南酸棗多糖的體外抗氧化、降血糖與降血脂作用

李景恩，董金嬌，謝美珍，隋文，吳南生

（1.江西農業大學食品科學與工程學院，江西南昌 330045；2.江西農業大學南酸棗研究所，江西南昌 330045）

代謝綜合征是指肥胖、高血壓、高血糖、血脂異常等多種心血管疾病的危險因素在同一個體同時存在的臨床癥候群[1]。高脂肪、高膽固醇等不良飲食的大量攝入以及久坐不動的生活工作方式，使其發病率呈現不斷上升趨勢。代謝綜合征的發病機制十分復雜，主要以胰島素抵抗和肥胖為核心，可發展為糖尿病、脂肪肝、心血管疾病等，目前應對策略是早發現和早預防，尚無有效治療方法[2]。為了避免長期服用合成類藥物對機體產生的體質量增加、低血糖、肝腎損傷等多種不良副作用，越來越多的研究轉向低毒高效的天然產物[3]。

多糖是一類存在于動植物和微生物中的天然大分子活性物質，具有廣泛的抗氧化、降血糖、降血脂、抗衰老、抗腫瘤、抗病毒、增強免疫力等生物學作用。研究表明多糖可以通過促進葡萄糖消耗、增加肝糖原、保護胰島細胞、緩解體內氧化應激、增加糖代謝途徑及阻止血糖來源等途徑發揮降糖活性[4?6]。此外，多糖在血脂調節和心血管疾病的預防及治療方面也表現出優異的作用。研究表明，多糖可以通過抑制三酰基甘油和總膽固醇合成通路、提高膽汁酸合成途徑活性、調控脂代謝相關因子表達、減輕氧化應激反應、改善胰島素抵抗作用、調節腸道菌群等途徑達到降低血脂的效果[7]。

南酸棗[Choerospondiasaxillaris（Roxb）Burttet Hill]又名五眼果、醋酸果、鼻涕果等，主要分布在我國江西、云南、廣西、湖南、貴州、四川等地，在印度、日本、中南半島等國家與地區也有分布[8]。南酸棗鮮果口味酸澀，果肉富含氨基酸、膳食纖維、礦物質等營養元素以及多糖、黃酮、多酚等活性物質[9?10]。南酸棗的干燥成熟果實（廣棗）具有行氣活血、養心安神、消積解毒等功效；鮮食則具有健脾胃、助消化、防暑解毒和醒酒作用[11?14]。前期研究中我們以南酸棗果肉為原料，通過乙醇分級沉淀法于體積分數40% 處制備得到一個分子量分布較為均一的酸性多糖組分（Choerospondiasax?illarispolysaccahrdies，CAP?40）[15]。由于糖尿病、肥胖等疾病的發生發展都與氧自由基的過量產生密切相關[16?17]，控制氧自由基顯得尤為重要，然而目前有關南酸棗多糖在降糖、降脂方面的相關研究還較為缺乏。為了評價南酸棗多糖的體外抗氧化、降血糖、降血脂活性，本研究分別測定CAP?40 對DPPH·和ABTS+·兩種自由基的清除能力、對α?淀粉酶、α?葡萄糖苷酶、胰脂肪酶的抑制作用，以及對甘氨膽酸鈉和牛磺膽酸鈉兩種膽酸鹽的結合能力，為南酸棗多糖的體內研究及功能開發提供新思路和理論依據，也為南酸棗資源的綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮南酸棗：江西贛州；葡聚糖系列標準品（5 000、11 600、23 800、48 600、80 900、148 000、273 000、409 800、667 800 Da）、豬胰脂肪酶（≥125 U/mg）：美國Sigma?Al?drich 公司；巖藻糖（fucose，Fuc）、鼠李糖（rhamnose，Rha）、阿拉伯糖（arabinose，Ara）、半乳糖（galactose，Gal）、葡萄糖（glucose，Glc）、木糖（xylose，Xyl）、甘露糖（man?nose，Man）、果糖（frucose，Fru）、核糖（ribose，Rib）、半乳糖醛酸（galacturonic acid，GalA）、葡萄糖醛酸（gluc?uronic acid，GlcA）、氨基半乳糖鹽酸鹽（galactose amino hydrochloride，GalN）、鹽酸氨基葡萄糖（glucosamine hy?drochloride，GlcN）、N?乙酰?D?氨基葡萄糖（N?acetyl?D?glucosamine，GlcNAc）、古羅糖醛酸（guronuronic acid，GulA）、甘露糖醛酸（mannuronic acid，ManA）：博睿糖生物技術有限公司；1，1?二苯?2?苦基肼（2，2?diphenyl?1?picrylhydrazyl，DPPH）、2，2′?聯氨?雙（3?乙基苯并噻唑啉?6?磺酸）二銨鹽[2，2′?azinobis（?3?ethylbenzothiazoline?6?sulfonic acid），ABTS]、對硝基苯基?α?D?吡喃葡糖糖苷（p?nitro?phenyl?α?D?glucopynoside，PNPG）、可溶性淀粉、α?葡萄糖苷酶（50 U/mg）、α?淀粉酶（50 U/mg）、胃蛋白酶（豬胃黏膜，3 000 U/g）、胰蛋白酶（牛胰，250 U/g）：上海源葉生物科技有限公司；三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甘氨膽酸鈉、牛磺膽酸鈉、月桂酸?4?硝基苯酯、乙酸鈉、Tri?tion X?100：上海麥克林生化科技有限公司；無水乙醇、氯化鈉、氫氧化鈉、過硫酸鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、碳酸鈉、酒石酸鉀鈉、3，5?二硝基水楊酸、苯酚（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

