枯草芽孢桿菌DC?1產維生素K2的發酵條件優化

黃友美，曹盛，孫一斐，李詩敏，夏雪雪，袁干軍*

（1.江西農業大學生物技術藥物研發工程中心，江西南昌 330045；2.江西農業大學生物科學與工程學院，江西南昌 330045）

維生素K2又稱為甲基萘醌（menaquinone，MK），是甲基萘醌母環和3 號位上可變側鏈異戊二烯相連所產生的一系列同系物的總稱，用MK?n（n=1～14）表示，n為側鏈異戊二烯數目[1]。維生素K2是人體所必需的一類重要的脂溶性維生素，研究表明其在骨質疏松、心血管疾病、神經系統疾病、癌癥等疾病的治療方面發揮著重要作用[2?6]。近年來，維生素K2的安全性和可靠性已經得到各國權威機構的認證。2001年日本首先批準了維生素K2作為治療骨質疏松的藥物[7]，2008年美國批準維生素K2作為食品和強化食品添加劑，2009年歐洲食品安全局允許將維生素K2添加到食品中[8]，2016年我國開始允許維生素K2作為食品營養強化劑添加到兒童和孕產婦用的調制乳粉中[9]。維生素K2的來源包括從動物、植物或食品中提取，化學合成和微生物生產。由于天然來源的維生素K2含量很低，化學合成法已被用于維生素K2的工業化生產，但其存在產物活性低、易產生副產物以及污染環境等缺點[10]。相對而言，微生物發酵生產維生素K2具有發酵原料易得、成本低、反應溫和以及產物半衰期更長等優勢[11]，因此利用微生物發酵法生產維生素K2具有廣闊的應用前景。

研究發現不同菌株能產生不同類型的維生素K2。一些腸道細菌如乳酸菌能產MK?5～MK?10 的MK 同系物[12]；枯草芽孢桿菌能產MK?4～MK?8 的MK 同系物，其中MK?7 占大多數[13]；黃桿菌屬主要產MK?4 和MK?6[14?15]。同時，一些新菌株也被發現能夠合成MK系列化合物，如MK?8、MK?9、MK?10[16?18]。目前，研究發現的所有維生素K2產生菌中，芽孢桿菌由于具有較長的安全使用歷史和高產MK?7 能力，被認為是微生物發酵生產維生素K2的潛在菌株。在MK 同系物中，MK?7 由于在血液中半衰期較長且生物利用度高，是目前研究最多的維生素K2形式[19]。研究發現不同類型的維生素K2同系物的生理活性和生物利用度存在差異[20]，因此獲得維生素K2一系列同系物并探索其藥理活性和構效關系可為利用維生素K2精準治療疾病提供理論依據。目前大多數研究集中在優化維生素K2產生菌的發酵條件以提高MK?7 產量。Berenjian 等[21]優化納豆芽孢桿菌發酵條件后MK?7 最大濃度可達到（62.32±0.34）mg/L。湯貴祥等[22]優化解淀粉芽孢桿菌發酵條件后該菌株合成MK?7 的最高產量達到70 mg/L以上。目前尚無通過優化發酵條件以增加微生物產維生素K2同系物多樣性相關研究。

前期建立了高效液相色譜?紫外（high performance liquid chromatography?ultraviolet，HPLC?UV）篩選法篩選得到一株維生素K2產生菌枯草芽孢桿菌DC?1 且能分析產MK 同系物種類[23?24]。在此基礎上，本研究首先通過單因素試驗考察培養基組分對枯草芽孢桿菌DC?1 產MK 多樣性和MK?7 產量的影響，進行Plackett?Burman（PB）試驗篩選顯著影響因素，再以MK?7 產量為響應值，利用響應面試驗設計確定最佳產維生素K2發酵條件，旨在為微生物發酵法合成維生素K2的工業化生產提供參考意義以及探索維生素K2同系物的生理功能和構效關系提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

