產β?葡萄糖苷酶植物乳植桿菌c4?3發酵豆漿的營養評價和代謝分析

鮑捷，代藝偉，陳映羲，梁會朋，林心萍，張素芳*

（1.大連工業大學國家海洋食品工程技術研究中心，遼寧大連 116034；2.大連工業大學食品學院，遼寧大連 116034）

大豆作為世界重要糧食作物，富含多種營養和人體所需物質，包括蛋白質、油脂[1?2]、維生素[3]常見物質，以及異黃酮、酚類[2，4]、萜類[5]等次生代謝產物。大豆中天然存在的異黃酮多為糖苷型異黃酮（soybean isofla?vone glycoside，SIG），人體吸收利用率較差，其可通過腸道微生物產生的β?葡萄糖苷酶水解為配基型異黃酮（soybean isoflavone aglycones，SIA），能夠被人體更好地吸收利用[6]。有許多研究已經證明，通過添加產β?葡萄糖苷酶的微生物對豆漿進行發酵，可以提高豆漿中配基型異黃酮的含量[7]。此外，微生物發酵作為傳統加工工藝，在實際發酵體系中，因為微生物產生的酶系復雜，會有多種代謝產物生成，對營養提升和有害物質的代謝有著極佳處理效果，為發酵食品提供更高價值。

為了研究產β?葡萄糖苷酶的菌株在發酵豆漿時菌株的代謝行為和豆漿營養成分的變化，本文選取一株前期篩選到的產β?葡萄糖苷酶的植物乳植桿菌c4?3發酵豆漿，測定發酵前后豆漿中大豆異黃酮種類和含量；并進行非靶向代謝組學分析，利用液相色譜四極桿串聯飛行時間質譜儀（liquid chromatograph?quadru?pole?time of flight，LC?QTOF），通過主成分分析（princi?pal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘判別分析（orthogonal projections to latent structures?discriminant analysis，OPLS?DA）等方法，分析發酵前后豆漿中SIG 的代謝，并確定主要代謝通路。同時，解析植物乳植桿菌c4?3發酵豆漿中除異黃酮外，其他營養物質或有害物質的含量變化，以整體評價植物乳植桿菌c4?3 代謝行為。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

產β?葡萄糖苷酶的植物乳植桿菌c4?3（Lactiplan?tibacillusplantarumc4?3）：大連工業大學中國海洋食品研發中心；大豆：市售；MRS 肉湯培養基、瓊脂粉：青島高科技工業園海博生物技術有限公司；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、甲酸（色譜純）、大豆苷元（≥98%）、大豆苷、金雀異黃酮（≥98%）、染料木素：上海麥克林生化科技有限公司；甲醇（色譜純）：斯百全化學（上海）有限公司；L?2?氯苯丙氨酸（≥98%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；冰乙酸（色譜純）：生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.2 儀器與設備

pH 計（多參數測試儀S400?B）：梅特勒?托利多儀器（上海）有限公司；高效液相色譜儀（Agilent 1260 In?finity）、Acquity UPLC HSS T3 色譜柱（1.8μm，2.1 mm×100 mm）：安捷倫（美國）科技有限公司；超高效液相色譜儀（ACQUITY UPLC I?Class）、高分辨質譜儀（UPLC Xevo G2?XS QTOF）：沃特世科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 發酵豆漿的制備

挑取植物乳植桿菌c4?3 單菌落接種于MRS 液體培養基，培養至OD600=0.6。取200 g 已浸泡10 h 的大豆，加水至1 000 mL，豆漿機研磨破碎后，采用60 目篩過濾豆漿，121 ℃滅菌15 min，分裝于50 mL 離心管中，每管分裝5 mL。按照1%接種量，將活化好的菌株接種于豆漿，37 ℃、200 r/min 培養12 h，得到發酵豆漿。

