基于多元統(tǒng)計(jì)分析的“紫脈龍韻”苦茶主要滋味品質(zhì)評(píng)價(jià)

吳玲玲，黃靜，巫虹穎，梁賢智，翁小婷，駱妍妃，農(nóng)玉琴，王明釋，陳遠(yuǎn)權(quán)

（廣西南亞熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，廣西崇左 532415）

苦茶（Camelliasinensisvar.kucha）是我國(guó)特有的一類茶樹資源，含有特殊的嘌呤生物堿—苦茶堿，其具有獨(dú)特的品質(zhì)風(fēng)味和保健功效[1]，近年來，逐漸成為茶葉領(lǐng)域的重點(diǎn)研究對(duì)象。關(guān)于苦茶資源的鑒定[2]、代謝組學(xué)[3?4]、轉(zhuǎn)錄組學(xué)[5?6]、保健功效評(píng)價(jià)[1]、遺傳多樣性分析[7]、苦茶堿合成途徑[8]等相關(guān)研究日益增多。目前，研究較多的是廣東、云南、湖南、四川、福建等地區(qū)的苦茶[9]，廣西苦茶資源相對(duì)稀缺，相關(guān)研究鮮有報(bào)道。“紫脈龍韻”是課題組前期篩選出的苦茶品種，該品種產(chǎn)量較高、持嫩性較強(qiáng)、新梢花青甙略顯紫色，抗性與生長(zhǎng)勢(shì)綜合表現(xiàn)優(yōu)良，其滋味品質(zhì)成分有待研究。

苦茶芽葉滋味極苦，經(jīng)過一定的加工處理后，制成的茶葉仍具有一定的苦味。研究表明，茶湯的苦味主要是茶多酚、生物堿、兒茶素、花青素等多種物質(zhì)共同作用的結(jié)果[10]。茶樹鮮葉是制備茶葉的原料，嫩度不同的鮮葉，其物質(zhì)基礎(chǔ)不同[11]，加工而成的茶葉品質(zhì)也不同。茶葉品質(zhì)的好壞及其適制性與鮮葉滋味物質(zhì)密切相關(guān)[12?13]。對(duì)不同嫩度鮮葉進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)與分類，以便制定相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)化工藝加工出不同等級(jí)的茶葉。常規(guī)茶樹品種嘌呤生物堿以咖啡堿為主，然而，隨著健康生活理念的普及，人們對(duì)低咖啡堿功能性茶葉產(chǎn)品的需求逐漸增加。苦茶中存在與傳統(tǒng)茶葉不同的嘌呤生物堿模式，苦茶堿含量相對(duì)較高。盡管苦茶堿與咖啡堿在結(jié)構(gòu)上相似，但其不具有咖啡堿的刺激性，具有鎮(zhèn)靜催眠、抗抑郁、消炎及鎮(zhèn)痛等生理活性[14]。因此，開發(fā)富含苦茶堿的適制茶類及功能成分產(chǎn)品不僅能滿足一些特殊人群對(duì)茶葉的需求，還能提高苦茶資源的利用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益。地區(qū)及茶樹組織部位的不同，嘌呤生物堿的含量及分布亦不同。福建云霄苦茶和安溪苦茶春梢隨葉位增加，其苦茶堿含量隨之增加，而大田苦茶不同葉位苦茶堿含量的變化趨勢(shì)表現(xiàn)為先增大后減小[11]。禿房茶中苦茶堿含量隨芽葉成熟度的增加而升高[15]，廣東苦茶中苦茶堿隨葉片成熟度的增加而緩慢降低[16]。