枯草芽孢桿菌DC?1 由江西農業大學生物科學與工程學院生物技術藥物研發工程中心前期分離、篩選、鑒定并保藏，GeneBank 序列ID 為MG266437.1。

1.1.2 試劑及培養基

維生素K3（MK?0）標準品（≥99.8%）：默克化工技術（上海）有限公司；甲醇（色譜純）：西隴化工股份有限公司；異丙醇（色譜純）：德國SIMARK 公司；正己烷（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；葡萄糖、玉米漿、葡萄糖糖蜜、黃豆粉、甘油、蛋白胨、MgSO4·7H2O、KH2PO4、K2HPO4·3H2O、NaCl（均為分析純）：北京奧博星生物技術有限公司。

種子培養基：葡萄糖15 g、蛋白胨15 g、MgSO4·7H2O 2.5 g、KH2PO41 g、K2HPO4·3H2O 2.5 g，水1 000 mL、pH7.0～7.2。

初始發酵培養基：葡萄糖15 g、黃豆粉40 g、K2HPO4·3H2O 0.5 g、KH2PO41 g、NaCl 3 g，水1 000 mL、pH7.0～7.2。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜儀（Waters e2695）、檢測器（2998e?PDA）：美國Waters 公司；C18 高效色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）：大連依利特分析儀器有限公司；真空冷凍干燥機（SCIENTZ?10）：寧波新芝生物科技股份有限公司；質譜儀（TripleToF 5600?1）：美國AB SCIEX 公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化與培養

將保藏的菌種接到種子培養基中，在37 ℃、110 r/min 條件下培養24 h 作為種子液。并以1% 的接種量接種到發酵培養基中，于pH7.0、37 ℃條件下靜置培養3 d。

1.3.2 維生素K2標準曲線的繪制

參考文獻[24]的方法測定，在避光的條件下，稱取恒重的MK?0 標準品，置于10 mL 容量瓶中，用流動相甲醇∶異丙醇（4∶1，體積比）溶解、定容。試驗前搖勻后，過0.45μm 濾膜，所得濾液作為標準品儲備液。再用流動相將儲備液稀釋成濃度梯度為1、2、3、4、5、6、7 mg/L的標準曲線工作液，采用高效液相色譜儀在248 nm 波長處檢測峰面積。以MK?0 標準品的濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.3 維生素K2的提取與測定

菌株DC?1 的發酵培養物以4 000 r/min 的轉速離心10 min，收集菌體和菌液。菌體-18 ℃冷凍過夜，然后將冷凍干燥所得菌體研磨成粉末。稱取0.1 g 菌體加入萃取液A[甲醇∶異丙醇溶液（4∶1，體積比）]2 mL，渦旋振蕩1 min，超聲15 min，靜置過夜。將萃取液B[正己烷∶異丙醇溶液（2∶1，體積比）]加入到菌液中（4∶1，體積比），靜置過夜，收集上層液體（正己烷層），合并萃取液A 和萃取液B，40 ℃下減壓干燥，得到黃色油狀液體，于2 mL 容量瓶中用流動相定容，過0.45μm 微孔濾膜后作為樣品供試液，采用HPLC?UV法進行含量測定，整個過程在避光條件下完成。HPLC 條件為流動相：甲醇∶異丙醇=4∶1（體積比）；流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL；檢測波長：248 nm。采用外標法，利用樣品中維生素K2的色譜峰面積計算含量。

1.3.4 維生素K2多樣性分析

根據課題組前期建立的HPLC?UV 篩選MK 產生菌法[18]獲取色譜峰的紫外吸收曲線，分析MK 類似物的種類。

1.3.5 產物液相色譜?質譜聯用（liquid chromatograph mass spectrometer，LC?MS）驗證

收集高效液相中分離的MK 類似物的產物，使用高分辨率質譜分析產物結構。LC?MS 質譜條件：碰撞能量35 V，離子源溫度500 ℃，DuoSpray 離子源，陽離子模式，起始質量50 Da，最終質量1 250 Da。

1.3.6 發酵條件的優化

1.3.6.1 碳源優化

在初始發酵培養基的基礎上，以添加3 g 碳源進行優化試驗，分別選取甘油、葡萄糖、糖蜜、甘油+葡萄糖（1∶1，質量比）、糖蜜+甘油（1∶1，質量比）、葡萄糖+糖蜜（1∶1，質量比）、葡萄糖+糖蜜+甘油（1∶1∶1，質量比）7 組碳源進行單因素試驗，其余發酵條件保持不變。使用高效液相色譜分析MK 類似物種類并按照1.3.3 所述方法測定MK?7 的產量。