1.2.2 發酵豆漿的產酸速率測定

在豆漿發酵2、4、6、8、10、12 h 時，分別用pH 計和酸堿滴定法測量pH 值和滴定酸度，表征產酸速率。

1.2.3 發酵豆漿異黃酮含量測定

取15 mL 發酵豆漿在-80 ℃預凍12 h，再凍干72 h。參考Rostagno 等[8]的方法提取異黃酮，取0.5 g 凍干豆漿，加入15 mL 50%乙醇溶液，超聲2 h 后，8 000 r/min離心30 min，取上清液，0.22μm 濾膜過濾。

參考Wu 等[9]的高效液相色譜法測定異黃酮含量。選取常見的4 種異黃酮進行測定，包括屬于SIG 的大豆苷和染料木素，以及屬于SIA 的金雀異黃酮和大豆苷元。通過添加內標確定出峰時間，并根據標品所得回歸方程換算樣品中4 種異黃酮含量。

1.2.4 發酵豆漿的可溶性蛋白含量測定

參考吳成[10]的方法，繪制可溶性蛋白標準曲線，得到標準曲線y=2.114x+0.560 7（R2=0.999），并根據標準曲線計算豆漿中可溶蛋白含量。

1.2.5 發酵豆漿氨基態氮含量測定

參考徐鑫等[11]的方法測定發酵豆漿的氨基態氮含量。取發酵豆漿1.25 mL，定容于25 mL 容量瓶，測量用去離子水作空白對照，甲醛滴定法測定發酵豆漿的氨基態氮含量，記錄使用NaOH 標準溶液的體積，氨基態氮含量計算公式如下。

式中：X為氨基態氮含量，g/100 mL；V為樣品滴定消耗氫氧化鈉體積，mL；V0為空白樣品消耗氫氧化鈉體積，mL；N為NaOH 標準溶液濃度，0.1 mol/L；0.014為氮的毫克當量。

1.2.6 發酵豆漿的持水力測定

參考Wang 等[12]的方法測定發酵豆漿持水力，計算公式如下。

式中：W為發酵豆漿持水力，%；W1為離心后樣品的質量，g；W2為離心前樣品的質量，g。

1.2.7 發酵豆漿的抗氧化能力測定

抗氧化能力的測定采用1，1?二苯基?2?三硝基苯肼（1，1?diphenyl?2?picrylhydrazyl，DPPH）法和2，2?聯氮?二（3?乙基?苯并噻唑?6?磺酸）二銨鹽[2′?azinobis?（3?ethylbenzthiazoline?6?sulphonate），ABTS]法測定。

1.2.7.1 DPPH 自由基清除率的測定

分別取2 mL 發酵后的豆漿，在10 000 r/min 條件下離心10 min。取1 mL 離心上清液，超純水稀釋4 倍，參考鄭茵[13]的方法測定DPPH 自由基清除率，計算公式如下。

式中：Y為DPPH 自由基清除率，%；Ai為1 mL DPPH+1 mL 樣品的吸光度；Aj為1 mL 蒸餾水+1 mL 樣品的吸光度；Ac為1 mL DPPH+1 mL 蒸餾水的吸光度。

1.2.7.2 ABTS+自由基清除率的測定

分別取2 mL 豆漿，在10 000 r/min 條件下離心10 min，取1 mL 離心上清液，超純水稀釋10 倍，參考鄭茵[13]的方法測定ABTS+自由基清除率，計算公式如下。

式中：N為ABTS+自由基清除率，%；AS為樣品的吸光度；AC為對照品的吸光度。

1.2.8 發酵豆漿的總酚含量測定

參考李穎等[14]的方法，繪制沒食子酸標準曲線，得到y=0.250 5x-0.202，并根據標曲計算發酵豆漿中的總酚含量。

1.2.9 發酵豆漿代謝組測定

選用L?2?氯苯丙氨酸作為內標，參考Dunn 等[15]、Want 等[16]的方法并稍作修改。量取100 μL 發酵豆漿，加入500 μL 含有內標的提取液，渦旋混勻30 s。之后置于冰水浴下超聲10 min。采用超高效液相色譜串聯高分辨質譜儀測定，進樣體積為1 μL，其余條件參考Wang 等[17]的方法。