基于此，本研究以“紫脈龍韻”苦茶為研究對(duì)象，對(duì)不同嫩度鮮葉及不同部位進(jìn)行主要滋味品質(zhì)成分的測(cè)定，并運(yùn)用單因素方差、聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）、相關(guān)性分析及主成分分析（principal component analysis，PCA）等多元統(tǒng)計(jì)分析方法明確“紫脈龍韻”苦茶鮮葉嫩度差異的關(guān)鍵化合物、不同嫩度鮮葉的分類及不同部位嘌呤生物堿分布規(guī)律，以期為紫脈龍韻苦茶鮮葉的分級(jí)采摘、分級(jí)加工及功能成分提取原料的選擇提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦茶：廣西南亞熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所茶樹資源圃選育的品種“紫脈龍韻”，采摘其鮮葉（2022年3月30日）、花與果實(shí)（2022年10月20日）。

兒茶素（catechin，C）、表兒茶素（epicatechin，EC）、表沒食子兒茶素（epigallocatechin，EGC）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、表兒茶素沒食子酸酯（epicatechin gallate，ECG）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（gallocatechin gallate，GCG）、沒食子兒茶素（gallocatechin，GC）、兒茶素沒食子酸酯（catechin gallate，CG）：北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；咖啡堿（caffeine，CAF）、可可堿（theobromine，TB）、茶堿（the?ophylline，TP）、1，3，7?三甲基尿酸（1，3，7?trimethyluric acid，TMUA）：成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司；苦茶堿（theacrine，TCR）：上海麥克林生化科技有限公司；總黃酮試劑盒、可溶性糖試劑盒、花青素試劑盒、蛋白質(zhì)試劑盒：蘇州格銳思生物科技有限公司；乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）、冰醋酸（分析純）：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

6CTH 型烘干機(jī)：浙江上洋機(jī)械有限公司；XM?P30H 超聲波清洗機(jī)：小美超聲儀器（昆山）有限公司；DW?86L388J 超低溫冰箱：青島海爾特種電器有限公司；ME203E 萬分之一電子精密天平：梅特勒?托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司；UltiMate 3000 高效液相色譜儀：賽默飛世爾科技有限公司；BlueStar B 紫外可見分光光度計(jì)：萊伯泰科有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的制備

將不同嫩度鮮葉與不同部位（芽葉、莖、花、果皮）分別置于120 ℃烘箱烘20 min 后，再在70 ℃烘箱烘至足干，干樣放入粉碎機(jī)粉碎，過60 目篩，置于-20 ℃冰箱儲(chǔ)存，用于主要滋味品質(zhì)成分的測(cè)定。

1.3.2 常規(guī)生化成分的測(cè)定

茶多酚及游離氨基酸含量的測(cè)定分別按照GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測(cè)方法》、GB/T 8314—2013《茶游離氨基酸總量的測(cè)定》的方法進(jìn)行測(cè)定；蛋白質(zhì)、可溶性糖、總黃酮、花青素含量測(cè)定的具體操作步驟根據(jù)相應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.3 兒茶素類、嘌呤生物堿組分及含量的測(cè)定

1.3.3.1 樣品提取方法

參考劉慶帥等[17]的方法，分別稱取1.3.1 制備的樣品0.1 g（精確到0.000 1 g）于15 mL 離心管中，加入10 mL 70% 甲醇溶液，40 ℃下超聲30 min，期間每隔5 min 上下?lián)u勻5 次，將提取液在4 ℃冰箱靜置2 h 后取上清液過0.22μm 有機(jī)膜，加入液相瓶中待測(cè)。

1.3.3.2 色譜分析條件

參考吳世玲[18]的方法，色譜條件：UltiMate 3000 高效液相色譜儀；AcciaimTM120 C18 Column（4.6 mm×250 mm，5μm）柱；流速0.5 mL/min；柱溫35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；流動(dòng)相[A 相：水∶乙腈∶乙酸= 96.5∶3∶0.5（體積比）；B 相：水∶乙腈∶乙酸= 69.5∶30∶0.5（體積比）]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Statistics SPSS 26 軟件進(jìn)行單因素方差與主成分分析（principal com?ponent analysis，PCA），采用Origin 2021 軟件進(jìn)行相關(guān)性分析，利用聯(lián)川生物平臺(tái)（https：//www.omicstudio.cn/home）進(jìn)行聚類分析以及數(shù)據(jù)歸一化處理后繪制高級(jí)熱力圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同嫩度鮮葉主要滋味品質(zhì)成分單因素方差分析