LC?10A 型高效液相色譜儀、RI?10A 型示差檢測器、AUY 220 型電子分析天平：日本Shimadzu 公司；ICS5000 型離子色譜儀：美國Thermo Fisher 公司；Spectra Max M2 多功能酶標儀：美國Molecular Devices公司；TDL?5?A 型臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；SCIENNTZ?10N 型冷凍干燥機：寧波新芝生物科技股份有限公司；HH?2S 型數顯恒溫水浴鍋：上海恩誼醫療科技發展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 南酸棗多糖CAP?40 的制備

新鮮南酸棗洗凈去皮去核，果肉干燥粉碎。根據前期研究結果[15，18]，在最佳提取工藝下提取南酸棗多糖，即料液比1∶40（g/mL），提取溫度100 ℃，提取時間5 h。提取液過濾、濃縮，采用不同體積無水乙醇對濃縮液進行分步沉淀，將乙醇濃度為體積分數40%處的沉淀組分命名為CAP?40，離心（4 800 r/min，10 min）、干燥后備用。

1.3.2 CAP?40 的分子量與單糖組成測定

通過高效凝膠滲透色譜測定CAP?40 的相對分子量及純度。精密稱取CAP?40 和不同分子量的系列葡聚糖標準品，分別配制成5 mg/mL 的溶液，12 000 r/min離心10 min，上清液經0.22μm 微孔濾膜過濾后待測。液相系統測定條件：采用BRT105?104?102 串聯凝膠柱（8 mm×300 mm），柱溫40 ℃，流動相0.05 mol/L NaCl，流速0.6 mL/min，進樣量20μL，示差檢測器監測60 min。

采用高效離子色譜法測定單糖組成。精密稱量10 mg 多糖樣品，加入10 mL 3 mol/L TFA，于120 ℃水解3 h 后用氮吹儀吹干；加入10 mL 超純水渦旋混勻，從中吸取100 μL 加入900 μL 超純水，12 000 r/min離心5 min，上清液經0.22 μm 微孔濾膜過濾后待測。測定條件：離子色譜柱CarboPacTMPA20（3 mm×150 mm），柱溫30 ℃，流動相（A：H2O；B：15 mmol/L NaOH；C：15 mmol/L NaOH 及100 mmol/L NaOAc），流速0.3 mL/min，進樣量5μL，電化學檢測器監測60 min。根據絕對定量法，測定樣品中各單糖質量，然后根據分子量換算為摩爾比。