1.3 數據處理

1）β?葡萄糖苷酶及大豆異黃酮的數據分析使用Origin 2019b 軟件。GraphPad Prism 9.0.0.121 軟件用于分析差異以計算p值。采用生物學重復進行，所有試驗完成3 個平行，數據以平均值±標準差表示。使用單因素方差分析和鄧肯多范圍檢驗確定平均值的顯著差異。2）代謝組學試驗使用UHPLC/QTOF?MS 進行原始數據導出及收集。3）代謝組學數據預處理：將數據導入Progenesis QI 軟件做峰提取、峰對齊等數據處理操作，計算峰強度，精確質量和保留時間，基于Progen?esis QI 軟件在線METLIN 數據庫、公共數據庫以及百邁客自建庫進行鑒定，同時進行理論碎片識別，母離子質量數偏差100 ppm、碎片離子質量數偏差50 ppm 以內[17]。4）將編輯后的代謝組數據矩陣導入軟件，進行多元統計分析處理，相關軟件見表1。

表1 數據分析軟件Table 1 Data analysis software

5）尋找差異性表達代謝物：結合單變量統計分析和多元統計分析的方法，并根據數據特性從多角度分析，最終準確挖掘差異代謝物。基于OPLS?DA 結果，使用R2Y 和Q2 兩個參數用來評價模型的預測能力，獲得的多變量分析OPLS?DA 模型的變量重要性投影（variable importance in projection，VIP），VIP＞1 且p＜0.05 的化合物進行統計學分析。6）通路分析：將這些潛在生物標記物輸入KEGG 數據庫（http：//www.kegg.com/）進行匹配，運用通路富集分析并計算富集因子，尋找顯著性代謝通路。

2 結果與分析

2.1 發酵豆漿產酸及異黃酮變化

發酵豆漿產酸及異黃酮變化見圖1。

圖1 發酵豆漿產酸及異黃酮變化Fig.1 Changes in acid production and isoflavones in fermented soymilk

由圖1a 可知，在產酸方面，未發酵豆漿在12 h內，pH 值與滴定酸度基本不變，pH 值保持在6.5 左右，滴定酸度保持在2.0°T 左右。發酵后pH 值明顯降低，在發酵12 h 時降至4.4；滴定酸度明顯升高，在發酵10 h 時增加至4.6°T，不過在10～12 h 時略有下降，下降至4.3°T。pH 值的降低與滴定酸度的升高，是因為菌株在發酵豆漿時產生大量有機酸，且隨著時間延長，含量逐漸增加。但發酵后期滴定酸度的下降，是因為隨著發酵時間延長，乳酸菌活力降低、產酸速率降低，有機酸被代謝。

由圖1b 可知，在異黃酮含量變化方面，豆漿經植物乳植桿菌c4?3 發酵后SIG（大豆苷、染料木素）的含量明顯下降，大豆苷含量從41.86 mg/L 減少至2.10 mg/L，轉化率為94.98%；染料木苷含量從100.35 mg/L 減少至3.17 mg/L，轉化率為96.84%。SIA（大豆苷元、金雀異黃酮）含量明顯上升，金雀異黃酮從9.68 mg/L 增加至26.61 mg/L；大豆苷元從13.93 mg/L 增加至68.43 mg/L。這是因為植物乳植桿菌c4?3 在發酵時能夠產生β?葡萄糖苷酶，能夠將發酵豆漿中的SIG 水解為SIA。Das等[7]發現鼠李糖乳桿菌也可將發酵豆漿中的SIG 轉化為SIA，其中大豆苷轉化率為55.43%，染料木苷轉化率為72.30%；Feng 等[18]采用植物乳植桿菌處理豆漿，發現處理后的豆漿大豆苷轉化率為64.58%，染料木苷轉化率為74.43%，低于本研究的植物乳植桿菌c4?3。

