湖南特色刺葡萄果皮中優勢次生代謝物質分析

朱羿博，何雪，李杰，陳彥彤，劉昆玉，楊國順，譚君

（湖南農業大學園藝學院，湖南長沙 410128）

刺葡萄（VitisdavidiiFoex）是葡萄科葡萄屬植物，木質藤本，可做藥用，因徑和葉柄部分帶有皮刺，被稱為‘刺葡萄’，主要分布在中國的湖南、廣西和福建等地，生長于海拔600～1 800 m 的山坡、溝谷林或灌叢中。刺葡萄作為中國特有野生葡萄種質資源之一，果皮厚實、來源廣泛、價格低廉，是非常好的加工原料，廣泛用于刺葡萄酒、刺葡萄籽油和刺葡萄果汁等的制備[1?2]，其加工產品中發現有一定的生物活性功能，包括降血脂、抗氧化和消炎等功效[3]。由于刺葡萄果實和其加工產品中帶有獨特的香氣，近年來對刺葡萄香氣特征進行了大量研究[4]，同時刺葡萄還是耐高溫高濕、抗黑痘病、炭疽病、白腐病的寶貴資源和抗真菌病害的重要砧木育種材料[5]。

葡萄果皮是葡萄的重要組成部分之一，葡萄中的次生代謝物質主要集中在果皮和籽當中[6]。葡萄皮提取物的研究一直都是人們關注的熱點，近年來大量研究表明葡萄提取物具有抗氧化、消炎、減脂和對腸道細菌的積極影響等多種功效[7?10]。葡萄皮提取物在功能食品行業占據著非常重要的市場地位，其功能成分豐富，是功能食品和藥物的重要來源[11]。不同的葡萄品種，其次生代謝產物的種類和含量有較大差異，并受到氣候、地理因素和成熟階段等因素的影響[12?14]。中國野生葡萄的果皮被發現含有豐富的次生代謝產物[15]，且對其次生代謝產物的積累模式也都進行了相關研究[16]，但是對于刺葡萄果皮的次生代謝產物及其積累模式的研究報道很少。刺葡萄皮作為加工過程中的廢料，是葡萄多酚的重要來源[17]，同時刺葡萄皮已經被證實富含花色苷，是一種有巨大潛力的色素資源，可作為提取錦葵素的重要原料[18]。刺葡萄皮中還含有大量的白藜蘆醇，是釀酒葡萄‘赤霞珠’的兩倍[19]，因此刺葡萄皮在食品加工行業中有巨大的開發潛力。

超高效液相色譜質譜聯用（ultra?high performance liquid chromatography?tandem mass spectrometry，UPLC?MS/MS）技術是一種高效快速的檢測方法，與傳統檢測方法相比，有高效、快速、靈敏、高選擇性和高通量等優點，已被廣泛應用于植物差異性、植物代謝物反應、植物營養品質等多方面的研究中，陳秀萍等[20]基于UPLC?MS/MS 方法對枇杷不同組織萜類代謝物進行鑒定，羅利利等[21]通過UPLC?MS/MS 方法比較蒲公英不同部位代謝物的差異并與其抑菌作用作比較。因此通過該方法可以更精準快速地分析葡萄果皮中的次生代謝物質組成。

本研究對刺葡萄果皮中的次生代謝產物進行廣泛靶向代謝組研究，以代表性葡萄品種‘夏黑’和‘陽光玫瑰’為對照，挖掘‘湘刺1 號’、‘湘刺2 號’和‘湘刺4號’3 種湖南特色刺葡萄品種的果皮中優勢次生代謝產物，以期為湖南省刺葡萄種質資源的利用和評價提供科學的數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘湘刺1 號’、‘湘刺2 號’、‘湘刺4 號’、‘夏黑’、‘陽光玫瑰’葡萄：湖南省懷化市中方縣農業局刺葡萄基地。所有葡萄均接受相同的管理，在生理成熟時采摘。刺葡萄的成熟果實的照片如圖1所示。果皮從漿果中剝離后，立即用液氮冷凍，并保存在-80 ℃冰箱中備用。

圖1 刺葡萄成熟果實Fig.1 Mature fruits of spine grape

甲醇、乙腈（均為色譜純）：德國Merck 公司；針筒式微孔濾頭（0.22μm）：泰安泰美生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Nexera X2 超高效液相色譜儀：日本SHIMADZU公司；4500 QTRAP 串聯質譜儀：美國Applied Biosys?tems 公司；Scientz?100F 冷凍干燥機：寧波新芝凍干設備股份有限公司；MM 400 研磨儀：德國Retsch 公司；MS105 型電子分析天平：瑞士Mettler?Toledo 公司。

