疏花薔薇花總多酚提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性

郭瑛，趙文惠，李安林，馮倩倩，田莉，3*

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830011；2.新疆醫(yī)科大學(xué)中心實驗室，新疆烏魯木齊 830011；3.新疆名醫(yī)名方與特色方劑學(xué)重點實驗室，新疆烏魯木齊 830017）

疏花薔薇（RosalaxaRetz.）屬于薔薇科灌木植物，在新疆阿爾泰山區(qū)、額敏河谷平原、準(zhǔn)噶爾山區(qū)以及沿天山一帶廣泛分布，其多生于海拔500～1 200 m 的平原荒漠、礫質(zhì)河灘地、灌叢、戈壁荒地、鹽堿地、干溝邊或河谷旁[1]。疏花薔薇耐干旱、耐瘠薄、耐寒、抗病蟲、抗逆性強，其株型優(yōu)美，凈化空氣能力強，同時花開繁密、色白清雅，現(xiàn)為新疆一種主要的園林景觀灌木[2]。疏花薔薇的花蕾或初開的花可以作為茶飲，具有清熱解毒、活血、止痛等功效，可用于治療感冒、發(fā)燒、延緩衰老和癲癇發(fā)作[3]。目前，疏花薔薇花作為新疆特色植物資源尚未被有效開發(fā)利用。

多酚類化合物廣泛分布于自然界植物中，包括酚酸類、黃酮類、花色苷類等芳環(huán)上連有多個酚羥基的化合物，其所含酚羥基易與自由基發(fā)生反應(yīng)具有抗氧化作用[4]。鞣花酸是廣泛存在于植物中的一種天然多酚成分，具有良好的抗氧化特性，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥領(lǐng)域[4?6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，疏花薔薇花含有鞣花酸、沒食子酸、兒茶素等多酚成分，其中鞣花酸含量最高，目前，對疏花薔薇花的化學(xué)成分及藥效研究尚無文獻報道。本研究采用單因素試驗結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化疏花薔薇花總多酚的提取工藝，以疏花薔薇花總多酚、鞣花酸和浸膏得率的綜合評分為考察指標(biāo)，并評價其抗氧化活性，以期為該資源的開發(fā)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

疏花薔薇花：2022年6月采自于烏魯木齊市雅瑪里克山，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)徐海燕教授鑒定為薔薇科（Rosaceae）植物疏花薔薇（RosalaxaRetz.）的花，置于陰涼通風(fēng)處陰干。

鞣花酸、沒食子酸（純度＞98%）：成都曼思特公司；維生素C：成都市科龍化工試劑廠；1，1?二苯基?2?三硝基苯肼（1，1?diphenyl?2?picrylhydrazyl radical，DPPH）、2，2′?聯(lián)氮?雙?3?乙基苯并噻唑啉?6?磺酸[2，2′?azino?bis（3?ethylbenzothiazoline?6?sulfonic acid），ABTS]：上海麥克林生化科技有限公司；鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵：天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司；磷酸緩沖液：武漢賽維爾生物科技有限公司；無水乙醇：天津市致遠化學(xué)試劑有限公司；無水甲醇、甲酸（均為色譜純）：中國湖北弗頓科學(xué)技術(shù)有限公司。除特殊說明外，均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SL?200 高速多功能粉碎機：浙江省永康市松青五金廠；1200 高效液相色譜儀：美國安捷倫科技公司；722S可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；XS105電子天平：瑞士梅特勒?托利多儀器有限公司；KQ?5200DE數(shù)控超聲波清洗儀：昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 總多酚含量測定

疏花薔薇花經(jīng)高速多功能粉碎機粉碎，過80 目篩，制得疏花薔薇花粉末。參照文獻[7?8]的方法測定疏花薔薇花粉末中總多酚的含量。

1.3.2 鞣花酸含量測定

1.3.2.1 對照品溶液的制備

精密稱取鞣花酸對照品10.00 mg，加入甲醇溶解，稀釋至濃度為1.00 mg/mL 的鞣花酸對照品儲備液。

1.3.2.2 鞣花酸的色譜條件

色譜柱為ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為甲醇（A）?0.1% 甲酸水（B），等度洗脫：0～10 min，50%A；檢測波長：254 nm；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量為10μL。

1.3.2.3 線性考察

精密吸取1.3.2.1 項下鞣花酸對照品儲備液適量，用甲醇稀釋制成質(zhì)量濃度分別為5、10、25、50、75、100 μg/mL 的系列濃度溶液，按照1.3.2.2 項下條件測定，記錄峰面積。以鞣花酸的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2.4 精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性考察

取1.3.2.3 項下溶液，按照1.3.2.2 項下條件重復(fù)測定6 次，記錄峰面積，并計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）值，考察儀器的精密度。