1.3.6.2 氮源優化

在初始發酵培養基的基礎上，以添加3 g 氮源進行優化試驗，分別選取玉米漿、蛋白胨、黃豆粉、蛋白胨+黃豆粉（1∶1，質量比）、玉米漿+黃豆粉（1∶1，質量比）、蛋白胨+玉米漿（1∶1，質量比）、蛋白胨+玉米漿+黃豆粉（1∶1∶1，質量比）7 組氮源進行單因素試驗，其余發酵條件保持不變。使用高效液相色譜分析MK 類似物種類并按照1.3.3 所述方法測定MK?7 的產量。

1.3.6.3 無機鹽優化

在添加最優碳源和氮源條件下，對發酵培養基中KH2PO4、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、NaCl 4 種無機鹽濃度進行優化，4 種無機鹽的濃度梯度均設置為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 g/100 mL，按照1.3.3 所述方法測定MK?7 的產量。

1.3.7 Plackett?Burman 試驗設計

根據單因素試驗結果，以MK?7 產量為響應值，對甘油、糖蜜、蛋白胨、黃豆粉和玉米漿添加量5 個影響因素進行評價，篩選出主效應因子，每個因素取最低（-1）和最高（1）兩個水平，共12 組試驗。試驗因素和水平取值見表1。

表1 Plackett?Burman 試驗設計的因素水平Table 1 Factors and levels of Plackett?Burman experimental design

1.3.8 響應面試驗

通過Plackett?Burman 設計篩選主效應因子，使用Design?Expert 軟件進行Box?Behnken 中心組合設計試驗，采用三因素三水平響應面法進行優化，以甘油添加量、糖蜜添加量和黃豆粉添加量為自變量，MK?7 產量為響應值。試驗設計因素及水平見表2。

表2 Box?Behnken 試驗設計因素和水平Table 2 Factors and levels of Box?Behnken experimental design

1.4 數據處理

每組試驗重復3 次，數據以平均值±標準差表示，單因素試驗使用Origin 8.5 軟件作圖，Plackett?Burman 試驗和響應面試驗采用Design?Expert 11 進行數據處理分析。

2 結果與分析

2.1 維生素K2 定量與定性檢測

以MK?0 標準品的濃度為橫坐標，在248 nm 波長下對應峰面積為縱坐標得到相關線性方程為y=133 066.8x+11 302.4（r=0.999 8）。依據維生素K2結構特征，以MK?0 標準曲線為基礎，乘以校正因子即相對分子質量的比值[25]，得到MK?7 標準曲線為y=（133 066.8x+11 302.4）×（648.490 6/172.052 4）（r=0.999 8），該線性方程可用來計算樣品中MK?7 的濃度。

DC?1 菌株發酵液中初步確定為MK 類似物的色譜峰分析驗證結果如圖1所示。

圖1 產物MK?7 質譜圖Fig.1 Mass spectrum of product MK?7

由圖1 可知，正離子模式下特征峰分子量為649.501 9，與正離子下MK?7 相對分子質量一致，可確定其為MK?7。

2.2 發酵條件的優化

2.2.1 碳源對枯草芽孢桿菌DC?1 合成MK 的影響

葡萄糖、糖蜜、甘油及混合碳源（甘油+葡萄糖、糖蜜+甘油、葡萄糖+糖蜜、葡萄糖+糖蜜+甘油）對MK?7產量和MK 多樣性的影響如圖2所示。

圖2 碳源對DC?1 合成MK 影響Fig.2 Effect of carbon source on MK synthesis by DC?1

研究表明，甘油是合成MK?7 的最優碳源[13，26?27]，但由圖2（A）可知，使用糖蜜+甘油（1∶1，質量比）作為混合碳源時，最有利于MK?7 的積累。由圖2（B）可知，糖蜜作為碳源時，可以增加菌株DC?1 產MK 類似物的種類至5 種。糖蜜作為制糖業的副產品，含有大量的可發酵糖且成分復雜，可為微生物生長提供豐富的營養成分，這可能是它作為碳源增加DC?1 產MK 類似物的種類的原因，且其價格便宜，是適合微生物生長的良好碳源[28]。從MK?7 產量、MK 多樣性以及成本方面綜合考慮，選用糖蜜+甘油的組合作為菌株發酵的碳源。