1.3 方法

1.3.1 試驗流程

葡萄皮樣品放置于凍干機中真空冷凍干燥，利用研磨儀研磨（30 Hz，1.5 min）。稱取100 mg 的粉末溶解于1.2 mL 70% 甲醇提取液中，每30 min 渦旋振蕩一次，每次持續30 s，共渦旋振蕩6 次，樣本置于4 ℃冰箱過夜；12 000 r/min 離心10 min 后，吸取上清液，用0.22 μm 針筒式微孔濾頭過濾樣品，并保存于進樣瓶中，用于UPLC?MS/MS 分析。

1.3.2 色譜質譜條件

色譜柱：Agilent SB?C18（1.8μm，2.1 mm×100 mm）；流動相：A 相為超純水（加入0.1% 的甲酸），B 相為乙腈（加入0.1% 的甲酸）；洗脫梯度：0.00 min B 相比例為5%，9.00 min 內B 相比例線性增加到95%，并維持在95% 1 min，10.00～11.10 min，B 相比例降為5%，并以5%平衡至14 min；流速0.35 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量4μL。

質譜條件：電子轟擊離子源，渦輪噴霧；離子源溫度550 ℃；離子噴霧電壓5 500 V（正離子模式）/-4 500 V（負離子模式）；離子源氣體I、氣體II 和簾氣分別設置為0.34、0.41、0.17 MPa；多反應監測模式（multi?reac?tion monitoring mode，MRM）。

1.4 數據處理

代謝物的定性基于邁維自建數據庫，去除同位素、碎片離子和重復離子信號，根據二級譜信息進行物質定性。采用SPSS 26.0 對數據進行統計分析，采用Ori?gin 2022 進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同品種葡萄果皮中次生代謝產物的化學組成

試驗選擇3 個刺葡萄品種‘湘刺1 號’（XC1H）、‘湘刺2 號’（XC2H）、‘湘刺4 號’（XC4H）和2 個鮮食葡萄品種‘夏黑’（XH）、‘陽光玫瑰’（YGMG）的果皮進行廣泛靶向代謝組研究。基于UPLC?MS/MS 技術，通過圖譜和數據庫比對，在5 個品種的葡萄果皮中共檢測到737 個次生代謝物質，包括類黃酮、酚酸、有機酸、萜類等九大類化合物。不同品種的葡萄果皮中次生代謝產物的韋恩圖與百分占比圖如圖2所示。

圖2 不同品種的葡萄果皮中次生代謝產物的韋恩圖與百分占比圖Fig.2 Venn diagramand composition of secondary metabolites in peels of different grape varieties

由圖2 可知，‘湘刺1 號’檢測出711 個物質，‘湘刺2 號’檢出666 個物質，‘湘刺4 號’檢出710 個物質，‘夏黑’葡萄檢出692 個物質，‘陽光玫瑰’葡萄檢出622 個物質。不同品種的共有化合物為564 個（圖2a）。在這些次生代謝產物中，類黃酮物質大約占18.4%，酚酸類物質約占15.8%，有機酸和萜類各占9.7% 和2.9%。由此可以看出，5 種不同品種的葡萄果皮中，次生代謝產物的組成無明顯差異，不同類別的次生代謝產物的物質組成比例相似。

2.2 不同品種葡萄果皮中的主要差異次生代謝產物

對不同品種葡萄果皮中的次生代謝產物進行主成分分析（principal component analysis，PCA），結果如圖3所示。

圖3 不同葡萄果皮中次生代謝產物的PCA 得分Fig.3 PCA score plot of secondary metabolites in peels of differ?ent grape varieties

由圖3 可知，在主成分1 和2 中分別解釋了37.3%和19.4%的物質差異，3 個質控樣本均在中心點位置且高度重合，說明本次檢測的數據可靠。所有樣本在PCA 圖中被分成了4 個區域，刺葡萄樣品均位于PC1軸中的正半軸，而‘夏黑’和‘陽光玫瑰’樣品位于負半軸，說明刺葡萄與兩個鮮食葡萄品種（‘夏黑’和‘陽光玫瑰’）的果皮中次生代謝產物存在明顯差異，而‘湘刺1 號’和‘湘刺2 號’的果皮中次生代謝產物比較接近。

通過比對代謝組學數據庫的物質信息發現刺葡萄果皮樣本中共檢出136 個類黃酮物質、37 個萜類或鞣質、109 個酚酸、72 個有機酸、47 個生物堿、15 個木質素或香豆素，主要的特色次生代謝產物為類黃酮和酚酸。對所有檢出物質的信號進行分層聚類分析，結果如圖4所示。