稱取疏花薔薇花粉末約2.000 0 g，平行6 份，按照1.3.2.2 項下條件測定，記錄峰面積，并計算RSD 值，考察樣品的重復(fù)性。

取疏花薔薇花供試品溶液，按照1.3.2.2 項下條件分別在0、4、8、12、16、20、24 h 測定，記錄峰面積，并計算RSD 值，考察鞣花酸的穩(wěn)定性。

1.3.2.5 加樣回收率

精密稱取疏花薔薇花約2.000 0 g，平行6 份，加入一定量的鞣花酸，按照1.3.2.2 項下條件測定，計算加樣回收率。

1.3.3 供試樣品提取方法考察

精密稱取疏花薔薇花粉末約2.000 0 g，平行9 份，分為3 組，3 份/組，考察浸漬、超聲和回流3 種提取方法的提取效率。以50% 乙醇為提取溶劑，料液比1∶20（g/mL），分別按照浸漬提取12 h、超聲輔助提取60 min、回流提取60 min，提取液均過濾，續(xù)濾液蒸干，稱重；再分別稱取適量浸膏，用50%乙醇溶液復(fù)溶，分別按1.3.1 和1.3.2.2 項下方法測定總多酚和鞣花酸的含量，按下列公式計算浸膏得率和綜合評分。

p=m/M×100

C=（x/X）×0.4×100+（y/Y）×0.4×100+（p/P）×0.2×100

式中：p為浸膏得率，%；m為浸膏質(zhì)量，g；M為藥材質(zhì)量，g；C為綜合評分；x為總多酚含量，mg/g；X為最大總多酚含量，mg/g；y為鞣花酸含量，mg/g；Y為最大鞣花酸含量，mg/g；P為最大浸膏得率，%。

1.3.4 樣品回流次數(shù)的選擇

精密稱取疏花薔薇花粉末約2.000 0 g，平行12份，分為4 組，3 份/組，以50% 乙醇為回流提取溶劑，料液比1∶20（g/mL），回流提取60 min，分別回流提取1、2、3、4 次，所得提取液以總多酚含量、鞣花酸含量及浸膏得率的綜合評分為考察指標(biāo)，考察不同回流次數(shù)的提取效果。

1.3.5 疏花薔薇花總多酚提取工藝單因素試驗

以總多酚含量、鞣花酸含量及浸膏得率的綜合評分為指標(biāo)，分別考察回流時間（30、60、90、120、150 min）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（20%、35%、50%、65%、80%）、料液比[1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g/mL）]對綜合評分的影響[9?11]。

1.3.6 響應(yīng)面優(yōu)化疏花薔薇花總多酚提取工藝試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，確定響應(yīng)面的自變量范圍。精密稱取疏花薔薇花粉末約2.000 0 g，采用Box?Benhnken 試驗設(shè)計，以響應(yīng)面試驗優(yōu)化疏花薔薇花總多酚提取工藝參數(shù)[12?13]，因素水平見表1。

表1 試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of experiment

1.3.7 工藝驗證

精密稱取疏花薔薇花粉末約2.000 0 g，平行3 份，按1.3.6 項下提取優(yōu)化工藝參數(shù)進行工藝驗證，按照1.3.3項下公式計算綜合評分，并與模型擬合值進行比較。

1.3.8 疏花薔薇花總多酚提取物的抗氧化活性研究

精密稱取疏花薔薇花總多酚提取物和維生素C 適量，以55%乙醇溶解，分別制得0.002 0、0.006 0、0.010 0、0.020 0、0.050 0、0.100 0、0.200 0 mg/mL 系列濃度供試品溶液。

1.3.8.1 DPPH 自由基清除能力

分別精密量取0.1 mg/mL DPPH 溶液1.0 mL 和系列濃度供試品溶液1.0 mL，混勻，作為樣品溶液；取55% 乙醇1.0 mL 與系列濃度供試品溶液1.0 mL，混勻，作為自身對照溶液；取無水乙醇1.0 mL 與DPPH溶液1.0 mL，混勻，作為空白對照溶液。樣品溶液、自身對照溶液、空白對照溶液均常溫避光反應(yīng)30 min，在517 nm 波長處測定，吸光度依次為A1、A2、A0，均重復(fù)測定3 次，取平均值，并以相同濃度的VC作為陽性對照，計算DPPH 自由基清除率（X，%）[14]和IC50值，公式如下。