2.2.2 氮源對枯草芽孢桿菌DC?1 合成MK 的影響

蛋白胨、玉米漿、黃豆粉及混合氮源（蛋白胨+黃豆粉、玉米漿+黃豆粉、蛋白胨+玉米漿、蛋白胨+玉米漿+黃豆粉）對MK?7 產量和MK 多樣性的影響如圖3所示。

圖3 氮源對DC?1 合成MK 影響Fig.3 Effect of nitrogen source on MK synthesis by DC?1

由圖3（A）可知，蛋白胨作為氮源時MK?7 產量最高，這與Berenjian 等[21]的研究結果一致。當使用玉米漿+黃豆粉+蛋白胨（1∶1∶1，質量比）組合氮源時，MK?7產量略低于單獨使用蛋白胨；由圖3（B）可知，黃豆粉作為氮源時可以增加菌株DC?1 產MK 類似物的種類。玉米漿含有較為豐富的可溶性蛋白質且成本較為廉價，是適合微生物生長的良好氮源之一[29]。大豆粉不僅含有豐富的蛋白質和糖類，還含有磷、鈣、鎂和其他微量元素[30]，這可能是它作為氮源能增加菌株DC?1 產MK 類似物的種類的原因。從MK?7 產量、MK 多樣性以及成本方面綜合考慮，選用玉米漿+黃豆粉+蛋白胨的組合作為氮源。

2.2.3 無機鹽濃度優化

無機鹽在微生物的生長和次級代謝產物的合成中起到重要作用。NaCl 能維持菌體生長的滲透壓，KH2PO4、K2HPO4·3H2O 在培養基中起緩沖劑調節pH值的作用，Mg2+可能在異戊二烯側鏈和萘醌母環的連接起到穩定作用，故選取KH2PO4、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O 和NaCl 4 種對菌株產MK 有較大影響的無機鹽考察其對MK?7 合成的影響，結果如圖4所示。

圖4 無機鹽添加量對MK?7 產量的影響Fig.4 Effect of inorganic salt addition on MK?7 yield

由圖4 可知，4 種無機鹽均對MK?7 的合成具有一定影響，最優添加濃度分別為KH2PO40.3 g/100 mL、K2HPO4·3H2O 0.8 g/100 mL、MgSO4·7H2O 0.7 g/100 mL、NaCl 0.5 g/100 mL。當無機鹽濃度超過一定范圍后，菌體產MK?7 能力出現下降，這與之前文獻報道無機鹽對微生物生長的影響一致[31?32]。無機鹽對于微生物的生長和合成次級代謝產物具有重要影響，一般是無機鹽在濃度較低時對菌體生長有促進作用，在較高濃度時會抑制菌體生長。

2.3 Plackett?Burman 試驗設計

Plackett?Burman 試驗設計及結果見表3，方差分析結果見表4。

表3 Plackett?Burman 試驗設計與結果Table 3 Plackett?Burman experimental design and results

表4 Plackett?Burman 試驗設計方差分析Table 4 Variance analysis of Plackett?Burman experimental design

由表4 可知，影響MK?7 產量的關鍵因素重要性排序依次為甘油添加量（A）＞蛋白胨添加量（C）＞玉米漿添加量（E）＞糖蜜添加量（B）＞黃豆粉添加量（D），其中甘油添加量（A）對MK?7 產量的影響達到極顯著水平（P＜0.01）。

2.4 響應面優化試驗

2.4.1 響應面試驗設計及結果

綜合考慮PB 試驗結果和單因素試驗對DC?1 產MK 多樣性的影響，選擇甘油添加量（A）、糖蜜添加量（B）和黃豆粉添加量（C）3 個關鍵因素進行響應面優化設計和分析。Box?Behnken 試驗設計及結果見表5。