可溶性糖、茶多酚、氨基酸、生物堿、兒茶素等滋味物質(zhì)含量隨茶樹品種、鮮葉嫩度及部位的不同而不同[19]。不同嫩度“紫脈龍韻”苦茶鮮葉（圖1）主要滋味品質(zhì)成分單因素方差分析結(jié)果如表1所示。

表1 不同嫩度鮮葉主要滋味品質(zhì)成分分析Table 1 Main taste quality ingredients in fresh leaves with different tenderness

圖1 不同嫩度苦茶鮮葉Fig.1 Fresh leaves of kucha with different tenderness

可溶性糖是茶湯甜味的主要成分，能緩解茶湯滋味的苦澀味，增加茶湯的厚味和協(xié)調(diào)性[20]。由表1 可知，可溶性糖含量隨著鮮葉嫩度的降低先升高后降低，一芽三葉中可溶性糖含量最高（211.92 mg/g）。蛋白質(zhì)對(duì)茶湯保持清亮起重要作用，在茶湯中呈膠體狀態(tài)。蛋白質(zhì)含量隨著鮮葉嫩度的降低先升高后降低，一芽二葉中蛋白質(zhì)含量最高（11.45 mg/g），一芽三葉至五葉中蛋白質(zhì)含量差異不顯著（P＞0.05）。游離氨基酸是以鮮味為主的物質(zhì)[21]，其含量隨著鮮葉嫩度的降低而降低，與Zhang 等[22]研究結(jié)果一致。一芽一葉中游離氨基酸含量最高（48.05 mg/g），與一芽二葉含量差異不顯著（P＞0.05），一芽三葉與一芽四葉含量差異同樣不顯著（P＞0.05）。茶多酚是茶湯滋味濃度和呈澀味的主體成分[19]，其含量隨著鮮葉嫩度的降低先升高后降低，一芽一葉與一芽二葉中茶多酚含量差異不顯著（P＞0.05）。花青素與黃酮類物質(zhì)是茶葉苦澀味的主要影響物質(zhì)[2，23]，兩者含量呈波動(dòng)性變化，在一芽四葉含量均較高。

兒茶素類成分是主要的多酚類物質(zhì)，約占茶多酚含量的75%～80%，根據(jù)分子結(jié)構(gòu)分為酯型兒茶素和非酯型兒茶素，影響茶葉的苦味、澀味[24]。非酯型兒茶素苦澀味較弱，先苦后甘，收斂性較弱，爽口。酯型兒茶素苦澀味較強(qiáng)，收斂性強(qiáng)，尤其是EGCG，對(duì)茶葉的苦澀起決定性的作用[2]。一般兒茶素組分構(gòu)成以酯型兒茶素為主，EGCG 和ECG 是主要的兒茶素類成分。不同嫩度“紫脈龍韻”苦茶鮮葉兒茶素類物質(zhì)以酯型兒茶素為主，隨著鮮葉嫩度的降低，酯型兒茶素、EGC 與EGCG 含量逐漸降低。不同嫩度鮮葉間，EGC 含量差異顯著，其他兒茶素成分含量呈波動(dòng)性變化。一芽二葉中非酯型兒茶素與兒茶素含量最高，且從一芽二葉至一芽五葉，兩者含量均降低，一芽四葉與一芽五葉之間含量差異不顯著。一芽一葉與一芽二葉中兒茶素總含量較高，且含量差異不顯著（P＞0.05），一芽三葉與一芽四葉中兒茶素總含量差異不顯著（P＞0.05），一芽五葉中含量最低。嘌呤生物堿是茶樹體內(nèi)主要次級(jí)代謝產(chǎn)物，主要包括CAF、TB、TP、TCR 及TMUA[25]，是茶葉中主要的苦味物質(zhì)，其組分構(gòu)成及含量影響茶葉品質(zhì)的優(yōu)劣及適制性[26]。在鮮葉中未檢測(cè)到TP，不同嫩度鮮葉間，TB、CAF 隨著鮮葉嫩度的降低而降低，不同鮮葉間含量差異顯著。TCR 含量相對(duì)穩(wěn)定，一芽一葉、一芽二葉、一芽三葉差異不顯著，其中，一芽三葉中含量最高（12.04 mg/g）。嘌呤生物堿總含量隨著鮮葉嫩度的降低而降低，一芽三葉與一芽四葉中含量差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 不同嫩度鮮葉主要滋味品質(zhì)成分聚類分析