X=[A0-（A1-A2）]/A0×100

1.3.8.2 ABTS+自由基清除能力

精密量取7 mmol/L 的ABTS 溶液10 mL 和2.45 mmol/L 的K2S2O8溶液10 mL，混勻，室溫避光條件放置12 h，制得ABTS 母液；再用無水乙醇稀釋ABTS 母液直至其在734 nm 波長處的吸光度為0.70±0.02，制得ABTS 工作液。分別精密量取ABTS 工作液2 mL 與系列濃度供試品溶液0.15 mL，混勻，作為樣品溶液；取55% 乙醇2 mL 與和系列濃度供試品溶液0.15 mL，混勻，作為自身對照溶液；取ABTS 工作液2 mL 與無水乙醇0.15 mL，混勻，作為空白對照溶液。樣品溶液、自身對照溶液、空白對照溶液均常溫避光反應(yīng)15 min，在734 nm 波長處測定，吸光度依次為A1、A2、A0，均重復(fù)測定3 次，取平均值，并以相同濃度的VC作為陽性對照，計算ABTS+自由基清除率（Y，%）[15]和IC50值，公式如下。

Y=[A0-（A1-A2）]/A0×100

1.3.8.3 還原能力

分別量取系列濃度供試品溶液1.0 mL，依次加入磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH6.6）2.5 mL，1% 鐵氰化鉀溶液2.5 mL，混勻，50 ℃水浴20 min，加入10%三氯乙酸2.5 mL，5 000 r/min 離心5 min，取2.5 mL 上清液，依次加入3% 三氯化鐵溶液0.5 mL 和純水2.5 mL。在700 nm 波長處測定吸光度，重復(fù)測定3 次，取平均值，以相同濃度的VC溶液作為陽性對照，用吸光度表示還原力的大小[16]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Design Expert 13.0.1 分析數(shù)據(jù)，并對試驗結(jié)果進行多元回歸擬合。

2 結(jié)果與分析

2.1 總多酚含量的方法學(xué)考察

2.1.1 線性關(guān)系考察

以沒食子酸對照品溶液濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=110x+0.000 2（r=0.999 6），表明在1.5～7.5μg/mL 濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.2 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗和加樣回收率試驗

精密度測定的RSD 為0.20%，表明儀器精密度良好；穩(wěn)定性RSD 為1.34%，表明供試品溶液在1 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好；重復(fù)性RSD 為0.35%，表明方法的重復(fù)性良好；加樣回收率RSD 為2.07%，表明本檢測方法準(zhǔn)確。

2.2 鞣花酸含量的方法學(xué)考察

2.2.1 專屬性考察

在建立的色譜條件下，鞣花酸與相鄰色譜峰分離度大于1.5，對稱因子在0.95～1.05，理論塔板數(shù)不低于5 000，色譜圖見圖1。

2.2.2 線性關(guān)系考察

以鞣花酸對照品溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=14.92x-15.62（r=0.999 9），在5～100 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.3 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗

精密度RSD 為1.41%，結(jié)果表明儀器精密度良好；穩(wěn)定性RSD 為1.61%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定；重復(fù)性RSD 為3.48%，表明本法重復(fù)性符合要求。

2.2.4 加樣回收率試驗

鞣花酸加樣回收率的RSD 為2.32%，表明該檢測方法準(zhǔn)確，加樣回收率見表2。

表2 加樣回收率結(jié)果Table 2 Results of sample adding recovery

2.3 提取方法選擇

不同提取方法對提取綜合評分的影響見表3。

表3 提取方法測定Table 3 Extraction method determination

由表3 可知，回流提取法的綜合評分最高，因此采用回流提取法提取樣品。

2.4 回流次數(shù)選擇

不同回流次數(shù)對綜合評分的影響見表4。

表4 回流次數(shù)考察Table 4 Number of withdrawals examined

由表4 可知，為了綜合考慮能耗、試劑損耗以及工作時間，確定回流次數(shù)為2 次。

2.5 單因素試驗結(jié)果

各因素提取疏花薔薇花總多酚的綜合評分見圖2。

圖2 各因素提取疏花薔薇花總多酚的綜合評分Fig.2 Comprehensive score of total polyphenol extraction effi?ciency of Rosa laxa Retz.flowers

由圖2 可知，當(dāng)回流時間為30～90 min 時，綜合評分隨時間延長而持續(xù)增加，繼續(xù)延長回流時間，綜合評分隨時間延長明顯下降，回流提取90 min 時綜合評分最高[17]。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)從20%升至50%，綜合評分明顯上升，之后再增大乙醇體積分?jǐn)?shù)，綜合評分下降，乙醇體積分?jǐn)?shù)為50% 時綜合評分最高[18]。當(dāng)料液比從1∶15（g/mL）增大到1∶20（g/mL）時，綜合評分隨之增加，之后再增大料液比，其綜合評分緩慢降低[19]，確定料液比為1∶20（g/mL）時綜合評分最高。

2.6 響應(yīng)面試驗結(jié)果及分析

2.6.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果

疏花薔薇花提取工藝的響應(yīng)面試驗設(shè)計結(jié)果見表5。

表5 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 5 Experimental design and results of response surface method

