作為評估IgAN 足細(xì)胞損傷及評價(jià)療效的生物標(biāo)記物提供更充分的證據(jù)。