為了直觀地展示22 種主要滋味物質(zhì)在不同嫩度鮮葉中含量變化趨勢(shì)，采用聚類分析（hierarchical clus?ter analysis ，HCA）[27]對(duì)成分指標(biāo)進(jìn)行高級(jí)熱圖分析，結(jié)果見圖2。

圖2 不同嫩度苦茶鮮葉主要滋味品質(zhì)成分分布熱圖Fig.2 Heat map of distribution of taste quality ingredients in fresh leaves of Kucha with different tenderness

由圖2 可知，一芽一葉中游離氨基酸與TB 含量較高，TMUA、EC、CG 含量較低。一芽二葉中非酯型兒茶素、蛋白質(zhì)、GC 與C 含量較高。一芽三葉中TCR 與可溶性糖含量較高，花青素含量最低，一芽四葉中花青素含量最高，一芽五葉中總黃酮含量最高，其他成分指標(biāo)含量較低。因此，可以將5 個(gè)嫩度鮮葉分為二大類，一芽一葉與一芽二葉屬于第一類，一芽三葉、一芽四葉、一芽五葉屬于第二類，分類結(jié)果較合理。Huang等[28]研究表明嫩葉中生化成分含量較高，成熟葉中含量較少，與本研究結(jié)果相似。研究結(jié)果可用于指導(dǎo)“紫脈龍韻”苦茶鮮葉的分級(jí)采摘。

2.3 不同嫩度鮮葉主要滋味品質(zhì)成分相關(guān)性分析

茶葉滋味品質(zhì)指標(biāo)之間并非獨(dú)立，而是具有一定相關(guān)性，相關(guān)性分析是衡量變量因素的相關(guān)密切程度。對(duì)不同嫩度鮮葉主要滋味品質(zhì)成分進(jìn)行相關(guān)性分析，可明確各指標(biāo)間的關(guān)系，為“紫脈龍韻”苦茶滋味品質(zhì)特征的形成提供理論依據(jù)。不同嫩度鮮葉主要滋味物質(zhì)的Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同嫩度鮮葉主要滋味品質(zhì)成分間的相關(guān)性Fig.3 Correlations of main taste quality ingredients in fresh leaves with different tenderness

由圖3 可知，不同嫩度鮮葉之間，酯型兒茶素、兒茶素、嘌呤生物堿含量均與游離氨基酸、CAF、EGC、EGCG、GCG、ECG 呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），且在這些成分中，游離氨基酸與茶多酚、CAF、EGCG、ECG 含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），CAF 與EGC、茶多酚與ECG、兒茶素與嘌呤生物堿含量均互呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)分別為0.99、0.96 和0.98。GC 與C 含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)為0.99。蛋白質(zhì)與GCG 呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)為0.97。TB 與EGC 含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），而與TMUA 含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)分別為0.96 和?0.99。由此說明，各成分指標(biāo)之間存在不同程度的相關(guān)性，品質(zhì)指標(biāo)之間的信息存在重疊。