2.2 豆漿發酵后理化性質變化

豆漿發酵后理化性質變化見表2。

表2 豆漿發酵前后理化性質Table 2 Physical and chemical properties of soymilk before and after fermentation

由表2 可知，豆漿發酵后可溶性蛋白含量顯著下降，影響可溶性蛋白含量的因素包括蛋白質的變性和蛋白的水解。氨基態氮是判斷蛋白水解度的重要指標。氨基態氮含量在發酵前后無顯著差異，說明可溶性蛋白含量的下降不是蛋白水解導致的。

持水力是決定發酵豆漿品質的重要指標，影響發酵豆漿持水力的因素包括發酵豆漿的氨基酸組成、蛋白質構象、類型和數量、發酵產酸量、發酵代謝物等。隨著豆漿發酵，酸大量積累，大豆蛋白變性，發生沉淀，可溶蛋白的含量顯著減少，持水力顯著增加。

豆漿發酵前后總酚含量和抗氧化活性無顯著變化，總黃酮含量減少，這與Asmaa 等[19]的研究結果類似。目前關于發酵前后豆漿抗氧化活性的變化結論有兩種，一些研究發現豆漿發酵后總酚含量、總黃酮含量、抗氧化能力均增加，并認為大豆的抗氧化活性大多與酚類物質呈正相關[20]；而一些研究發現，發酵后黃酮、總酚含量降低，抗氧化能力依舊顯著增加[21]。這是因為大豆中的多酚類抗氧化劑主要有異黃酮、綠原酸異構體、咖啡酸和阿魏酸，這些化合物主要以糖苷的形式出現。而抗氧化能力與抗氧化物質羥基化程度和羥基位置有關[22]，SIA 的抗氧化活性高于SIG。因此，本文雖因微生物生物轉化導致總黃酮減少，但因為SIA含量升高，抗氧化活性并未發生顯著變化。

2.3 代謝組分析

將植物乳植桿菌c4?3發酵豆漿與未發酵豆漿進行PCA 分析和OPLS?DA 分析，結果見圖2。

圖2 發酵豆漿PCA 及OPLS?DA 分析Fig.2 Principal component analysis and orthogonal partial least squares?discriminant analysis of fermented soymilk

R2Y 和Q2Y 越接近于1 時表示模型越穩定可靠，由圖2 可知，所建模型均可靠。

2.4 代謝差異物分析

為進一步討論豆漿發酵前后代謝組的差異，利用clusterProfiler 選用超幾何檢驗的方法對差異代謝物京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）的注釋結果進行富集分析，富集后選取通路中注釋到差異代謝物最多的前20條代謝通路，繪制富集柱形圖。計算20 條通路上的富集因子，繪制差異代謝物KEGG 富集因子氣泡圖，其中富集因子越大，表示差異代謝物在該通路的富集顯著性越可靠。根據富集因子確定5條主要代謝途徑，并繪制差異代謝物KEGG 富集網絡圖，具體結果見圖3～圖4。豆漿發酵前后代謝物變化見表3。

圖3 豆漿發酵前后差異代謝物分析Fig.3 Differential metabolites in soymilk before and after fermentation

圖4 發酵豆漿主要代謝途徑Fig.4 Main metabolic pathway of fermented soymilk

表3 豆漿發酵前后代謝物變化Table 3 Changes of metabolite in soymilk before and after fer?mentation

莽草酸代謝途徑廣泛存在于植物、真菌和微生物中，主要用于合成芳香化合物，為許多代謝途徑提供前體物質，與類黃酮生物合成有關。由表3 可知，豆漿經過發酵，莽草酸含量由2 697.57 mg/L 減少至2 254.68 mg/L。這可能是發酵時微生物產生復雜酶系，使莽草酸轉變為分支酸，之后經預苯酸進一步生成苯丙氨酸和酪氨酸。苯丙氨酸脫氨后可形成肉桂酸，進而轉化為咖啡酸和查爾酮類物質，再通過類黃酮生物合成途徑生成黃酮類物質。