表5 Box?Behnken 試驗設計及結果Table 5 Box?Behnken experimental design and results

2.4.2 結果分析

利用Design?Expert 軟件對表5 數據進行多元回歸擬合分析，得到MK?7 產量為響應值的回歸方程：Y=95.33+1.51A+1.24B+1.03C+0.5175AB+2.43AC+2.89BC-7.72A2-5.63B2-3.76C2。對回歸方程進行方差分析，結果見表6。

表6 回歸方程的方差分析結果Table 6 Variance analysis results of regression equation

由表6 可知，回歸模型中二次項A2、B2對MK?7 產量影響極顯著（P＜0.01），二次項C2和交互項BC對MK?7 產量影響顯著（P＜0.05），其余項不顯著。對菌株DC?1 產MK?7 能力的影響大小順序為甘油添加量＞糖蜜添加量＞黃豆粉添加量。該回歸模型的P＜0.05，方程模型顯著，失擬項P=0.109 2，不顯著；模型的R2=0.944 0，R2Adj=0.872 0，變異系數=2.56%，以上參數說明該模型擬合程度較好，試驗誤差較小，該模型可用于本次試驗。

2.4.3 響應曲面分析

根據回歸方程繪制甘油添加量（A）、糖蜜添加量（B）、黃豆粉添加量（C）交互作用的響應曲面如圖5所示。

圖5 甘油、糖蜜、黃豆粉添加量的交互作用對MK?7 產量影響的響應曲面Fig.5 Response surface of interaction among glycerol，molasses，and soybean flour on MK?7 yield

由圖5 和方差分析結果可知，糖蜜添加量和黃豆粉添加量的交互作用對MK?7 產量的影響顯著，甘油和糖蜜、甘油和黃豆粉對MK?7 產量的影響不顯著。數學模型分析得到菌株DC?1 產MK?7 的最優發酵條件為甘油添加量36.43 g/L、糖蜜添加量31.82 g/L、黃豆粉添加量32.54 g/L，理論響應值為95.685 mg/L。結合實際操作的便利性，對上述優化結果處理后確定最優發酵條件：甘油添加量36.5 g/L、糖蜜添加量31.8 g/L、黃豆粉添加量32.5 g/L。

2.4.4 驗證試驗結果

在最優發酵條件下重復3 次獨立試驗以驗證預測值，MK?7 產量的平均值為94.66 mg/L，與理論響應值（95.685 mg/L）相差較小，說明通過響應面優化后的發酵條件參數可靠，具有一定的實踐指導價值。與優化前相比，MK?7 的最終產量提高了48.04%，且在該發酵條件下經HPLC?MS 鑒定DC?1 能同時產5 種維生素K2同系物。

3 結論

本研究采用單因素試驗和Plackett?Burman 試驗設計，篩選得到甘油、糖蜜和黃豆粉添加量這3 個影響菌株DC?1產維生素K2的關鍵因素。再利用Box?Behnken 試驗設計得到最優發酵條件為甘油添加量36.5 g/L、糖蜜添加量31.8 g/L、黃豆粉添加量32.5 g/L、KH2PO4濃度0.3 g/100 mL、K2HPO4·3H2O 濃度0.8 g/100 mL、MgSO4·7H2O 濃度0.7 g/100 mL、NaCl 濃度0.5 g/100 mL，在pH7.0，溫度37 ℃下靜置培養。在此條件下MK?7 產量為94.66 mg/L，較原始發酵條件提高了48.04%，實際值與響應面預測值吻合良好。同時在該發酵條件下菌株DC?1產維生素K2的多樣性增加，能同時產5 種維生素K2同系物，經HPLC?MS 鑒定為MK?2、MK?3、MK?4 和MK?7，而其中一個類似物由于極不穩定或其他原因，未能在高分辨率質譜中找到，根據保留時間推測其為MK?5 或MK?6。本研究為后續微生物發酵法合成維生素K2的工業化生產奠定基礎，并為研究維生素K2一系列同系物的藥理活性和構效關系提供化合物來源。