圖4 不同品種葡萄果皮樣本中的167 個差異物質、類黃酮物質和酚酸類物質的聚類熱圖Fig.4 Heatmap of 167 differential metabolites，flavonoids，and phenolic acids in the peel samples of different grape varieties

由圖4 可知，不同葡萄品種的樣本中差異明顯的有167 個化合物，紅葡萄（‘湘刺1 號’、‘湘刺4 號’和‘夏黑’）的果皮中類黃酮物質含量多于白葡萄（‘湘刺2 號’和‘陽光玫瑰’）；在‘湘刺4 號’果皮中，類黃酮物質較其他品種更為豐富（圖4b）；而‘湘刺2 號’和‘湘刺1 號’的果皮中，酚酸類物質含量較高（圖4c）。

2.3 不同品種刺葡萄果皮中的特色次生代謝產物分析

對不同品種葡萄果皮的次生代謝產物進行深入分析，挖掘刺葡萄的特色次生代謝產物分子，結果如圖5所示。

圖5 不同品種葡萄的果皮中差異類黃酮化合物、萜類或鞣質類物質和花色苷類物質相對含量百分比Fig.5 Relative content of differential flavonoids，terpenoids or tannins，and anthocyanins in the peels of different grape varieties

由圖5 可知，‘湘刺2 號’和‘湘刺4 號’的果皮含有較多的原花青素B2、原花青素C1 和原花青素B4；‘湘刺1 號’和‘湘刺4 號’的果皮中富含芍藥花素?3?O?蕓香糖苷、錦葵色素?3?O?（6′′?O?乙酰）葡萄糖苷?5?O?葡萄糖苷、矢車菊素?3?O?（2′′?O?葡萄糖基）葡萄糖苷和飛燕草素?3，5?O?二?O?葡萄糖苷；‘湘刺4 號’的黃酮類物質較為突出；‘湘刺1 號’則含有較多的檸檬素?3?O?葡萄糖苷、扁蓄苷（廣寄生苷）和槲皮素?3?O?阿拉伯糖苷（番石榴苷）、槲皮素?3?O?桑布雙糖苷、丁香亭?3?O?（6′′?乙酰）葡萄糖苷、芍藥花素?3?O?蕓香糖苷和錦葵色素?3?O?（6′′?O?乙酰）葡萄糖苷?5?O?葡萄糖苷。

此外，刺葡萄果皮中含有31 個特有的次生代謝產物，其LC?MS 定性結果如表1所示。

表1 刺葡萄果皮中特有次生代謝產物的LC?MS 定性結果Table 1 LC?MS results for unique secondary metabolites in Vitis davidii peels

由表1 可知，刺葡萄果皮特有次生代謝產物中包括10 個類黃酮物質、4 個萜類或鞣質類物質，其中對香豆酰阿魏酰酒石酸和紫丁香苷僅在‘湘刺1 號’中檢測出。

3 討論與結論

本試驗利用UPLC?MS/MS 廣泛靶向代謝組學技術，對不同品種葡萄果皮中的次生代謝產物進行組學分析，篩選出湖南省3 個刺葡萄品種果皮中的特色次生代謝產物。結果表明，不同刺葡萄品種中，‘湘刺4號’果皮中的類黃酮物質最豐富，在功能食品上具有較高的利用價值和開發潛力；‘湘刺2 號’含有豐富的原花青素；對香豆酰阿魏酰酒石酸和紫丁香苷僅在‘湘刺1 號’中檢出，可作為其特征物質。但由于本次的葡萄品種數量較少，后續研究中還需進一步收集更多的葡萄品種，并進行多角度的數據驗證。

國內外相關研究表明，葡萄中的優勢次生代謝產物為類黃酮和原花青素[22]。類黃酮有較強的功能特性[23?25]，對葡萄和葡萄酒的品質具有決定性作用，并保護葡萄免受外界傷害[26]；原花青素以B 型結構為主，主要集中在葡萄的果皮和種子中[27]。低聚合度的原花青苷具有較強的抗氧化活性[8]，在食品和制藥工業有非常大的發展潛力且對于刺葡萄酒的特色風味有著重要貢獻[28?30]。本試驗結果與上述文獻報道結果相吻合，刺葡萄中所含有的豐富的類黃酮和原花青素類物質具有較多的生理活性功能，可為本省刺葡萄深加工產業的高附加值產品開發提供理論依據。