許銀彪等[23]對莽草酸途徑代謝節點進行挖掘，證明其與酪氨酸的合成有關，在發酵時添加5 g/L 莽草酸，可將菌株HGPA 與HGPAK 的酪氨酸合成量從1 200 mg/L，分別提升至1 311 mg/L 和1 490 mg/L。張妍等[24]在用乳酸菌發酵玉米汁時，同樣發現苯丙類化合物和黃酮類化合物發生了變化。咖啡因代謝與嘌呤代謝有關，咖啡因在酶的作用下可轉化為可可堿，豆漿中可可堿含量在發酵后從1 524.58 mg/L 增加至1 732.17 mg/L；可可堿可進一步轉化為甲基嘌呤，豆漿中甲基嘌呤含量在發酵后從2 075.42 mg/L 增加至2 662.90 mg/L；最終甲基嘌呤生成黃嘌呤，進入嘌呤代謝。豆漿發酵后黃嘌呤的前體物質均上升，但黃嘌呤含量反而下降，含量從2 441.26 mg/L 減少至1 547.69 mg/L，這可能是植物乳植桿菌c4?3 在發酵時產生有關嘌呤降解的酶所致（圖4b）。

2.5 發酵豆漿營養物質分析

根據OPLS?DA 得分圖，取VIP＞1 且p＜0.05 的化合物作為差異代謝物，從營養方面考慮，選取與黃酮、氨基酸、嘌呤、維生素有關的差異代謝物進行分析，并與數據庫比對，作為潛在生物標記物，并參考KEGG Pathway map 繪制代謝通路圖，具體結果見圖5。

圖5 植物乳植桿菌c4?3發酵豆漿代謝Fig.5 Metabolism of soymilk fermented with Lactiplantibacillus plantarum c4?3

由圖5a 可知，植物乳植桿菌c4?3發酵豆漿與未發酵豆漿相比，在β?葡萄糖苷酶的影響下，兒茶素的含量從72.69 mg/L 增加至1 389.50 mg/L。此外，通路上一些代謝差異物的含量變化，可能不是β?葡萄糖苷酶作用的結果，如高良姜素的含量從9 224.13 mg/L 增加至18 716.58 mg/L；槲皮素?3?硫酸鹽和二氫山奈酚分別從66.58、465.25 mg/L 增加至561.43、892.81 mg/L。

嘌呤的代謝可以總結為兩個關鍵步驟，首先是次黃嘌呤核苷酸（inosine monophosphate，IMP）的合成，合成的IMP 不會在細胞內堆積，會迅速進行下一步轉換，轉換為腺嘌呤核苷酸（adenosine monophosphate，AMP）和鳥嘌呤核苷酸（guanosine monophosphate，GMP）。AMP 和GMP 進一步反應，變為大豆中含量較高的4 種嘌呤。在人體內，4 種嘌呤會代謝為尿酸，危害人體健康。豆漿發酵后，IMP 合成通路上的中間物質均有升高，但4 種嘌呤總量反而減少了836.08 mg/L，且嘌呤代謝產物尿囊素和尿囊酸的含量增加，分別從77.63 mg/L和876.07 mg/L 變為148.54 mg/L 和1 025.81 mg/L。這或許是因為植物乳植桿菌c4?3 能夠產生尿酸氧化酶，在尿酸氧化酶的作用下尿酸能夠分解成尿囊素，尿囊素進一步水解生成尿囊酸（圖5b）。與尿酸不同，尿囊素和尿囊酸在水中溶解度高，很容易排除出。谷巍等[25]也發現能夠產尿酸氧化酶的乳酸菌，并將其應用于畜牧業。