1.3.3 CAP?40 體外抗氧化作用

1.3.3.1 DPPH·清除率測定

取不同濃度的CAP?40 多糖溶液（0.2～1.0 mg/mL）各2.0 mL 于試管中，分別加入2.0 mL 80 μg/mL 新鮮配制的DPPH?無水乙醇溶液，避光反應30 min 后于517 nm 測定吸光度[19]。按照公式（1）計算DPPH·清除率（D，%）。

式中：A1為樣品組吸光度；A2為蒸餾水代替DPPH?無水乙酵溶液的背景吸收；A0為蒸餾水代替多糖溶液的空白對照組吸光度。

1.3.3.2 ABTS+·清除率測定

將7 mmoL/L ABTS 溶液與2.45 mmoL/L 過硫酸鉀溶液等比例混合，避光反應24 h。采用磷酸鹽緩沖液[phosphate buffered saline，PBS，（pH7.4，0.1 mol/L）]進行稀釋，直至溶液在734 nm 處吸光度為0.7 左右，得到ABTS 工作液。取不同濃度的多糖溶液（0.2～1.0 mg/mL）各0.8 mL，迅速加入6 mL ABTS 工作液，避光反應6 min后于734 nm 處測吸光度[19]。按照公式（2）計算ABTS+·的清除率（A，%）。

式中：A1為樣品組吸光度；A2為蒸餾水代替ABTS 工作液時的背景吸收；A0為以蒸餾水代替多糖溶液的空白對照組吸光度。

1.3.4 CAP?40 體外降血糖活性

1.3.4.1 CAP?40 對α?葡萄糖苷酶的抑制率測定

使用PBS 緩沖液（0.1 moL/L，pH 6.9）制備不同濃度（1.0、5.0、8.0、12.0、16.0 mg/mL）的CAP?40 多糖、α?葡萄糖苷酶（0.35 U/mL）及PNPG（1.5 mmol/L）溶液。取50 μL 多糖溶液與100 μL α?葡萄糖苷酶溶液混勻后于37 ℃下孵育10 min，分別加入100μL PNPG 后繼續孵育20 min。最后加入1 mL Na2CO3溶液（1 mol/L）終止反應，在400 nm 處測吸光度[19]。根據公式（3）計算α?葡萄糖苷酶的抑制率（G，%）。

式中：As為樣品組吸光度；Ab為PBS 緩沖液代替α?葡萄糖苷酶溶液的背景吸收；A0為PBS 緩沖液代替樣品的空白對照組吸光度。

1.3.4.2 CAP?40 對α?淀粉酶的抑制率測定

根據文獻[19]方法稍作修改，稱取酒石酸鉀鈉18.2 g，溶于50 mL 蒸餾水，加熱，于熱溶液中依次加入3，5?二硝基水楊酸0.63 g、氫氧化鈉2.1 g、苯酚0.5 g，攪拌至溶，冷卻后用蒸餾水定容至100 mL，配制成3，5?二硝基水楊酸（3，5?dinitrosalicylic acid，DNS）試劑。以0.1 mol/L PBS 緩沖液（pH6.9）制備不同濃度的多糖（0.1、0.5、1.0、3.0、5.0 mg/mL）及質量分數1%可溶性淀粉；6.7 mmol/L NaCl 溶液制備1 U/mL α?淀粉酶。取50μL 多糖溶液與50μL α?淀粉酶混勻后于37 ℃孵育10 min，然后再加入50μL 可溶性淀粉繼續孵育10 min。加入100μL DNS 試劑終止反應，并將試管在沸水中煮沸5 min 滅活淀粉酶。冷卻至室溫后，加入1 mL 蒸餾水稀釋，于520 nm 處測定吸光度。根據公式（4）計算α?淀粉酶的抑制率（M，%）。