2.4 不同嫩度鮮葉主要滋味物質(zhì)主成分分析（PCA）

不同品質(zhì)指標(biāo)存在不同程度差異，各品質(zhì)指標(biāo)間也存在不同程度相關(guān)性，使得滋味品質(zhì)評(píng)價(jià)結(jié)果會(huì)因信息重疊而不明確，通過單一指標(biāo)大小來評(píng)價(jià)不同鮮葉滋味品質(zhì)差異并不客觀。主成分分析（PCA）能有效減少變量的數(shù)量，發(fā)掘出有代表性的主成分因子，故采取該分析方法對(duì)滋味物質(zhì)作進(jìn)一步探究，結(jié)果如表2所示。

表2 主成分載荷矩陣、貢獻(xiàn)率和累積貢獻(xiàn)率Table 2 Factor loading，contribution，and cumulative propor?tion obtained by PCA

由表2 可知，前3 個(gè)成分累積貢獻(xiàn)率達(dá)96.546%，基本綜合原始數(shù)據(jù)的信息，說明這3 個(gè)成分能反映22 個(gè)指標(biāo)的絕大部分信息，故選取前3 個(gè)特征值進(jìn)行主成分分析。主成分1（PC1）的特征值為14.605，方差貢獻(xiàn)率為66.387%，貢獻(xiàn)較大的為蛋白質(zhì)、游離氨基酸、茶多酚、TB、TMUA、CAF、EGC、EGCG、GCG、ECG、酯型兒茶素、兒茶素及嘌呤生物堿，其中以EGC、EGCG 與酯型兒茶素的貢獻(xiàn)最大，載荷值均為0.997。主成分2（PC2）的特征值為4.875，方差貢獻(xiàn)率為22.157%，貢獻(xiàn)較大的為GC、C，載荷值分別為0.841、0.891。主成分3（PC3）的特征值為1.760，方差貢獻(xiàn)率為8.002%，貢獻(xiàn)最大為花青素，載荷值為0.643。PC1和PC2 累積貢獻(xiàn)率達(dá)88.544%，反映了“紫脈龍韻”鮮葉品質(zhì)的主要信息，因此，PC1 和PC2 的代表性成分指標(biāo)對(duì)鮮葉呈味品質(zhì)的影響起主要作用，結(jié)合這些代表性成分在不同嫩度鮮葉中的差異程度（表1），推測(cè)蛋白質(zhì)、游離氨基酸、茶多酚、TB、CAF、EGC、EGCG、GCG、ECG、GC 及C 是不同嫩度鮮葉間的關(guān)鍵差異成分。

以3 個(gè)主成分對(duì)應(yīng)的方差相對(duì)貢獻(xiàn)率為權(quán)重，將不同嫩度鮮葉主成分得分和相應(yīng)權(quán)重進(jìn)行線性加權(quán)求和，計(jì)算不同嫩度鮮葉的綜合評(píng)價(jià)得分，得分越高，表示該嫩度鮮葉相對(duì)滋味品質(zhì)越好。各主成分下的得分、綜合得分及綜合排名結(jié)果見表3。

由表3 可知，按綜合排序從高到低依次為一芽二葉＞一芽一葉＞一芽三葉＞一芽四葉＞一芽五葉。由此可見，一芽一葉與一芽二葉滋味品質(zhì)較佳，更適合用于高檔“紫脈龍韻”苦茶茶葉的制備。研究結(jié)果可為不同檔次“紫脈龍韻”苦茶茶葉加工原料的選擇提供參考。

2.5 不同部位嘌呤生物堿含量差異分析

不同部位“紫脈龍韻”苦茶嘌呤生物堿含量差異見圖4。

圖4 不同部位嘌呤生物堿組分與含量Fig.4 Composition and content of purine alkaloids in different parts of tea plants