發酵豆漿有關氨基酸代謝主要涉及18 種氨基酸代謝變化，這些代謝離不開酶的產生，說明植物乳植桿菌c4?3 在發酵豆漿時產生了復雜的酶系。在有關氨基酸代謝的差異通路中，發現γ?氨基丁酸（γ?aminobu?tyric acid，GABA）和高肌肽（homocarnosine）的存在。其中，γ?氨基丁酸從220.88 mg/L 上升至318.14 mg/L，而高肌肽從1 069.94 mg/L 上升至1 568.42 mg/L。γ?氨基丁酸是哺乳動物中樞神經系統中的重要抑制性神經遞質，在自然界中分布廣泛，且微生物是目前γ?氨基丁酸的主要來源。谷氨酸脫羧酶（glutamate decarbox?ylase，GAD）是γ?氨基丁酸合成的關鍵酶，Liu 等[26]發現了幾株高產γ?氨基丁酸的乳酸菌，并研究在不同條件下，谷氨酸脫羧酶對γ?氨基丁酸轉化率的影響。高肌肽是γ?氨基丁酸和組氨酸的二肽，具有抗驚厥作用，還可以抗氧化、抗炎、防止DNA 損傷和抑制晚期糖基化的終產物形成[27]。

除了對上述比較完整的代謝通路進行關注外，還發現磷酸吡哆醇（pyridoxine phosphate）、吡哆醇（pyri?doxal）的含量明顯增加，分別從152.97 mg/L 和無信號峰增加至310.12 mg/L 和127.62 mg/L，這兩種物質都是維生素B6（vitamin B6）的存在形式。維生素B6在醫療健康領域有極大貢獻，如預防骨質疏松、預防心血管疾病等[28]。當蛋白質攝入量較高時，維生素B6的需求量可能會增加，這是因為維生素B6是人體內某些輔酶的組成成分，參與多種代謝反應，尤其與氨基酸代謝有密切關系[29]。例如在γ?氨基丁酸生產中，維生素B6會作為輔酶，發揮重要作用[30]。

3 結論

本文對植物乳植桿菌c4?3發酵豆漿的產酸速率、基礎理化性質、發酵前后異黃酮組分及含量變化、其它營養成分進行分析，發現經豆漿發酵后pH 值明顯下降，在發酵12 h 時降至4.4；滴定酸度明顯升高，在發酵10 h 時達到峰值4.6°T，這主要是由發酵產生的乳酸所致，有助于豆漿的儲存。在植物乳植桿菌c4?3 作用下，發酵豆漿中的SIG 被大量轉化，其中大豆苷轉化率為94.98%，染料木素轉化率為96.84%；SIA 含量明顯增加，金雀異黃酮含量提升了1.75 倍，大豆苷元含量提升了3.91 倍，說明植物乳植桿菌c4?3 產生的β?葡萄糖苷酶能夠有效水解SIG，使其轉化為人體吸收利用率更好的SIA。

通過對植物乳植桿菌c4?3發酵豆漿的非靶向代謝組學分析發現，發酵涉及5 條主要代謝通路，分別為莽草酸途徑、咖啡因代謝、類黃酮生物合成、嘌呤代謝和產熱作用。豆漿發酵后不止異黃酮含量發生變化，γ?氨基丁酸的含量也上調了44.03%，兒茶素、磷酸吡哆醇的含量分別上調了18.12 倍和1.03 倍。且植物乳植桿菌c4?3 在發酵時可能產生了有關嘌呤代謝的酶系，在嘌呤前體物增加的情況下，嘌呤總量反而減少了33.07%，主要是代謝生成了尿囊素和尿囊酸，這將降低因嘌呤攝入過多發生痛風的風險。

上述研究結果表明，植物乳植桿菌c4?3 是發酵豆漿的優良菌株，能夠有效提升豆漿的營養。本研究對發酵豆漿的生產具有重要理論與實踐意義，也為植物乳植桿菌c4?3 的后續開發利用奠定了基礎。