式中：As為樣品組吸光度；Ab為PBS 緩沖液代替α?淀粉酶溶液的背景吸收；A0為PBS 緩沖液代替樣品的空白對照組吸光度。

1.3.5 CAP?40 體外降血脂活性

1.3.5.1 CAP?40 對脂肪酶的抑制率測定

根據文獻[20]方法稍作修改，0.8 mg/mL 的月桂酸?4?硝基苯酯溶液由5 mmol/L 的乙酸鈉溶液（含1% Tri?tion X?100）配制，作為底物溶液。準確吸取50μL 不同濃度（1、5、10、15、20 mg/mL）的南酸棗多糖樣品溶液于試管中，分別加入150μL 豬胰脂肪酶溶液（1 250 U/mL）與350 μL PBS 緩沖液（0.1 mol/L，pH7.4），37 ℃預熱10 min，隨后加入450 μL 底物溶液，充分混勻后置于37 ℃水浴反應2 h。多糖與胰脂肪酶均以PBS 緩沖液配制。隨后12 000 r/min 離心10 min，取上清液于405 nm測吸光度。根據公式（5）計算胰脂肪酶抑制率（P，%）。

式中：Aa為空白組吸光度，以PBS 緩沖液代替多糖溶液；Ab為空白對照組吸光度，以PBS 緩沖液代替多糖和胰脂肪酶液；Ac為樣品組吸光度；Ad為對照組吸光度，以PBS 緩沖液代替胰脂肪酶液。

1.3.5.2 CAP?40 對膽酸鹽結合能力測定

根據文獻[21]方法稍作修改，分別取1 mL 不同摩爾濃度的甘氨膽酸鈉（0.03、0.06、0.12、0.18、0.24、0.30 mmol/L）或牛磺膽酸鈉（0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mmol/L）標準溶液置于具塞試管中，加入3 mL 60% 濃H2SO4溶液，于70 ℃水浴20 min，冰浴5 min 后于387 nm 波長處測定吸光度。以膽酸鹽含量為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制膽酸鹽含量標準曲線。

以PBS 緩沖液（0.1 mol/L，pH6.3）分別配制10 mg/mL胃蛋白酶和胰蛋白酶。取1.5 mL CAP?40 溶液于具塞錐形瓶中，加入1.5 mL 胃蛋白酶及0.5 mL 0.01 mol/L HCl，在37 ℃下恒溫振蕩消化1 h，模擬胃消化過程。隨后用0.1 mol/L NaOH 溶液調節溶液pH 值至6.3，后加入2 mL 胰蛋白酶，在37 ℃條件下恒溫振蕩消化1 h，模擬腸道環境進行消化。上述消化后的樣品分別加入2 mL 0.4 mmol/L 甘氨膽酸鈉或0.5 mmol/L 牛磺膽酸鈉，37 ℃恒溫振蕩1 h 后轉移至離心管，4 000 r/min 離心20 min，取1 mL 上清液，按照標準曲線方法分別測定甘氨膽酸鈉和牛磺膽酸鈉含量，每個樣品平行測定3 次。按照公式（6）分別計算甘氨膽酸鈉、牛磺膽酸鈉結合率（C，%），計算公式如下。

式中：m1為結合前膽酸鹽質量，mg；m2為結合后膽酸鹽質量，mg。

1.4 數據處理

所有試驗重復測定3 次，數據表示為平均值±標準差，利用Excel 繪制圖形，使用SPSS 25.0 軟件進行統計學分析及IC50的計算。

2 結果與分析

2.1 CAP?40 的分子量與單糖組成分析

2.1.1 CAP?40 的分子量

通過高效凝膠滲透色譜對CAP?40 分子量進行測定，結果如圖1所示。

圖1 CAP?40 的高效液相凝膠色譜圖Fig.1 High performance gel permeation chromatography of CAP?40

由圖1 可知，CAP?40 為單一對稱的洗脫峰，證明CAP?40 為均一的純化多糖。分別以葡聚糖標準品相對分子量的對數值（logarithm value of relative molecular weight，lgM）與保留時間（retention time，RT）為變量繪制校正曲線，得到lgMw?RT 校正曲線方程y=-0.200 1x+12.602，R2=0.994 7；lgMn?RT 校正曲線方程y=-0.185 6x+11.858，R2=0.994 1。CAP?40 的保留時間為37.023 min，根據標準曲線計算CAP?40 的重均分子量Mw為156 206 Da，數均分子量Mn為96 946 Da，分散系數（Mw/Mn）為1.611，表明CAP?40 分子量分布范圍較均勻。