如圖4所示，TB 含量中單芽最高（6.17 mg/g），隨著葉位增加，TB 含量逐漸降低，第三葉、第四葉、第五葉與莖中TB 含量差異不顯著，花與果皮中未檢測(cè)到。不同部位中TMUA 含量均較低，且含量變化不大。從單芽到第四葉，TCR 含量逐漸升高，最高達(dá)17.12 mg/g，且不同部位芽葉中TCR 含量差異顯著（P＜0.05）。單芽、莖、花及果皮4 個(gè)部位中TCR 含量差異不顯著，含量在5.16～6.22 mg/g。第一葉中CAF 含量最高（34.15 mg/g），從第一葉開始，隨著葉位增加，咖啡堿含量呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，且不同葉位間咖啡堿含量差異顯著（P＜0.05），與陳林等[29]研究結(jié)果基本一致。花與果皮部位中咖啡堿含量極低，特別是果皮部位，幾乎檢測(cè)不到咖啡堿。不同葉位間嘌呤生物堿總含量變化情況與咖啡堿相同。總體來說，苦茶堿與咖啡堿是“紫脈龍韻”苦茶主要嘌呤生物堿，且不同部位兩者含量差異較大，莖、花與果皮中嘌呤生物堿組分含量相對(duì)較低。

3 討論與結(jié)論

茶多酚、生物堿、兒茶素、花青素等成分含量、組成比例的不同是茶湯滋味強(qiáng)度差異形成的重要因素。本研究通過單因素方差分析研究“紫脈龍韻”苦茶不同嫩度鮮葉中主要滋味品質(zhì)成分含量，發(fā)現(xiàn)隨著鮮葉嫩度的降低，可溶性糖、蛋白質(zhì)與茶多酚含量先升高后降低，游離氨基酸、EGC、EGCG、酯型兒茶素與嘌呤生物堿總含量降低，總黃酮及花青素含量呈波動(dòng)性變化。相關(guān)性分析結(jié)果表明，各滋味品質(zhì)成分之間存在一定的相關(guān)性。聚類分析把不同嫩度鮮葉分為一芽一葉、一芽二葉和一芽三葉、一芽四葉、一芽五葉兩類，分類結(jié)果可用于指導(dǎo)“紫脈龍韻”苦茶鮮葉的分級(jí)采摘及加工。主成分分析得到3 個(gè)主成分，累積貢獻(xiàn)率達(dá)96.546%，結(jié)合單因素分析，推測(cè)蛋白質(zhì)、游離氨基酸、茶多酚、TB、CAF、EGC、EGCG、GCG、ECG、GC 及C 是不同嫩度鮮葉的關(guān)鍵差異成分。由不同嫩度鮮葉的綜合評(píng)價(jià)得分可知一芽一葉與一芽二葉滋味品質(zhì)較佳，研究結(jié)果可為不同檔次“紫脈龍韻”苦茶茶葉加工原料的選擇提供參考。

茶葉具有獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健功能，但其利用率極低，除采其嫩芽制作成商品茶外，茶樹其他部位（老葉、花及果皮）往往被廢棄，造成了資源極大浪費(fèi)。特別是特異茶樹品種，其老葉、花及果皮往往仍具有含量較高的功能成分。如果能將這些部位用于開發(fā)日用品、功能型飲品等深加工茶葉產(chǎn)品，可達(dá)到變廢為寶及提升茶產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)價(jià)值的作用。苦茶中苦茶堿含量相對(duì)較高，具有潛在的藥用價(jià)值。本研究通過檢測(cè)不同部位嘌呤生物堿含量，發(fā)現(xiàn)低葉位（嫩葉）中可可堿與咖啡堿含量較高，高葉位（成熟葉）具有高苦茶堿含量與低咖啡堿含量的特征，且果皮不含或僅含有極少量咖啡堿。由此可見，不同部位“紫脈龍韻”苦茶嘌呤生物堿組分分布及含量差異較大，可以根據(jù)需要選擇相應(yīng)的部位作為原料，進(jìn)行不同功能性產(chǎn)品的深加工，使“紫脈龍韻”苦茶除了嫩葉以外的其他部位得到充分利用，大幅度提升該品種的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。