2.6.2 模型擬合及方差分析

采用Box?Benhnken 13.0.1 軟件擬合各因素，根據(jù)已確立的模型，繪制各影響因素對綜合評分影響的3D響應(yīng)面及等高線，如圖3所示。響應(yīng)面回歸模型方差分析見表6。

圖3 各因素交互作用對綜合評分影響的響應(yīng)面圖Fig.3 Response surface diagram of the influence of each element interaction on comprehensive score

表6 響應(yīng)面回歸模型方差分析Table 6 Variance analysis of response surface regression model

所得二項式回歸模型為綜合評分=96.09-1.79×A+8.11B+2.64C-3.34AB-2.76AC+3.11BC-9.98A2-13.26B2-0.987 0C2，由方差分析結(jié)果和擬合后的二次多項回歸方程系數(shù)顯著性檢驗可知，模型一次項B極顯著（P＜0.01），C顯著（P＜0.05），A不顯著；二次項A2、B2極顯著（P＜0.01），C2不顯著；交互項AB、BC顯著（P＜0.05），AC不顯著。從F值可知單因素的影響順序B＞C＞A，即乙醇體積分?jǐn)?shù)＞回流時間＞料液比。

2.6.3 響應(yīng)面優(yōu)化預(yù)測

利用Design Expert 13.0.1 軟件，優(yōu)選疏花薔薇花總多酚提取各影響因素的最佳取值為乙醇體積分?jǐn)?shù)55.189%、料液比1∶23.849（g/mL）、回流提取88.881 min。為便于實際操作，調(diào)整提取工藝參數(shù)為乙醇體積分?jǐn)?shù)55%，料液比1∶25（g/mL），回流提取2 次，90 min/次。

2.6.4 3批樣品工藝驗證

疏花薔薇花總多酚提取結(jié)果顯示，浸膏得率為（51.36±0.78）%，總多酚含量為（141.36±2.07）mg/g，鞣花酸含量為（13.46±0.14）mg/g，綜合得分為98.56，RSD值為1.05%，與預(yù)測值99.76 的平均偏差為1.20%，表明驗證結(jié)果與預(yù)測值吻合良好。

2.7 抗氧化結(jié)果及分析

疏花薔薇花總多酚提取物對DPPH 自由基和ABTS+自由基的清除能力及還原能力如圖4所示。

圖4 疏花薔薇花總多酚提取物的抗氧化能力Fig.4 Antioxidant capacity of total polyphenol extracts from Rosa laxa Retz.flowers

由圖4A 可知，疏花薔薇花總多酚提取物濃度在0.002～0.05 mg/mL 時，隨著濃度增加，其對DPPH 自由基清除率明顯增加，呈較強的劑量依賴性[20?22]；當(dāng)濃度超過0.05 mg/mL 時，清除率增長趨勢變緩。疏花薔薇花總多酚提取物的DPPH 自由基清除能力略低于VC，兩者的IC50值分別為0.02 mg/mL 和0.01 mg/mL。

由圖4B 可知，疏花薔薇花總多酚提取物濃度在0.002～0.100 mg/mL 時，隨著濃度增加，其對ABTS+自由基的清除率明顯增加，呈較強的劑量依賴性，當(dāng)濃度超過0.100 mg/mL 時，清除率增長趨勢變緩[16]。疏花薔薇花總多酚提取物的ABTS+自由基清除能力略低于VC，兩者的IC50值分別為0.03 mg/mL 和0.02 mg/mL。

由圖4C 可知，隨著濃度增加，疏花薔薇花總多酚提取物的還原能力不斷增強，并呈明顯的劑量依賴性[23]。相同濃度下（0.04～0.16 mg/mL），VC的還原能力明顯高于疏花薔薇花總多酚提取物。

綜上所述，疏花薔薇花總多酚提取物的抗氧化能力存在明顯的劑量關(guān)系，與VC相比，具有較強的抗氧化活性。

3 結(jié)論

本研究在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化疏花薔薇花總多酚和鞣花酸的提取工藝條件，最終確定疏花薔薇花總多酚的最佳提取工藝參數(shù)為回流提取2 次、每次90 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)為55%、料液比為1∶25（g/mL），同時在最優(yōu)工藝的下進行了3 次工藝驗證，浸膏得率為（51.36±0.78）%、總多酚含量為（141.36±2.07）mg/g、鞣花酸含量為（13.46±0.14）mg/g，綜合評分為為98.56。疏花薔薇花對DPPH 自由基和ABTS+自由基清除率最高值分別為92.06% 和98.65%，還原能力較強。結(jié)果表明，疏花薔薇花具有較好的體外抗氧化活性，具有重要的食用價值。