2.1.2 CAP?40 單糖組成分析

單糖混標和南酸棗多糖CAP?40 的離子色譜圖如圖2所示。

圖2 單糖混合標準品及CAP?40 的離子色譜圖Fig.2 Ion chromatographic analysis of monosaccharides mixed standards and CAP?40

CAP?40 的單糖組成結果如表1所示。

表1 CAP?40 單糖組成分析Table 1 Monosaccharide composition analysis of CAP?40

由表1 可知，CAP?40 是一種由8 種單糖組成的酸性多糖，其中葡萄糖、半乳糖醛酸、半乳糖及阿拉伯糖含量較高，摩爾百分比分別為40.8%、40.7%、9.3%、5.1%，此外還含有少量的鼠李糖、甘露糖、木糖及氨基葡萄糖。

2.2 CAP?40 對DPPH·和ABTS+·的清除作用

CAP?40 對DPPH·和ABTS+·的清除率如圖3所示。

圖3 CAP?40 對DPPH·和ABTS+·的清除率Fig.3 The scavenging rate of CAP?40 on DPPH·and ABTS+·

由圖3a 可知，當多糖濃度由0.2 mg/mL 增加到0.6 mg/mL 時，CAP?40 對DPPH·清除率迅速上升；從0.8 mg/mL 增加到1.0 mg/mL 時，清除速度趨于平緩；1.0 mg/mL 時，CAP?40 對DPPH·的清除能力達到（88.85±1.91）%，但仍低于同濃度下的抗壞血酸的清除率（93.81±0.28）%，其半抑制率IC50為0.362 mg/mL。由圖3b 可知，多糖濃度為0.2～1.0 mg/mL 時，CAP?40 對ABTS+·的清除能力隨多糖濃度的增加而增強，并呈現出量效關系。在1.0 mg/mL 時，清除率達到（87.13±1.63）%，低于陽性對照（100.11±0.34）%，CAP?40 對ABTS+·的IC50為0.458 mg/mL。

2.3 CAP?40 對α?葡萄糖苷酶和α?淀粉酶的抑制作用

CAP?40 對α?葡萄糖苷酶和α?淀粉酶的抑制率如圖4所示。

圖4 CAP?40 對α?葡萄糖苷酶和α?淀粉酶的抑制率Fig.4 Inhibitory rate of CAP?40 on α?glucosidase and α?amylase

由圖4a 可知，在濃度為1～16 mg/mL 時，CAP?40對α?葡萄糖苷酶活性的抑制率隨濃度增加而增加，計算其IC50值為8.351 mg/mL。當大于12 mg/mL 時，CAP?40 對α?葡萄糖苷酶活性的抑制作用趨于平緩，說明抑制作用可能接近飽和狀態，與朱振元等[22]的研究結果一致。在16 mg/mL 時，抑制率為（71.28±2.34）%，高于劉力萍等[23]研究的灰樹花胞外粗多糖在50 mg/mL時對α?葡萄糖苷酶的抑制率（58.33%）。

由圖4b 可知，CAP?40 多糖對α?淀粉酶活性產生了顯著的抑制作用。當濃度由0.05 mg/mL 增至8 mg/mL時，CAP?40 對α?淀粉酶的抑制率從（33.96±0.36）%升高到（72.29±4.85）%，呈現濃度依賴性。當濃度為1 mg/mL 時，CAP?40 對α?淀粉酶的抑制率為（43.61±0.24）%，高于王鑫等[24]研究的甜玉米芯多糖在濃度為2 mg/mL 時的抑制率[（26.67±1.67）%]；而在濃度為8 mg/mL 時，其抑制率為（72.64±3.53）%，接近甜玉米芯多糖在10 mg/mL 時的抑制率[（75.44±1.94）%]，計算CAP?40 的IC50值約為3.321 mg/mL。

2.4 CAP?40 體外降血脂作用

2.4.1 CAP?40 對胰脂肪酶的抑制作用

胰脂肪酶可以將脂肪水解為游離脂肪酸和單酰甘油酯，因此可以通過抑制胰脂肪酶活性，減少機體對脂肪的吸收從而達到降脂目的。CAP?40 對胰脂肪酶的抑制率如圖5所示。

圖5 CAP?40 對胰脂肪酶的抑制率Fig.5 Inhibition rate of CAP?40 on pancreatic lipase

由圖5 可知，在試驗濃度范圍內CAP?40 對胰脂肪酶均具有抑制作用，且呈現一定的劑量依賴關系。當CAP?40 濃度低于10 mg/mL 時，對胰脂肪酶的抑制率呈顯著上升趨勢（P＜0.05）；而當CAP?40 濃度高于10 mg/mL 時，抑制率的上升趨勢變得平緩。當CAP?40濃度為20 mg/mL 時，對胰脂肪酶的抑制率為（26.34±1.41）%。

2.4.2 CAP?40 對膽酸鹽結合能力

甘氨膽酸鈉與牛磺膽酸鈉的標準曲線如圖6所示。

圖6 甘氨膽酸鈉與牛磺膽酸鈉的標準曲線Fig.6 Standard curve of sodium glycocholate and sodium taurocholate

肝臟中的膽汁酸常以膽汁酸鈉鹽或鉀鹽的形式存在，其中甘氨酸膽酸鈉或牛磺膽酸鈉是兩種主要的結合型膽酸鹽，因此可以通過測定樣品對膽酸鹽的體外結合能力來預測其降血脂能力[21]。由圖6 可知，甘氨膽酸鹽標準曲線回歸方程為y=1.765 4x+0.072 7，R2=0.998 6；牛磺膽酸鹽標準曲線回歸方程為y=1.821 2x+0.056，R2=0.999 3，線性關系均良好。

CAP?40 對甘氨膽酸鈉和牛磺膽酸鈉的結合率如圖7所示。

圖7 CAP?40 與甘氨膽酸鈉和牛磺膽酸鈉的結合率Fig.7 The binding rate of CAP?40 with sodium glycholate and so?dium taurocholate

由圖7 可知，相同濃度下CAP?40 對牛磺膽酸鈉的結合率高于甘氨膽酸鈉，并且與二者的結合量均隨多糖濃度的增加而增加。當CAP?40 的濃度為5 mg/mL 時，經過體外模擬胃腸消化后CAP?40 與甘氨膽酸鹽、牛磺膽酸鹽的結合率分別達到（31.87±4.53）%和（38.98±0.60）%。

3 結論

以南酸棗多糖均一組分CAP?40 為試驗對象，測定其Mw為156 206 Da，Mn為96 946 Da，單糖組成表明CAP?40 是一種由8 種單糖組成的酸性多糖，其中葡萄糖、半乳糖醛酸、半乳糖及阿拉伯糖含量較高，摩爾比為0.408∶0.407∶0.093∶0.051，還含有少量的鼠李糖、甘露糖、木糖及鹽酸氨基葡萄糖。此外，CAP?40 對DPPH·和ABTS+·均具有一定的抑制作用，在1.0 mg/mL 時，對DPPH·和ABTS+·的清除能力分別達到（88.85±0.49）%、（87.13±1.63）%，IC50值分別為0.362、0.458mg/mL。在16、8 mg/mL 時，CAP?40 對α?葡萄糖苷酶和α?淀粉酶的抑制率分別為（71.28±2.34）%、（72.29±4.85）%，IC50值分別為8.153、3.321 mg/mL，說明CAP?40 對碳水化合物的水解具有一定的抑制作用。在20 mg/mL 時，CAP?40對胰脂肪酶的抑制率約為（26.34±1.41）%，對甘胺膽酸鈉和牛磺膽酸鈉也表現出一定的結合能力，表明南酸棗多糖能夠在一定程度上抑制胰脂肪酶活性，以及通過吸附膽酸鹽減少體內膽固醇含量，從而達到降脂效果。綜上，南酸棗多糖CAP?40 具有一定的體外抗氧化、降血糖和降血脂作用，但能否作為天然功能因子在緩解或預防代謝綜合征方面發揮一定的潛能，還需進一步探究其體內作用效果和機理。